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Étude biochimique d’ABHD5 dans le syndrome de Dorfman-Chanarin et en condition physiologique / Biochemical Study of ABHD5 in the Dorfman-Chanarin Syndrome and in Hysiological ConditionRoussel, Benjamin 07 October 2016 (has links)
ABHD5 est mutée dans le syndrome de Dorfman-Chanarin (SDC), maladie de surcharge comportant une ichtyose liée à une acanthose et une hyperkératose orthokératosique, ainsi que des vacuoles lipidiques intrakératinocytaires et des corps lamellaires anormaux. Les mécanismes de l’ichtyose sont mal compris. Certaines ichtyoses étant associées à une anomalie des céramides, nous les avons analysés chez 7 patients. Nous avons identifié 4 mutations différentes, dont 2 nouvelles, 1 faux sens et 1 délétion large de 15,9kb. Chez tous les patients, certains céramides épidermiques étaient très diminués mais l’expression des enzymes impliquées dans leur synthèse était peu modifiée. ABHD5 pouvant intervenir indirectement sur ces céramides, nous avons recherché des partenaires d’ABHD5 et identifié les périlipines 1, 2 et 3 (PLIN3). PLIN3 est un nouveau partenaire d’ABHD5, impliquée dans le transport des endosomes via Rab9. La proximité entre ABHD5 et PLIN3 a été démontrée par PLA (test de proximité protéique) dans l’épiderme humain et PLIN3 était peu exprimée dans l’épiderme du SDC. Ces données suggèrent que l’ichtyose du SDC ferait intervenir un défaut dans le trafic des corps lamellaires. Nous avons identifié de nouveaux transcrits alternatifs d’ABHD5, 1 chez la souris (absence d’exon 2) et 4 chez l’Homme (absence des exons 6, 5, début de l’exon 6, 5 et 6). En western blot, la forme complète d’ABHD5 a été retrouvée, ainsi que des bandes accessoires dans des extraits d’épiderme et d’hypoderme humains. Certaines de ces bandes avaient un poids moléculaire compatible avec celui prédit pour les isoformes protéiques. Mais, ni ces isoformes, ni la forme complète d’ABHD5 n’ont été identifiées par spectrométrie de masse. / ABHD5 is a lipase activator whose mutations induce triacylglycerol accumulation called Dorfman–Chanarin syndrome (DCS). DCS is characterized by ichthyosiform erythroderma resulting from acanthosis and orthokeratotic hyperkeratosis. Ultrastructural findings include lipid droplets in basal and granular layers and abnormal lamellar bodies. The ichthyosis pathomechanism is unclear. Because some ichthyoses are associated with defective ceramide syntheses, we examined ceramides in 7 DCS patients. ABHD5 genetic analysis identified 4 different mutations, including 2 original, 1 missense and 1 large deletion. Epidermal ceramides were very low in all DCS patients but expression of ceramide genesis-related enzymes was minimally changed. Because ABHD5 might act indirectly on ceramides, we tried to identify ABHD5 partners. Three interactors were detected : perilipin-1, -2 and -3 (PLIN3) ; the latter is a new partner and involved in endosome transport through Rab9. PLA (protein proximity assay) demonstrated PLIN3’s physical closeness to ABHD5 in epidermis and PLIN3 was weakly expressed in DCS epidermis. These findings suggest that DCS-ichthyosis is linked to a trafficking defect of lamellar granules. Then we identified new ABHD5 alternative transcripts, 1 in mice (absence of exon 2) and 4 in human (absence of exon 6, 5, beginning of 6, 5 and 6). The full length ABHD5 and accessory bands were shown by western blot using human epidermis and fat extracts. The molecular weight of some of these bands was compatible with the predicted molecular weight of the isoforms encoded by these alternative transcripts. However, we were unable to identify these isoforms, nor the full length ABHD5 by mass spectrometry.
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ROBO4 dans les cellules métastatiques du cancer du sein : identification et caractérisation fonctionnelle d’isoformes protéiques / ROBO4 in metastatic breast cancer cells : identification and functional characterization of protein isoformsLe Pape, François 05 December 2017 (has links)
Les métastases osseuses sont des complications fréquentes de nombreux cancers tels que le cancer du poumon, de la prostate et du sein. Chez la femme, 70% des patientes présentant un cancer du sein avancé développent des métastases qualifiées d’ostéolytiques. Le développement de ce type de métastases entraine la destruction massive de l’os causant chez les patientes des fractures pathologiques. Les traitements actuellement dispensés en clinique tels que les bisphosphonates et le dénosumab (anti-RANKL) ne sont pas curatifs mais seulement palliatifs. Pour cette raison, notre laboratoire s’intéresse particulièrement aux évènements moléculaires et cellulaires précoces aboutissant à l’émergence de métastases osseuses. Les récepteurs Roundabout (ROBO) ont été initialement décrits comme des régulateurs cruciaux de la migration neuronale et vasculaire lors du développement. ROBO4 est le dernier récepteur décrit et diverge des autres récepteurs ROBO, notamment par son expression spécifique et limitée aux cellules endothéliales et hématopoïétiques. Toutefois, lors d’une analyse transcriptomique comparative le récepteur ROBO4 a été retrouvé surexprimé dans la lignée tumorale ostéotropique MDA-B02. Les récentes expériences, réalisées par notre équipe, visant à inhiber l’activité du récepteur ROBO4, nous ont permis de considérer le récepteur ROBO4 comme un médiateur de l’ancrage à l’os des cellules tumorales MDA-B02. En effet, L’utilisation d’un anticorps anti-ROBO4 réduit considérablement l'adhérence des cellules MDA-B02 sur les cellules ostéoblastiques MC3T3-E1 in vitro et l’ancrage à l’os in vivo. La surexpression de ROBO4 dans un modèle cellulaire de cancer du sein murin nous a conduit à mettre en évidence la présence de deux formes de la protéine ROBO4 aux propriétés antagonistes : (i) une forme glycosylée détectée exclusivement dans les cellules endothéliales et (ii) une forme non glycosylée, issue d’un transcrit alternatif et présente en forte quantité dans les cellules tumorales MDA-B02. L’identification d’un variant protéique du récepteur ROBO4 aux propriétés fonctionnelles et structurales différentes nous a permis d’envisager de nouvelles pistes dans le décryptage des fonctions de ROBO4 dans le processus tumoral et pourrait conduire à la mise au point de thérapies innovantes pour empêcher la formation de métastases dans la moelle osseuse / Bone metastases are frequent complications of many cancers such as lung, prostate and breast cancer. In women, 70% of patients with advanced breast cancer develop metastases known as osteolytic. The development of this type of metastasis leads to the mass destruction of bone causing pathological fractures in patients. Current clinical treatments such as bisphosphonates and denosumab (anti-RANKL) only slow the progression of the disease. For this reason, our laboratory is particularly interested in early molecular and cellular events leading to the emergence of bone metastases. Roundabout receptors (ROBO) were initially described as crucial regulators of neuronal and vascular migration during development. ROBO4 is the last receptor described and diverges from other ROBO receptors, in particular by its specific expression and limited to endothelial and hematopoietic cells. However, in a comparative transcriptomic analysis, the ROBO4 receptor was found to be overexpressed in the MDA-B02 osteotropic tumor line. Recent experiments carried out by our team, aiming at inhibiting the activity of the ROBO4 receptor, allowed us to consider the ROBO4 receptor as a mediator of MDA-B02 tumor cells anchorage to the bone. Indeed, the use of an anti-ROBO4 antibody considerably reduces the adhesion of the MDA-B02 cells to the MC3T3-E1 osteoblastic cells in vitro and the anchoring to the bone in vivo. Overexpression of ROBO4 in a murine breast cancer cell model led us to demonstrate the presence of two forms of the ROBO4 protein with antagonistic properties: (i) a glycosylated form detected exclusively in endothelial cells and (ii) one unglycosylated form derived from an alternative transcript and present in high amounts in MDA-B02 tumor cells. The identification of a protein variant of the ROBO4 receptor with different functional and structural properties has allowed us to consider new opportunities in decoding the functions of ROBO4 in the tumor process and could lead to the development of innovative therapies to prevent the formation of metastases in the bone marrow
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Etudes de gènes des chromosomes sexuels au cours de la spermatogenèse chez l'homme et la souris et implication dans la fertilite masculineDecarpentrie, Fanny 08 July 2011 (has links)
Les chromosomes sexuels subissent pendant la spermatogenèse de multiples modifications qui entrainent d’importantes variations dans le niveau d’expression des gènes qu’ils portent. Notamment, ils sont inactivés au cours de la méiose et la majorité reste réprimé tout au long de la spermiogenèse. Cette étude met en évidence l’existence de transcrits alternatifs particuliers de gènes sur le chromosome X et Y, dont les profils d’expressions témoignent de leur rôle au cours de ces deux phases de la spermatogenèse. Sur le chromosome X nous avons isolé, chez l’homme et chez la souris, trois gènes ubiquitaires (Uba1x, Prdx4, Atp11c) réactivés dans les spermatides via un transcrit alternatif exprimé de façon majoritaire dans les testicules. Le gène Prdx4 code, pour deux isoformes de protéines différentes par leur domaine N-terminal. Nous avons mis au point des anticorps spécifiques de chaque isoforme et nous avons démontré que, chez la souris, le transcrit réactivé est traduit dans les spermatides et produit une protéine dans un compartiment cellulaire distinct de l’autre isofome ubiquitaire. Un total de cinq mutations, affectant ces transcrits exprimés dans les spermatides, ont été retrouvées dans les gènes UBA1X et PRDX4 chez des hommes infertiles. Sur le chromosome Y chez la souris, nous avons étudié les gènes Zfy1 et Zfy2, deux homologues testicules spécifiques codant pour des protéines à doigt de zinc avec un long domaine d’activation. Zfy2, mais pas Zfy1, promeut l’élimination apoptotique des spermatocytes contenant un chromosome X univalent. Nous avons identifié un transcrit alternatif du gène testicule spécifique Zfy1 exprimé dans les spermatocytes et les spermatides. La protéine putative issue de ce transcrit, possédant un domaine acidique réduit de moitié qui pourrait être à l’origine des différences fonctionnelles entre les gènes homologues Zfy1 et Zfy2 au cours de la méiose murine. Chez l’homme, l’orthologue de ces gènes ZFY est ubiquitaire et nous avons montré qu’il produisait un transcrit alternatif testicule spécifique, codant une protéine avec le même domaine acidique raccourci que Zfy1. Nos données indiquent que ce transcrit alternatif est prédominant dans les spermatocytes et les spermatides chez l’homme et chez la souris. Ces résultats apportent la première évidence d’une fonction du gène ZFY au cours de la spermatogenèse chez l’homme et de son implication possible dans la fertilité masculine. / Sex chromosomes undergo many modifications during spermatogenesis, leading to dramatic variations in the expression levels of their genes. In particular, they are inactivated during meiosis with most genes remain silent throughout spermiogenesis. Our study describes specific alternative transcripts produced by X and Y chromosome genes, whose expression indicates roles in early spermatocytes (meiosis) and in spermatids (spermiogenesis). On the X chromosome, we have shown that three widely transcribed genes, Uba1x, Prdx4, and Atp11c, are reactivated in mouse and human spermatids via an alternative transcript that is expressed mainly in the testis. The Prdx4 gene codes two isoforms of the peroxiredoxin 4 that differ in their N-terminal domain. We have raised antibodies specific for each PRDX4 isoform and demonstrate, in mouse, that the reactivated transcript is translated in spermatids, producing a protein in a distinct cellular compartment from the ubiquitous isoform. Altogether, five mutations, affecting the spermatid-reactivated transcripts uniquely, of UBA1x and PRDX4, have been found specifically in our group of infertile men. On the mouse Y chromosome, we have studied Zfy1 and Zfy2, nearly identical testis specific zinc finger genes with long acidic (activation) domains. Zfy2, but not Zfy1, promotes the apoptotic elimination of spermatocytes with an unpaired X chromosome. We have identified an alternatively spliced transcript of Zfy1 that lacks half the acidic domain, and could explain the functional difference between Zfy1 and Zfy2. In human, the ZFY gene is widely transcribed, but we show that ZFY produces a testis specific variant transcript, encoding the same short acidic domain as Zfy1. Our data indicate that the alternative transcripts predominate in spermatocytes and spermatids, in both human and mouse. This provides the first evidence that human ZFY may play a conserved role during spermatogenesis, and contribute to human male fertility.
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Étude de l'histoire évolutive des PI3K et des voies de signalisation associées / Evolutionary history of PI3Ks and related signalling pathwaysPhilippon, Héloïse 05 July 2016 (has links)
L'objectif principal de ma thèse a été la caractérisation de l'histoire évolutive des voies de signalisation au travers d'une double approche: (i) l'analyse phylogénétique de leurs composés; et (ii) l'identification et la caractérisation de leurs interactions par l'analyse des interactomes d'organismes modèles. Or, bien que de nombreux outils soient disponibles pour la reconstruction d'arbres de gènes individuels, peu de méthodes ont été développées pour l'étude d'un ensemble de protéines impliquées dans un même processus cellulaire. Pourtant, au sein de la cellule, la plupart des protéines agissent en interaction avec d'autres protéines. Dans un premier temps, j'ai étudié l'histoire évolutive de la famille des PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinases). Cette première analyse phylogénétique détaillée m'a permis de mettre en place une méthodologie applicable aux voies de signalisation. Un problème important rencontré dans cette étude a consisté en la sélection de transcrits alternatifs et ceci m'a conduit à développer un logiciel dédié nommé BATfinder (\Best Aligned Transcript finder). Dans le but d'étudier la voie de signalisation AKT/mTOR, j'ai effectué l'implémentation de la méthodologie validée avec les PI3K. Cette implémentation a pris la forme d'un pipeline automatique nommé EPINe (Easy Phylogenetics for Interaction Networks). Ce pipeline est théoriquement utilisable pour l'analyse phylogénétique de tout réseau métabolique eucaryote / The main goal of my thesis was the characterization of the evolutionary history of signalling pathways through a twofold approach: (i) the phylogenetic analysis of their components; and (ii) the identification and characterization of their interactions by the analysis of model organisms interactomes. While many tools are available for single genes tree reconstruction, only a few methods have been developed for the study of a set of proteins involved in the same cellular process. However, inside the cell, most of proteins interact with others.Initially, I studied the evolutionary history of the PI3K family (Phosphati-dylinositol 3-kinases). This first detailed phylogenetic analysis allowed me to set up a methodology suitable for signalling pathways. One of the important problems encountered in this study was the selection of alternative transcripts and this led me to develop a software called BATfinder (Best Aligned Transcript finder ). In order to study the AKT/mTOR signalling pathway, I have implemented the methodology previously validated with PI3Ks. This implementation was carried out as an automated pipeline called EPINe (Easy Phylogenetics for Interaction Networks). This pipeline is theoretically usable for the phylogenetic analysis of any eukaryotic metabolic network
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