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Assessment of Universal Approaches to Proteome PrefractionationLiu, Fang 13 May 2011 (has links)
Protein prefractionation is a popular and effective strategy for improved MS analysis of complex proteome mixtures. A challenge of prefractionation is the even partitioning with high recovery of all components of the mixture, particularly hydrophobic proteins. This thesis assesses various proteome prefractionation platforms, with a goal of comprehensive proteome analysis. A more reliable dataset of 1136 S. cerevisiae transmembrane proteins was computationally generated, and used to assess two gel-based platforms (GeLC/MS and GELFrEE/MS). These platforms were determined to be comparable for proteome analysis. The requirement for high-throughput, automated fractionation demands a gel-free separation workflow. Here, a LC-based workflow was optimized, relying on SDS-assisted yeast extraction, organic solvent protein precipitation, and reversed phase separation in a formic acid/isopropanol solvent system. Though this workflow afforded improvements over conventional LC strategies to proteome fractionation, the gel-based platforms were demonstrated to be superior, in terms of their unbiased separation of hydrophobic vs hydrophilic proteins.
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Développement de méthodes bidimensionnelles en ligne LCxLC-MS pour l’analyse de composés chargés / Development of two-dimensional liquid chromatography LCxLC-MS methods for the analysis of charged compoundsD'Attoma, Amélie 19 November 2013 (has links)
Ce manuscrit expose le développement de méthodes bidimensionnelles en ligne pour l'analyse de composés chargés en couplage avec la spectrométrie de masse. Le contexte de l'étude et les principes théoriques de la chromatographie en phase liquide unidimensionnelle et bidimensionnelle sont tout d'abord présentés. Les conditions expérimentales telles que l'instrumentation, les colonnes, les composés étudiés sont détaillés. Des études unidimensionnelles ont été effectuées afin de connaître le comportement cinétique des petites molécules ionisables et des peptides selon la phase mobile et la température. L'orthogonalité de systèmes chromatographiques et les capacités de pics générées ont ensuite été étudiés afin de connaître les conditions expérimentales les plus intéressantes pour l'analyse des composés chargés. Les comparaisons de systèmes ont été effectuées avec de nouveaux descripteurs d'orthogonalité et de capacité de pic effective qui ont été établit. Les systèmes bidimensionnels LCxLC ont ensuite été mis en place. L'utilité d'un split pour réduire le volume injecté en seconde dimension est envisagée. Des limites en termes de volume injecté dans la seconde dimension ont été définies en RPLC et en HILIC. Des mélanges de peptides ont été séparés par RPLCxRPLC(-MS), RPLCxHILIC(-MS) et HILICxRPLC. Le couplage avec la spectrométrie de masse est optimisé. L'intérêt des séparations bidimensionnelles est mis en évidence par rapport à des séparations LC-MS classiques / This manuscript is dedicated to the development of on-line two-dimensional liquid chromatography for the analysis of charged compounds with mass spectrometry coupling. The context of the study and the theoretical principles of liquid chromatography in one or two dimensions are presented. Experimental conditions such as instrumentation, columns, studied compounds are detailed. Some one-dimensional studies have been experimented to know the kinetic behaviour of small ionisables molecules and peptides depending on conditions. The orthogonality of chromatographic system and generated peak capacity have then been studied in order to know which experimental conditions are the most interesting for the analysis of charged compounds. The comparisons of systems have been done with new descriptor for orthogonality and effective peak capacity. Two-dimensional systems were then set up. Some limits in term of injected volume in the second dimension have been established in RPLC and in HILIC. The usefulness of a split to reduce the injected volume in second dimension has been studied. Some peptides mixtures have been separated by RPLCxRPLC(-MS), RPLCxHILIC(-MS) and HILICxRPLC. The MS coupling has been optimized. The interest of two dimensional separations is underlined compared to classical LC-MS separations
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Développement de méthodes bidimensionnelles en ligne LCxLC-UV/MS et LCxSFC-UV pour l’analyse de composés pharmaceutiques / Development of on-line two-dimensional LCxLC-UV/MS and LCxSFC-UV methods for the analysis of pharmaceutical samplesIguiniz, Marion 17 October 2018 (has links)
La chromatographie en phase liquide bidimensionnelle est une technique à fort potentiel, offrant un grand pouvoir de séparation. Après avoir démontré son intérêt dans l’industrie pharmaceutique et présenté les enjeux liés à l’analyse quantitative, une attention particulière est portée sur le développement de méthodes. Dans l’idée de développer une stratégie d’analyse générique, la première étape est de sélectionner un set de trois systèmes 2D par le biais d’une approche développée au laboratoire. La deuxième étape est d’évaluer le potentiel de ces systèmes pour l’analyse quantitative. Ces deux étapes ont conduit à la proposition d’une stratégie d’analyse applicable à l’analyse pharmaceutique dans un contexte industriel. Enfin le potentiel du couplage RPLCxSFC est envisagé dans deux cas de figure différents. Premièrement, dans le but de comparer ce couplage aux séparations RPLCxRPLC développées dans le cadre d’une stratégie analytique générique, en termes de pouvoir de séparation. Deuxièmement, dans le cadre de l’analyse de composés chiraux, en développant un couplage sRPLCxSFC permettant une analyse achirale/chirale simultanée. Les avantages d’une telle approche ont été mis en avant en la comparant aux approches conventionnelles / Two-dimensional liquid chromatography (2D-LC) is a powerful technique considering its high separation power. After showing the advantage of 2D-LC in the pharmaceutical area and presenting the challenges related to quantitative analysis, special attention was paid to method development. With the aim of developing a generic analytical strategy for pharmaceuticals, the first step of our approach consisted in selecting a set of three 2D-systems with the help of a methodology previously developed. In a second step, the potential of these 2D-systems was evaluated for the purpose of quantitative analysis. An analytical strategy able to be applied to pharmaceutical analysis in an industrial context was proposed. Finally, the potential of RPLCxSFC was investigated in two different cases. Firstly, for comparing this on-line two dimensional technique to on-line RPLCxRPLC with respect of the separation power. Secondly, for chiral compounds by developing a selective RPLCxSFC method for simultaneous achiral-chiral analysis. The advantage of such method was highlighted by comparing to conventional approaches
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Optimisation de méthodes bidimensionnelles en ligne LCxLC-UV/MS et LCxSFC-UV pour l’analyse d’échantillons complexes / Optimization of on-line two-dimensional LCxLC-UV/MS and LCxSFC-UV methods for the analysis of complex matricesSarrut, Morgan 17 October 2016 (has links)
La chromatographie en phase liquide bidimensionnelle « comprehensive » en ligne (LCxLC) est une technique à très haut pouvoir de séparation. Après avoir établi son intérêt mais aussi les enjeux liés au développement de méthodes et les conditions expérimentales utilisées, une attention particulière est portée à l'optimisation des méthodes en LCxLC. Une procédure d'optimisation basée une méthode « Pareto-optimal » est décrite. Les conditions optimales prédites sont ensuite appliquées à la séparation RPLCxRPLC d'un mélange complexe de peptides et comparée avec la 1D-RPLC en termes de capacité de pics, temps d'analyse et facteur de dilution démontrant l'avantage fournit par la RPLCxRPLC. L'optimisation d'une méthode HICxRPLC-UV/MS en ligne permettant la caractérisation exhaustive d'un anticorps conjugué est réalisée soulignant, entre autres, la grande complémentarité entre les différents modes de détection employés en 1D et 2D.Enfin, la possibilité de développer un couplage RPLCxSFC est explorée dans le but d'augmenter l'espace de séparation pour des composés neutres. La méthode RPLCxSFC optimisée est comparée avec une séparation RPLCxRPLC optimisée pour l'analyse d'une bio-huile montrant qu'elle peut-être considérée comme une alternative crédible pour la séparation de tels échantillons / Comprehensive two-dimensional liquid chromatography is a powerful but complex separative technique. After detailing the interest of such a technique, the method development issues and the experimental conditions employed throughout this work, a particular attention is paid to the optimization of LCxLC methods. Accordingly an optimization procedure based on Pareto-optimal method is described. The predicted optimal conditions are then applied to experimental RPLCxRPLC separations of complex samples of peptides and compared with 1D-RPLC in terms of peak capacity, analysis time and sensitivity clearly showing the advantage of RPLCxRPLC approach.The optimization of a HICxRPLC-UV/MS method for the exhaustive characterization of an antibody-drug conjugate is achieved highlighting the high complementarity of the different detection modes used both in 1D and 2D. Finally, a proof of concept concerning the implementation of RPLCxSFC coupling is achieved with the aim of increasing the separation space coverage for neutral compounds. The optimized RPLCxSFC separation is then compared with an optimized RPLCxRPLC approach for the analysis of a bio-oil sample showing that RPLCxSFC is a credible alternative for the separation of such a sample
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Separace azaarénů vysoceúčinnou kapalinovou chromatografií / Separation of Azaarenes by High Performance Liguid ChromatographyKočí, Kamila January 2008 (has links)
Under the framework of this PhD project, a study on chromatographic behaviour of selected azaarenes on octadecylsilica stationary phases during their separation by reversed phase liquid chromatography was developed. The main goal was aimed at an application of the basic RPLC principles on the retention behaviour of azaarenes including the effects such as peak tailing, peak broadening, irreproducible retention or strong retention on a stationary phase. This study was particularly focused on basic azaarenes, also called acridines, which belong to a group of persistent organic pollutants providing mutagenic and/or carcinogenic activity. The retention patterns were studied on a group of eight acridines that are often present in environmental samples polluted with polycyclic aromatic compounds. The mixture of acridines was separated under isocratic elution conditions on three octadecylsilica stationary phases using two different binary mixtures as a mobile phase. Evaluation of the surface properties of the selected stationary phases was firstly performed, followed by the separation experiments. The structure of the experiments was designed to evaluate the effect of three different factors on the retention behaviour of acridines: properties of a stationary phase, composition of a mobile phase and physical-chemical properties of acridines. The treatment of the results was based on the capacity factor values providing the best fitting and repeatability of data, but other parameters that evaluate thermodynamic and kinetic aspects of the separation process were also given. Simple correlations between the three factors and a character of retention mechanism of acridines on the given separation system were found. Application of this knowledge simplifies an optimisation process and helps to solve common separation problems for acridines, but also for other basic analytes displaying similar physical-chemical properties (Mr and pKa).
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Développement de méthodes bidimensionnelles en ligne LCxLC-MS pour l'analyse de composés chargésD'Attoma, Amélie 19 November 2013 (has links) (PDF)
Ce manuscrit expose le développement de méthodes bidimensionnelles en ligne pour l'analyse de composés chargés en couplage avec la spectrométrie de masse. Le contexte de l'étude et les principes théoriques de la chromatographie en phase liquide unidimensionnelle et bidimensionnelle sont tout d'abord présentés. Les conditions expérimentales telles que l'instrumentation, les colonnes, les composés étudiés sont détaillés. Des études unidimensionnelles ont été effectuées afin de connaître le comportement cinétique des petites molécules ionisables et des peptides selon la phase mobile et la température. L'orthogonalité de systèmes chromatographiques et les capacités de pics générées ont ensuite été étudiés afin de connaître les conditions expérimentales les plus intéressantes pour l'analyse des composés chargés. Les comparaisons de systèmes ont été effectuées avec de nouveaux descripteurs d'orthogonalité et de capacité de pic effective qui ont été établit. Les systèmes bidimensionnels LCxLC ont ensuite été mis en place. L'utilité d'un split pour réduire le volume injecté en seconde dimension est envisagée. Des limites en termes de volume injecté dans la seconde dimension ont été définies en RPLC et en HILIC. Des mélanges de peptides ont été séparés par RPLCxRPLC(-MS), RPLCxHILIC(-MS) et HILICxRPLC. Le couplage avec la spectrométrie de masse est optimisé. L'intérêt des séparations bidimensionnelles est mis en évidence par rapport à des séparations LC-MS classiques
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Nonlinear Spectroscopic Investigation of Adsorption to C-18 Model Stationary PhasePeterson, Anthony D. 11 December 2013 (has links) (PDF)
Reversed-phase liquid chromatography (RPLC) is a commonly used separation technique in chemistry. Nevertheless, the mechanistic interactions at the molecular level among the eluent, analyte, and the stationary phase are not fully understood. Because of this limited understanding, optimization of the separation must be done experimentally. Learning more about molecular interactions should aid in improving separations. We are currently using second-harmonic generation (SHG) spectroscopy to investigate how analytes adsorb to the surface. SHG is a spectroscopic technique that produces signal only at places of non-isotropic symmetry; this typically occurs at surfaces. SHG can be used to produce surface isotherms of test analytes adsorbed to a model C18 stationary phase surface. Fitting these isotherms with a Langmuir model produces an adsorption equilibrium constant. However, the equilibrium constant can only be accurately determined if the true bulk concentration is known; this thesis describes an approach to ensure this. The equilibrium constant relates to Gibbs free energy and is the start to obtaining other thermodynamic information. The long equilibration times of analytes with the stationary phase observed in this study emphasize the importance of both thermodynamic information and kinetic values for understanding retention. Once equilibrium constants and other parameters are accurately obtained, this information can be used to improve predictions and calculations from numerical models.
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Investigation of Adsorption and Retention of Charged Compounds In RPLC / Undersökning av adsorption och retention hos laddade substanser i RPLCFryxelius, Emma January 2022 (has links)
The adsorption isotherm of two weak bases, Promethazine hydrochloride and Propranolol hydrochloride, were determined with isocratic reversed-phase liquid chromatography, with a 60 w% methanol in 20 mM sodium acetate buffer pH 4 as the mobile phase, and calculated by the elution by characteristic points method. The data obtained from the method were then fitted into the Langmuir isotherm and the electrostatically modified Langmuir. Propranolol fitted reasonably good into the models while Promethazine was not as good. When Promethazine and Propranolol were together in the same sample, there was indication of competition of the adsorption sites. For comparing retention and peak shape between a C18 column and a mixed mode column, Waters XBridge C18 and Thermo Scientific Acclaim WCX-1, were tested in gradient elution with 11.32 mM sodium acetate buffer and 10–70 % methanol. The mixed-mode column gave significantly better peak shapes, while the retention time were longer compared to the C18 column. / Adsorptions-isotermerna för två svaga baser, Prometazin hydroklorid och Propranolol hydroklorid, bestämdes med isokratisk omvänd-fas vätskekromatografi, med w% 60 metanol i en 20 mM natriumacetatbuffert pH 4 som mobil fas, och beräknad med metoden elution by characteristic points. Från metoden erhållna data passades till Langmuir isotherm och den elektrostatiskt modifierade Langmuir. Propanolen passade ganska bra till de olika isotermerna, medan Prometazin var något sämre passad. När Prometazin och Propranolol var tillsammans i samma prov, fanns det indikationer på konkurrens om adsorptionsställen. För jämförelse av topparnas form och retentionstid mellan en C18-kolonn och en mixed-mode-kolonn, användes Waters XBridge C18 och Thermo Scientific Acclaim WCX-1, som testades i gradient eluering med 11, 32 mM natriumacetatbuffert och 10–70 % metanol. Mixed-mode-kolonnen gav åtskilligt bättre toppar, medan retentionstiden var längre jämfört med C18-kolonnen.
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Methylammonium Formate as a Mobile Phase Modifier for Reversed Phase Liquid ChromatographyGrossman, Shau 06 August 2008 (has links)
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