京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23765号 / 医博第4811号 / 新制||医||1056(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 辻川 明孝, 教授 寺田 智祐, 教授 濵﨑 洋子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Einleitung: Equine Bronchialepithelzellen (EBEC) orchestrieren die Funktion von Zellen wie z. B. glatte Muskelzellen, Zellen des Immunsystems sowie Rezeptorantworten. Darüber hinaus exprimieren sie β2-Adrenozeptoren. Diese wiederum spielen eine entscheidende Rolle bei der Physiologie der Atemwege aber auch bei der Pathogenese von Atemwegserkrankungen, wie dem humanen und equinen Asthma, sowie als therapeutisches Ziel bei deren Behandlung. Zielsetzung: In der vorliegenden Arbeit wurden equine Bronchialepithelzellen isoliert und kultiviert. An ihnen wurden dann die Expression, der Subtyp und die Funktionalität des β2-Adrenozeptors untersucht. Dies wurde sowohl an frisch isolierten, an kultivierten und an mit ROCK-Inhibitors Y-27632 behandelten EBEC geprüft, um den Einfluss der Kultivierung und den Einfluss von Y-27632 auf die Expression und die Funktion des Rezeptors zu klären. Material und Methode: EBEC wurden aus den Bronchien von gesund geschlachteten Pferden gewonnen, indem die Mukosa stumpf abgetrennt, zerkleinert und mittels 0,25 % Trypsin verdaut wurde. Die Dichte und die Subtypverteilung der β-Adrenozeptoren auf EBEC wurden mittels Radioligandbindungsstudie mit [125I]-(-)-Iodocyanopindolol und in Gegenwart von subtypselektiven β2- (ICI 118.551) und β1-Antagonisten (CGP 20712A) untersucht. Die Funktion wurde in Form der intrazellulären cAMP-Akkumulation nach Stimulation durch die Agonisten Isoprenalin, Epinephrin und Norepinephrin mit Hilfe eines Alpha-Screen-Assays untersucht. Die Kultvierung der Zellen erfolgte in einem vollständigen AECGM mit 10 % FBS. Nach sechs Tagen bildete sich ein konfluenter Monolayer. Y-27632 wurde in der Konzentration von 10 nM angewendet. Die statistische Signifikanz wurde über einen t-Test für unverbundene Stichproben ermittelt und das Signifikanzniveau bei P ≤ 0,05 festgelegt. Ergebnisse: Die maximale Rezeptordichte (Bmax) war mit 9 763 Bindungsstellen/Zelle bei frisch isolierten und 10 575 Bindungsstellen/Zelle bei kultivierten EBEC vergleichbar. Allerdings führte Y 27632 während der Kultivierung zu einer Reduktion um ~35 % von 10 575 Bindungsstellen/Zelle auf 6 929 Bindungsstellen/Zelle. Die Affinität (KD) des Rezeptors war bei allen drei Bedingungen (frisch, kultiviert und mit Y-27632 behandelt) mit 16, 25 und 34 pM ähnlich hoch. Bei der Untersuchung der β-Adrenozeptorsubtypverteilung konnte überwiegend der β2-Adrenozeptorsubtyp nachgewiesen werden. Die Bildung des intrazellulären cAMP erfolgte bei allen EBEC in der Reihenfolge der Potenz Isoprenalin > Epinephrin > Norepinephrin. Die Emax Werte für Isoprenalin, Epinephrin und Norepinephrin waren bei frisch isolierten mit 33, 29 und 30 pM und bei kultivierten EBEC mit 33, 27 und 22 pM ähnlich. Die Behandlung mit Y-27632 führte jedoch zu einer signifikanten Erhöhung der Emax Werte und somit zu einer deutlichen Funktionsverbesserung der β2-Adrenozeptoren. Schlussfolgerung: EBEC haben sich als ein geeignetes In-vitro-Zellmodell zur Untersuchung der Eigenschaften von β2-Adrenozeptoren in Physiologie und Pathologie sowohl für Forschungs- als auch für Klinikzwecke gezeigt. Die Funktionsverbesserung der β-Adrenozeptoren unter dem Einfluss von Y-27632 scheint vielversprechend für den zukünftigen Einsatz als Arzneimittel bei der Behandlung von humanem und equinem Asthma. Allerdings bleibt seine downregulierende Wirkung auf die Rezeptorendichte widersprüchlich und bedarf weiterer Forschungsarbeit.

Les cellules iNKT et T CDS innées sont présumées contribuer à l'irnmunosurveillance (IS) des cancers et sont fonctionnellement déficientes dans la leucémie myéloïde chronique (LMC). Notre hypothèse était que ces défauts résultent de l'incapacité des cellules dendritiques myéloïdes (mDC) à les activer. Des analyses par cytométrie en flux et microscopie confocale ont révélé une baisse de l'expression membranaire de CD 1 d, qui présente les antigènes aux cellules iNKT, à la surface des mDC des patients LMC, par comparaison aux sujets sains. Ce défaut n'est associé ni à un défaut de maturation des mDC, comme le montre l'expression normale de HLA-DR et de CDS6, ni à une baisse d'expression intracellulaire de CDld ou de son transcrit. Ces résultats sont conciliables avec une rétention intracellulaire. Le traitement in vitro des mDC des patients LMC avec un inhibiteur de la protéine ROCK restaure partiellement l'expression de surface de CD 1 d et la présentation antigénique par CD Id, alors qu'il n'a eu aucun effet sur les mDC des sujets sains. Nous proposons que la protéine ROCK, qui est activée par le domaine DH-PH de BCR-ABL, interfere avec la réponse immunitaire dépendant des lymphocytes iNKT au cours de la LMC par régulation négative de l'expression membranaire de CDld des mDC. Le fait que les cellules iNKT et T CDS innées retrouvent des fonctions normales après rémission complète de la LMC est en faveur d'une génération de cellules T CD8 innées dépendante des cellules iNKT, comme décrit chez la souris. Notre travail suggère une implication des cellules iNKT et T CD8 innées dans l'IS de la LMC et révèle l'axe ROCK/mDC comme une nouvelle cible thérapeutique dans la maladie. / CDld-restricted iNKT cells and innate CD8 T cells are believed to play a key role in cancer immune surveillance and are functionally deficient in chronic myeloid leukemia (CML). Herein, we have hypothesized that this defect might originate from BCR-ABL-dependent dysfunctions in myeloid dendritic cells (mDC). Indeed, flow cytometry and confocal microscopy revealed that cell-surface expression of CDld was downregulated in CML mDC, relative to healthy donor (HD) controls. The decreased cell-surface display of CDld could not be ascribed to defective mDC differentiation, as attested by normal expression of HLA-DR and the CD86 maturation marker. On the other hand, reduced membrane expression was not associated with decreased intracytoplasmic levels of CDld or its mRNA transcripts, consistent with intracellular retention. ln vitro treatrnent of CML mDC with the Rho-associated protein Kinase (ROCK) inhibitor Y-27632 partially restored both cell-surface CDld expression and CDld-mediated antigen presentation, while it had no effect on HD mDC. We propose that ROCK, which is most likely activated by the DH-PH domain of BCR-ABL, mediates iNKT-cell immune subversion in CML patients by downregulating CDld expression on CML mDC. Remarkably, both iNKT cells and innate CD8 T cells retumed to nonnal after complete CML remission, a finding consistent with a iN KT cell-dependent generation of innate CD8 T cells, similarly to the observations in mice. Ali in ali, our study supports the possible contribution of iNKT/innate CD8 T cells to tumor surveillance in CML, and reveals the ROCK/mDC axis as a new potential target to restore immune surveillance in CML.