Le diabète est une dérégulation systémique chronique caractérisée par des perturbations métaboliques permanentes à l’origine de nombreuses complications, y compris le cancer. Le diabète augmente le risque du cancer colorectal (CRC) de 1,2 à 1,5 fois. Cependant, les voies moléculaires et cellulaires en jeu ne sont pas assez élucidées. Nos résultats témoignent d’une dérégulation de la voie AMPK/mTORC1 dans le diabète et le CRC avec une surexpression de la NADPH oxydase Nox4, augmentant ainsi la production de ROS. Ceci provoque un stress oxydatif qui s’élève en cas de diabète et contribue à la progression du CRC. De plus, nos résultats montrent que ce stress induit une altération de la voie de signalisation AMPK/mTORC1, aboutissant à une agressivité accrue du comportement des cellules cancéreuses du côlon et de la formation de polypes. Notre projet permet, d’une part, d’identifier de nouveaux mécanismes moléculaires impliqués dans la progression du CRC induite par le diabète et d’autre part, de développer des stratégies thérapeutiques efficaces pour inverser la progression du CRC chez les patients diabétiques. / Diabetes is a chronic systemic malfunction characterized by persistent metabolic disturbances that culminate in a high rate of complications to which cancer was recently annexed. In fact, diabetes inflates colorectal cancer (CRC) risk by 1.2-1.5 folds. However, the cellular and molecular pathways involved are not well understood. Our results show that AMPK/mTORC1 pathway is deregulated in both diabetes and CRC. This was paralleled by an elevation in the expression of the NADPH oxidase Nox4 leading to an increase in ROS production. Furthermore, our results show that oxidative stress, secondary to alteration in the level and activity of Nox4 is augmented in diabetes and contributes to the progression of CRC. The resulting oxidative stress further led to an alteration in the signaling of the AMPK/mTORC1 pathways culminating in an exacerbated aggressiveness in cancer cell behavior and colon polyp formation. Our project allows the identification of novel molecular mechanisms involved in diabetes-induced CRC progression and development of effective therapeutic strategies to reverse the progression of CRC in diabetic patients.

Les protéines STAT5A et B sont des facteurs de transcription jouant un rôle important dans l'hématopoïèse normale et leucémique. Ce sont en effet des effecteurs essentiels d’oncogènes à activité tyrosines kinases, tels que BCR-ABL ou JAK2V617F responsables de la genèse d’hémopathies malignes. Ces oncogènes régulent la production de ROS (Reactive Oxygen Species) via l’activation de différentes voies de signalisation impliquées dans la prolifération et la survie cellulaire. Dans ce travail de thèse, nous montrons que l’activation oncogénique de STAT5, induite par BCR-ABL, favorise un stress oxydatif dans les cellules de Leucémie Myéloïde chronique (LMC), via la répression de l’expression des enzymes anti-oxydantes catalase et glutaredoxine-1 et la modulation potentielle de l’activité des NADPH oxydases. Nous montrons pour la première fois que l’effet pro-oxydant de STAT5 est régulé par la phosphorylation sur tyrosine de ces protéines et que les formes non phosphorylées et transcriptionnellement inactives exercent un effet anti-oxydant et protecteur contre le stress oxydatif, via des mécanismes non canoniques. Cette dualité de fonction est illustrée dans un modèle de co-culture de cellules de LMC et de cellules stromales médullaires, que nous avons développé dans le laboratoire afin de mimer le microenvironnement médullaire des cellules leucémiques. Dans ce modèle, nous montrons que le contact avec les cellules stromales permet d’inactiver STAT5 dans les cellules leucémiques et donc de promouvoir son activité anti-oxydante. Nous observons également un arrêt de prolifération et une entrée en phase G0 du cycle cellulaire des cellules leucémiques au contact des cellules stromales, ainsi qu’une résistance accrue de ces cellules à l’Imatinib, un inhibiteur de BCR-ABL. Ces données suggèrent un lien important entre activité anti-oxydante de STAT5, quiescence et chimio résistance des cellules leucémiques. / The Signal Transducer and Activator of Transcription factors 5A and B are two closely related STAT family members that play a major role in normal and leukemic hematopoiesis. STAT5 proteins are frequently activated in hematopoietic neoplasms and are targets of various tyrosine kinase oncogenes such as BCR-ABL and JAK2V617F. Both oncogenes were shown to stimulate the production of intracellular ROS (Reactive Oxygen Species) in leukemic cells and evidences for a cross talk between STAT5 and ROS metabolism have recently emerged. Herein, we demonstrate that sustained activation of STAT5 induced by BCR-ABL promotes ROS production in Chronic Myeloid Leukemia (CML) cells by repressing expression of two antioxidants, catalase and glutaredoxin1 and by possible functional interactions with NADPH oxidase complexes. We also provide compelling evidences that tyrosine phosphorylation regulate the pro-oxidant activity of STAT5 and that non phosphorylated STAT5 displays antioxidant properties and protection against oxidative stress via non-genomic effects. This dual function of STAT5 is also illustrated in an in vitro microenvironment model that we develop in our laboratory to analyze interactions between bone marrow stromal cells and CML cells. Using these coculture experiments, we show that STAT5 phosphorylation was reduced and its antioxidant activity enhanced in leukemic cells in contact with stromal cells. We also demonstrate in this model that leukemic cells stopped dividing, entered a quiescent G0 state and became resistant to Imatinib, a BCR-ABL kinase inhibitor. Collectively, these findings suggest an important link between antioxidant activity of STAT5, quiescence and resistance to chemotherapeutic agents in leukemic cells.

Mitochondria are key generators of cellular ATP, vital to complex life. Historically, mitochondrial generation of reactive oxygen species (ROS) was considered to be an unregulated process, produced by dysfunctional mitochondria. More recently, mitochondrial ROS generated by complex I, particularly by the process of reverse electron transfer (RET), has emerged as a potentially biologically relevant signal that is tightly-regulated and dependent on mitochondrial status. ROS production by RET is reported to play a role in the innate immune response and lifespan extension in fruit flies. One way in which mitochondrial ROS may behave as a signal is by altering the activity of AMP-activated protein kinase (AMPK), a key metabolic sensor and regulator of cell metabolism, which is activated when cellular ATP levels decrease during energy demand. Mitochondria can signal to AMPK via the magnitude of the cellular ATP/AMP and ATP/ADP ratios, which alter in response to mitochondrial function. Our view is mitochondria may also signal to AMPK via ROS. Important studies have helped to clarify the role of exogenous or cytosolic ROS in AMPK regulation. However, the effects of mitochondrial ROS on AMPK activity, specifically that generated by complex I, remain unclear and is the main focus of this thesis. I characterized the effects of exogenous H2O2 on cellular AMPK activity, ATP/ADP ratios and cellular redox state in a cell model. I then compounded this with selective mitochondria generated ROS by the mitochondria-targeted redox-cycler, MitoParaquat (MPQ). AMPK activity appeared to correlate with decreasing cell ATP/ADP ratios, indicating that both sources of ROS primarily activate AMPK in an AMP/ADP-dependent mechanism. In parallel, I developed an approach for analyzing the redox state of candidate proteins, an important step in determining if a protein is directly regulated by ROS. I also initiated development of a cell model for studying the downstream effects of mitochondrial ROS production by RET, by expressing alternative respiratory enzymes in a mammalian cell line.

Le stress oxydatif joue un rôle majeur dans la mort des cellules neuronales dans diverses conditions neuropathologiques. Cependant, les astrocytes réactifs, en produisant des facteurs neuroprotecteurs et antioxydants, sont capables de protéger les neurones contre le stress oxydatif. De ce fait, la protection des cellules gliales contre les facteurs nocifs, s’avère indispensable pour prévenir les dommages des cellules nerveuses. Les globines du cerveau, en particulier, la neuroglobine (Ngb) et l’hémoglobine (Hb), exprimées dans les cellules nerveuses, jouent un rôle important dans le métabolisme de l’oxygène. Récemment, il a été démontré, que ces protéines exercent des effets neuroprotecteurs dans les modèles expérimentaux de maladies neurodégénératives. Cependant, aucun effet glioprotecteur n’a été rapporté. Les objectifs de ce travail de thèse sont, de mettre en évidence les effets protecteurs de l’Hb et la Ngb dans les astrocytes en culture en présence d’un stress oxydant, et d’élucider les mécanismes intracellulaires mis en jeu. Nous avons démontré que l’Hb et la Ngb sont capables de promouvoir la survie des astrocytes en condition de stress oxydatif, et ce en réduisant significativement la surproduction des ROS, la surexpression des gènes pro-inflammatoires (IL-6, IL-33, iNOS), le dysfonctionnement mitochondrial et la stimulation de l’activité de la caspase-3/7. Nous avons montré aussi que les effets anti-apoptotiques impliquent l’activation des voies de signalisation ERK-MAPK. En outre, nous avons vérifié les effets glioprotecteurs sur un modèle animal de stress oxydatif chronique, les souris KO TP53INP1, ainsi que sur un modèle animal d’hypoxie. / Oxidative stress plays a major role in the death of neuronal cells under various neuropathological conditions. However, reactive astrocytes, by producing neuroprotective and antioxidant factors, are able to protect neurons against oxidative stress. Therefore, protecting glial cells from harmful factors is essential to prevent nerve cell damage. Brain globins, in particular, neuroglobin (Ngb) and hemoglobin (Hb), expressed in neurons and glial cells, play an important role in the metabolism of oxygen. Recently, it has been demonstrated that these proteins exert neuroprotective effects in experimental models of neurodegenerative diseases. However, no glioprotective effect has been reported. The objectives of this thesis work are to demonstrate the protective effects of Hb and Ngb in cultured astrocytes in the presence of oxidative stress and to elucidate the intracellular mechanisms involved. We have demonstrated That Hb and Ngb are able to promote the survival of astrocytes under oxidative stress conditions by significantly reducing over-production of ROS, overexpression of pro-inflammatory genes (IL-6, IL-33, iNOS) Mitochondrial dysfunction and stimulation of caspase-3/7 activity. We have also shown that anti-apoptotic effects involve the activation of ERK-MAPK signaling pathways. In addition, we verified the glioprotective effects on an animal model of chronic oxidative stress, KO mice TP53INP1, as well as on an animal model of hypoxia.

Obstacle detection is one of the major focus area on image processing. For mobile robots, obstacle detection and collision avoidance is a notorious problem and is still a part of the modern research. There are already a lot of research have been done so far for obstacle detection and collision avoidance. This thesis evaluates the existing various well-known methods and sensors for collision free navigation of the mobile robot. For moving obstacle detection purpose the frame difference approach is adopted. Robotino® is used as the mobile robot platform and additionally Microsoft Kinect is used as 3D sensor. For getting information from the environment about obstacle, the 9-built-in distance sensor of Robotino® and 3D depth image data from the Kinect is used. The combination is done to get the maximum advantages for obstacles information. The detection of moving object in front of the sensor is a major interest of this work.

Les facteurs de transcription Twist1 et Twist2 (famille Twist) jouent un rôle majeur dans le développement embryonnaire et dans la progression tumorale. Leur potentiel oncogénique dérive directement de la combinaison de leurs nombreuses activités développementales. Les gènes Twist peuvent notamment, en induisant la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), promouvoir l’invasion des cellules cancéreuses et participer de ce fait aux processus métastatique. De plus, en bloquant l’activité des voies de signalisation Rb et p53, ils peuvent inhiber les deux principaux programmes de sauvegarde cellulaire que sont l’apoptose et la senescence. Enfin, ils sont également impliqués dans la résistance des cellules cancéreuses aux agents chimio-thérapeutiques. En plus de ces nombreuses activités, nos données préliminaires nous ont amené à considérer un rôle de Twist dans la réponse au stress. Les cellules cancéreuses doivent croitre dans un environnement en perpétuel changement qui génère de nombreux types de stress. Seules les cellules capables de s’adapter, peuvent survivre et acquérir de nouvelles capacités les rendant plus agressives. La résistance au stress fait donc partie intégrante de la progression tumorale. Nos travaux révèlent que Twist en induisant une résistance au stress, plus particulièrement métabolique, est un acteur essentiel de l’acquisition d’u phénotype agressif des cellules cancéreuses. Dans une première étude, nous avons montré que Twist module le stress oxydatif, une condition très fréquemment retrouvée dans les tumeurs. Ainsi, nos résultats indiquent que l’expression de Twist provoque une réduction du taux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaire. Cette activité a pour conséquence directe d’induire une résistance accrue à l’apoptose déclenchée par divers traitements. Nous avons par la suite caractérisé cette activité et mis en évidence un programme génétique contrôlé par Twist impliquant divers facteurs possédant des propriétés anti-oxydantes. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à un autre type de stress métabolique, l’hypoxie. L’hypoxie définie par un taux insuffisant d’oxygène, est retrouvée dans la plupart des tumeurs solides du fait de l’absence ou de l’anomalité de la vascularisation. L’hypoxie mène à la stabilisation d’un facteur de transcription, HIF1α. Cette protéine est essentielle à l’adaptation hypoxique et contrôle l’expression de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme du glucose, le transport de l’oxygène, l’angiogenèse ou l’apoptose. Dans les premiers temps d’hypoxie, l’effet d’adaptation induit par HIF1α est bénéfique pour les cellules. Cependant, si l’absence d’oxygène se prolonge, HIF1α, peut pousser les cellules vers la mort. Nos travaux démontrent que Twist est capable de rendre les cellules résistantes à une hypoxie prolongée. De plus, cette activité de protection contre le stress hypoxique agit via un effet paracrine. Enfin, nos données suggèrent que cet effet est médié par une interaction directe entre les protéines Twist et HIF1α. Au final, cette étude indique que l’expression de Twist dans les cellules cancéreuses, en conférant une résistance accrue à l’environnement hypoxique, joue un rôle essentiel dans l’adaptation au stress et à l’acquisition de nouveaux phénotypes agressifs. En résumé, L’objectif principal de ma thèse était de mettre en évidence de nouvelles propriétés cellulaires des oncogènes de la famille Twist. Nos résultats démontrent que Twist par ses capacités à contrôler le stress métabolique, permet à la cellule cancéreuse de mieux s’adapter et donc survivre dans un environnement en constante évolution. Nos travaux renforcent donc la notion de l’importance de ces facteurs dans la progression tumorale. / Twist1 and Twist2 are related transcription factors that play major roles both during embryonic development and in several pathologies, including cancer. Twists' oncogenic potential arises from a combination of their multiple functions in development. Notably, both Twist induce epithelial-to mesenchymal transition, thus promoting tumour invasiveness and possibly conferring to cells self-renewal properties. Furthermore, through disruption of both Rb- and p53-driven pathways, Twist override two major oncogene-induced fail-safe programs, namely senescence and apoptosis, thereby promoting malignant conversion. Twist has also been reported to participate in acquisition of drug resistance and in promotion of neo-angiogenesis.Current knowledge of pleiotropic activities of Twist prompted us to postulate that these factors may be major regulators of stress response. Cancer cells survive and grow within a continuously changing environment that creates multiple stresses to which they must adapt in order to survive and strive. Such adaptations often give rise to the acquisition of an aggressive phenotype. Consistent with this hypothesis, we recently unveiled new activities of Twist proteins that are related to stress response. We have shown that Twist regulates response to oxidative stress, a condition exacerbated in cancer by stimuli such as inflammation, increased cellular metabolism and changes in tumour oxygenation. Our work has contributed to the understanding of molecular mechanisms through which Twist diminishes cellular ROS and thus participates in the escape from apoptosis and senescence. In the first part of my thesis, I worked on the antioxidant activity of Twist and described its molecular mechanisms.The second part of my work addressed the impact of Twist proteins on cellular response to hypoxia that is insufficient oxygen supply, frequently found in solid tumours. Cellular response to hypoxic stress relies on stabilization and activation of HIF1α, a key transcriptional mediator of the hypoxic response, regulating numerous genes involved in glucose metabolism, oxygen transport, angiogenesis, cell growth and apoptosis. HIF1α is beneficial for cancer cells in response to short hypoxic episodes, however its sustained activation in case of prolonged hypoxia may push cancer cells towards apoptosis. In this context, we have shown that Twist protects cancer cells from hypoxia-induced apoptosis. We have discovered HIF1α and Twist physically interact, suggesting a possible mechanistic basis for Twist's protective effect. These results led us to postulate that Twist plays a role in cellular response to hypoxia and thus participates in cancer cell adaptation and acquisition of aggressive phenotypes triggered by lack of oxygen.Our results reinforce the notion that Twist factors are major cellular stress modulators that might be important for adaptation of cancer cells to changing conditions in the process of tumour progression.

O projeto de mestrado, denominado de forma abreviada como GPUServices, se insere no contexto da pesquisa e do desenvolvimento de métodos de processamento de dados de sensores tridimensionais aplicados a robótica móvel. Tais métodos serão chamados de serviços neste projeto e incluem algoritmos de pré-processamento de nuvens de pontos 3D com segmentação dos dados, a separação e identificação de zonas planares (chão, vias), e detecção de elementos de interesse (bordas, obstáculos). Devido à grande quantidade de dados a serem tratados em um curto espaço de tempo, esses serviços utilizam processamento paralelo por GPU para realizar o processamento parcial ou completo destes dados. A área de aplicação em foco neste projeto visa prover serviços para um sistema ADAS: veículos autônomos e inteligentes, forçando-os a se aproximarem de um sistema de processamento em tempo real devido ao contexto de direção autônoma. Os serviços são divididos em etapas de acordo com a metodologia do projeto, mas sempre buscando a aceleração com o uso de paralelismo inerente: O pré-projeto consiste de organizar um ambiente que seja capaz de coordenar todas as tecnologias utilizadas e que explore o paralelismo; O primeiro serviço tem a responsabilidade de extrair inteligentemente os dados do sensor que foi usado pelo projeto (Sensor laser Velodyne de múltiplos feixes), que se mostra necessário devido à diversos erros de leitura e ao formato de recebimento, fornecendo os dados em uma estrutura matricial; O segundo serviço em cooperação com o anterior corrige a desestabilidade espacial do sensor devido à base de fixação não estar perfeitamente paralela ao chão e devido aos amortecimentos do veículo; O terceiro serviço separa as zonas semânticas do ambiente, como plano do chão, regiões abaixo e acima do chão; O quarto serviço, similar ao anterior, realiza uma pré-segmentação das guias da rua; O quinto serviço realiza uma segmentação de objetos do ambiente, separando-os em blobs; E o sexto serviço utiliza de todos os anteriores para a detecção e segmentação das guias da rua. Os dados recebidos pelo sensor são na forma de uma nuvem de pontos 3D com grande potencial de exploração do paralelismo baseado na localidade das informações. Porém, sua grande dificuldade é a grande taxa de dados recebidos do sensor (em torno de 700.000 pontos/seg.), sendo esta a motivação deste projeto: usar todo o potencial do sensor de forma eficiente ao usar o paralelismo de programação GPU, disponibilizando assim ao usuário serviços de tratamento destes dados. / The master\'s project, abbreviated hence forth as GPUServices, fits in the context of research and development of three-dimensional sensor data processing methods applied to mobile robotics. Such methods will be called services in this project, which include a 3D point cloud preprocessing algorithms with data segmentation, separation and identification of planar areas (ground track), and also detecting elements of interest (borders, barriers). Due to the large amount of data to be processed in a short time, these services should use parallel processing, using the GPU to perform partial or complete processing of these data. The application area in focus in this project aims to provide services for an ADAS system: autonomous and intelligent vehicles, forcing them to get close to a real-time processing system due to the autonomous direction of context.The services are divided into stages according to the project methodology, but always striving for acceleration using inherent parallelism: The pre-project consists of organizing an environment for development that is able to coordinate all used technologies, to exploit parallelism and to be integrated to the system already used by the autonomous car; The first service has a responsibility to intelligently extract sensor data that will be used by the project (Laser sensor Velodyne multi-beam), it appears necessary because of the many reading errors and the receiving data format, hence providing data in a matrix structure; The second service, in cooperation with the above, corrects the spatial destabilization due to the sensor fixing base not perfectly parallel to the ground and due to the damping of the vehicle; The third service separates the environment into semantics areas such as ground plane and regions below and above the ground; The fourth service, similar to the above, performs a pre-segmentation of street cruds; The fifth service performs an environmental objects segmentation, separating them into blobs; The sixth service uses all prior to detection and segmentation of street guides.The received sensor data is structured in the form of a cloud of points. They allow processing with great potential for exploitation of parallelism based on the location of the information. However, its major difficulty is the high rate of data received from the sensor (around 700,000 points/sec), and this gives the motivation of this project: to use the full potential of sensor to efficiently use the parallelism of GPU programming, therefore providing data processing services to the user, providing services that helps and make the implementation of ADAS systems easier and/or faster.

Les travaux présentés dans cette thèse ont porté sur la specificité des réponses cellulaires de l’halophyte obligatoire Cakile maritima au choc salin et la régulation des événements précoces impliqués dans la mort cellulaire programmée et la survie en condition de salinité. Dans une première étape, nous avons montré que cette plante est aussi tolérante aux chocs salins répétés qu’au stress salin progressif. Cependant, on a observé de zones de mort cellulaires sur les feuilles âgées soumises à un choc salin sévère (400 mM NaCl). Pour mieux cerner la cascade d’événements impliqués dans ce processus de mort cellulaire, nous avons poursuivi nos expériences sur des suspensions cellulaires de C. maritima, dont nous avons-nous même optimisé les conditions d’obtention, et des suspensions cellulaires d’Arabidopsis thaliana (glycophyte modèle). Chez les deux espèces, nous avons observé une mort cellulaire programmée qui dépend de la durée et l’intensité du traitement salin appliqué, et qui met en jeu les mêmes événements cellulaires notamment la dépolarisation de la membrane plasmique due à l’entrée de Na+ par les NSCCs, un dysfonctionnement mitochondrial, une production d’anions superoxydes et une activation de protéines de type caspase. La tolérance de C. maritima au stress salin serait potentiellement due à une forte accumulation d’ascorbate qui permettrait à cette halophyte de mieux réduire les dommages générés par le stress oxydatif. C. maritima s’est aussi distinguée par une meilleure capacité de contrôler l’accumulation cytoplasmique de Na+, conduisant à la survie de ses cellules en condition de salinité. Cette étude sur la mort cellulaire induite par le NaCl chez les cellules en culture de C. maritima nous a aussi permis de mettre en évidence deux types de comportement dans cette population de cellules en culture : l’un lié à une dépolarisation soutenue en réponse au NaCl conduisant probablement à la mort de ces cellules, l’autre lié à une dépolarisation transitoire indiquant que l’influx de Na+ au travers des NSCC était régulé permettant probablement aux cellules présentant ce comportement de survivre en évitant l'accumulation excessive de Na+ dans le cytosol. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons mis en évidence la capacité de C. maritima d’exclure Na+ via le système SOS. Ce résultat suggère l’existence d’une deuxième voie de signalisation induite parallèlement à celle conduisant à la mort cellulaire. Cette voie, impliquant une production rapide d’oxygène singulet, pourrait permettre un influx de Ca2+ dans le cytoplasme activant la protéine SOS3 et en cascade SOS2 et SOS1 et les H+-ATPases de la membrane plasmique permettant un efflux du Na+ via SOS1 hors des cellules. / AbstractThis work aimed at understanding the specificity of cellular responses of the obligate halophyte Cakile maritima to salt shock and regulation of early events involved in programmed cell death and survival under salinity conditions. In a first step, we have shown that this plant is tolerant upon both repetitive salt shocks and gradual salt application. However, we have observed a cell death zones on older leaves subjected to a severe shock saline (400 mM NaCl). To better understand the cascade of events involved in the cell death process, we continued our experiments on suspension culture of C. maritima, which we have optimized ourselves the conditions for establishment and suspension culture of Arabidopsis thaliana (glycophyte model). In both species, salinity induced programmed cell death that depends on the duration and the intensity of the applied salt treatment. Also, the same cellular events, including depolarization of the plasma membrane due to the Na+ influx by NSCCs, mitochondrial dysfunction, production of superoxide anions and activation of caspase-like proteins, occurs early in response to salt stress. C. maritima tolerance to salt stress is potentially due to a strong accumulation of ascorbate that would allow this halophyte to better reduce damage generated by oxidative stress. C. maritima is also distinguished by a better ability to control the cytoplasmic accumulation of Na+, leading to the survival of its cells under salinity conditions. This study on cell death induced by NaCl in cell culture of C. maritima also allowed us to identify two types of behavior in this population of cells in culture: one related to a sustained depolarization in response to NaCl probably leading to death of these cells, the other linked to a transient depolarization indicating that the Na+ influx through the NSCC was probably regulated allowing cells exhibiting this behavior to survive by avoiding excessive accumulation of Na+ in the cytosol. In the last part of this work, we have demonstrated the ability of C. maritima to exclude Na+ via the SOS system. This result suggests the existence of a second signaling pathway induced in parallel to that leading to cell death. This pathway, involving a rapid production of singlet oxygen, could allow a Ca2+ influx in the cytoplasm that acts as an elicitor for activation of SOS3 protein and SOS2-SOS1 cascade and H+- ATPases of the plasma membrane allowing Na+ efflux via SOS1 out of cells.

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont dus à une atteinte oligoclonale de la cellule souche hématopoïétique aboutissant à une dysplasie des lignées myéloïdes, des cytopénies sanguines et une évolution fréquente vers la leucémie aiguë. De nombreuses mutations décrites dans des gènes contrôlant la régulation épigénétique sont responsables de la genèse des SMD. Mais des travaux récents montrent également que des anomalies du microenvironnement médullaire, notamment des cellules stromales mésenchymateuses (CSM), peuvent induire et propager un SMD suggérant l’idée d’une communication intercellulaire étroite entre la niche et les cellules hématopoïétiques. L’invalidation du gène Dicer1 (RNASE de type III impliquée dans le processing des microARN) dans les progéniteurs ostéoblastiques murins induit un véritable SMD avec dysmyélopoïèse.Nous avons confirmé la sous-expression de Dicer1 dans les CSM SMD à partir de prélèvements primaires de moelle totale et dans les CSM en expansion. La sous-expression de Dicer1 s’accompagne d’une dérégulation du profil des microARN au sein de CSM SMD mise en évidence par étude transcriptomique des CSM SMD vs CSM témoins. Nous avons découvert une possible cible thérapeutique : le miR-486-5p que nous avons retrouvé constamment surexprimé dans les CSM SMD. Un des moyens pour les CSM d’influer sur les cellules souches hématopoïétiques peut se faire par la sécrétion de vésicules extracellulaires (EVs). Ces EVs sont hétérogènes et peuvent être définies par leur taille. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux petites vésicules extracellulaires (sEVs) contenant la fraction exosomale qui est connue comme pouvant transporter des microARN, mARN et des protéines entre les cellules. Nous avons retrouvé ce miR-486-5p transporté comme cargo dans les sEVs sécrétées des CSM, des CSM vers les CD34+. De plus, nous montrons dans un modèle de co-incubation (sEVs avec CD34+ de sujets sains), que sur le plan fonctionnel, les sEVs provenant de CSM SMD induisent plus d’apoptose, plus de stress oxydatif ainsi que plus de dommage à l’ADN.Par ailleurs, la surcharge martiale observée chez les patients SMD est également responsable d’un stress oxydatif. Le déférasirox (DFX), un chélaleur de fer, a montré dans le cadre d’études rétrospectives une amélioration de l’érythropoïèse chez des patients SMD. Grâce à un modèle de différenciation érythroïde avec surcharge martiale, nous avons montré que de faibles doses de DFX induisent une meilleure prolifération des progéniteurs érythroïdes (moins d’apoptose et plus de cellules en cycle) via une activation de NF-κB. Cette activation est due à une diminution du niveau de dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) en rapport avec une diminution du fer labile et est contrôlée de manière très fine par le niveau de ROS.Enfin, nous avons utilisé les propriétés du microenvironnement médullaire pour établir un modèle murin de SMD humain. En effet, la relative incapacité des cellules souches myélodysplasiques humaines de greffer et de reconstituer une hématopoïèse pathologique dans des souris immunodéprimées suggère que ces cellules souches SMD doivent avoir besoin d’un support extrinsèque du microenvironnement. Nous avons réalisé un modèle de souris humanisées en co-injectant des CSM et des CD34+ en intratibial. Une prise de greffe a été observée chez toutes les souris injectées et avons pu étudier l’évolution clonale au fil des générations dans les différentes sous-populations de progéniteurs myéloïdes (common myeloid progenitors (CMP), granulocyte macrophage progenitors (GMP) and megakaryocyte–erythroid progenitor (MEP)). Notre modèle est stable au cours des générations avec persistance du clone fondateur initial.En conclusion, ce travail confirme le rôle prépondérant du microenvironnement médullaire dans la genèse et la physiopathologie des syndromes myélodysplasiques et ouvre la voie à de nouvelles possibilités thérapeutiques. / Myelodysplastic syndromes (MDS) are hematopoietic stem cell (HSC) oligoclonal diseases leading to dysplasia, blood cytopenia and evolution to acute leukemia. Numerous mutations in genes involved in epigenetic regulation are responsible of MDS genesis. But recently, studies show that medullar microenvironment, particularly mesenchymal stromal cells (MSC), could induces and propagates a truly MDS suggesting a narrow communication between HSC and this niche. Dicer1’s (type III RNAse implicating in microRNA processing) invalidation in murine osteoblastic progenitors induces a MDS with sign of dysplasia.In this work, we have confirmed the under expression of Dicer1 in MDS mesenchymal stromal cells from total bone marrow and cultured MSC. Dicer1 down regulation leads to a deregulation of miRNome profile in MDS MSC highlighted by transcriptomic approaches. We found a potential therapeutic target: miR-486-5p which is constantly overexpressed in MDS MSC. Extracellular vesicles (EVs) could be a possible way for MSC to influence HSC fates. Those EVs are heterogeneous are could be characterized by their sight. We mainly focused on small EVs (sEVs) containing the exosomal fraction known to be able to carry miRNA, mRNA and proteins. We found that miR-486-5p is carry from MSC to the HSC. Transcriptomic analyses of HD HSC overexpressing miR-486-5p are ongoing. Moreover, in a co-incubation model (sEVs and healthy donor (HD) HSC), sEVs coming from MDS MSC induced apoptosis, oxidative stress and DNA damages.Moreover, iron overload seen in MDS patients is also able to induce DNA damages and oxidative stress. Deferasirox (DFX), an iron chelator, has shown an erythropoiesis improvement in MDS patients. Using an erythroid differentiation model with iron overload, we have observed that low dose of DFX induce a better proliferation of erythroid progenitors (less apoptosis and more cycling cells) due to NF-κB activation. This activation is due to a decrease of reactive oxygen species level in relation to a decrease of the labile iron pool.Finally, we have used medullar microenvironment properties to establish a murine model of MDS. Indeed, MDS HSC incapacity to reconstitute a pathological hematopoiesis in immunocompromised mice suggests that MDS HSC need an extrinsic support from the microenvironment. We have engineered a MDS patient derived xenograft (PDX) model by intra-tibial co-injection CD34+ cells with MSC. All mice engrafted et we have follow the clonal evolution over mice generation in the different subset of myeloid progenitors. (common myeloid progenitors (CMP), granulocyte macrophage progenitors (GMP) and megakaryocyte–erythroid progenitor (MEP)). Our model is stable over generations with persistence of the initial founding clone.In conclusion, this work confirms the preponderant role of the medullary microenvironment in the genesis and physiopathology of myelodysplastic syndromes and opens the way to new therapeutic possibilities.

The retina is prone to oxidative stress from many factors which are also involved in the pathogenesis of degenerative diseases. In this study, we used the application of blue light as a physiological stress factor. The aim of this study was to identify the major source of intracellular ROS that mediates blue light-induced detrimental effects on cells which may lead to cytotoxicity. We hypothesized that outer segments are the major source of blue light induced ROS generation. In photoreceptors, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase (Nox) enzymes and the recently found respiratory chain complexes may represent a major source for reactive oxygen species (ROS), beside mitochondria and chromophores. Therefore, we investigated this hypothesis and analysed the exact localization of the ROS source in photoreceptors in an organotypic culture system for mouse retinas. Whole eyeball cultures were irradiated with visible blue light (405 nm) with an output power of 1 mW/cm2. Blue light impingement lead to an increase of ROS production (detected by H2DCFDA in live retinal explants), which was particularly strong in the photoreceptor outer segments. Nox-2 and Nox-4 proteins are sources of ROS in blue light irradiated photoreceptors; the Nox inhibitor apocynin decreased ROS stimulated by blue light. Concomitantly, enzyme SOD-1, a member of the antioxidant defense system, indicator molecules of protein oxidation (CML) and lipid oxidation (MDA and 4-HNE) were also increased in the outer segments. Interestingly, outer segments showed a mitochondrial-like membrane potential which was demonstrated using two dyes (JC-1 and TMRE) normally exclusively associated with mitochondria. As in mitochondria, these dyes indicated a decrease of the membrane potential in hypoxic states or cell stress situations. The present study demonstrates that ROS generation and oxidative stress occurs directly in the outer segments of photoreceptors after blue light irradiation.