Relaxin (RLN2) promotes cell migration/invasion, cell growth, and neoangiogenesis through binding to the relaxin receptor RXFP1 in many types of cancers. However, there have been no studies to determine the role of this system in brain tumors, especially in Glioblastoma Multiforme (GB), the most lethal primary brain tumor in adults. GB is a systemic brain disease and aggressively invades brain tissue. In this study, we have identified RXFP1 receptor, but not RLN2, in GB cell lines and primary GB cells from patients. RLN2 treatment resulted in a significant increase in migration of GB cell line and primary GB cells. To determine molecular mechanisms that facilitate RXFP1-mediated migration in GB cells, we employed a pseudopodia assay and 2D LC-MS/MS to investigate the protein composition at cell protrusions (pseudopodia) during GB cell migration. We also observed the expression of known mediators promoting tissue invasion upon RLN2 treatment. We identified PGRMC1, a candidate protein from 2D LC-MS/MS as a novel relaxin target protein in RXFP1-expressing brain tumor cells. RLN2 treatment also caused an increase in cathepsin (cath)-B and -L and enhanced production of as the small Rho-GTPases Rac1 and Cdc42 in GB cells. Collectively, these findings indicate that RXFP1-induced cell migration is mediated by the upregulation and intracellular actions of Rac1, Cdc42 and by cath-B and cath–L who serve as matrix modulating factors to facilitate brain tumor cells migration. PGRMC1 also contributes to RXFP1-mediated cell migration through an as yet unknown mechanism. RLN2 is not present in the brain. We determined the role of a peptide ligand of RXFP1, the newly discovered C1q/TNF related peptide (CTRP)8-derived P74 peptide, in promoting migration in GB cells. Similar to relaxin, P74 was found to have pro-migratory effects on GB cells. The biological activity of this peptide was also similar to relaxin and caused the upregulation of cath-B, cath-D and cath-L in the primary GB cells, thus, indicating that P74 might serve as a novel RXFP1 activating peptide ligand. We conclude that RXFP1 receptor signaling plays a key role in brain tumors cell migration and invasion.

Relaxin (RLN2) promotes cell migration/invasion, cell growth, and neoangiogenesis through binding to the relaxin receptor RXFP1 in many types of cancers. However, there have been no studies to determine the role of this system in brain tumors, especially in Glioblastoma Multiforme (GB), the most lethal primary brain tumor in adults. GB is a systemic brain disease and aggressively invades brain tissue. In this study, we have identified RXFP1 receptor, but not RLN2, in GB cell lines and primary GB cells from patients. RLN2 treatment resulted in a significant increase in migration of GB cell line and primary GB cells. To determine molecular mechanisms that facilitate RXFP1-mediated migration in GB cells, we employed a pseudopodia assay and 2D LC-MS/MS to investigate the protein composition at cell protrusions (pseudopodia) during GB cell migration. We also observed the expression of known mediators promoting tissue invasion upon RLN2 treatment. We identified PGRMC1, a candidate protein from 2D LC-MS/MS as a novel relaxin target protein in RXFP1-expressing brain tumor cells. RLN2 treatment also caused an increase in cathepsin (cath)-B and -L and enhanced production of as the small Rho-GTPases Rac1 and Cdc42 in GB cells. Collectively, these findings indicate that RXFP1-induced cell migration is mediated by the upregulation and intracellular actions of Rac1, Cdc42 and by cath-B and cath–L who serve as matrix modulating factors to facilitate brain tumor cells migration. PGRMC1 also contributes to RXFP1-mediated cell migration through an as yet unknown mechanism. RLN2 is not present in the brain. We determined the role of a peptide ligand of RXFP1, the newly discovered C1q/TNF related peptide (CTRP)8-derived P74 peptide, in promoting migration in GB cells. Similar to relaxin, P74 was found to have pro-migratory effects on GB cells. The biological activity of this peptide was also similar to relaxin and caused the upregulation of cath-B, cath-D and cath-L in the primary GB cells, thus, indicating that P74 might serve as a novel RXFP1 activating peptide ligand. We conclude that RXFP1 receptor signaling plays a key role in brain tumors cell migration and invasion.

Canine Mammatumoren (CMT) sind eine der häufigsten Todesursachen bei Hündinnen (SIMON et al. 2001). Durch ihre periphere Lage sind zumeist nicht die Primärtumoren, sondern ihre Metastasen lebensbedrohlich, da diese häufig wichtige Organe wie Lunge Herz und Gehirn befallen (CLEMENTE et al. 2010). Aktuell angewandte Untersuchungsmethoden zur Erkennung von Metastasierung können entweder das invasive Wachstum beschreiben oder bereits bestehende Metastasen detektieren, jedoch fehlen bislang molekulare Marker, die frühzeitig und zuverlässig das metastatische Potential eines CMT anzeigen bevor Metastasen aufgetreten sind. Das Peptidhormon Relaxin ist in zahlreichen physiologischen und pathologischen Situationen beim Menschen als ein Induktor von Matrixmetalloproteinasen (MMP) bekannt (TOO et al. 1984; UNEMORI und AMENTO 1990; PALEJWALA et al. 2001; BINDER et al. 2002; KLONISCH et al. 2007; HENNEMAN et al. 2008). MMP sind Schlüsselenzyme des Bindegewebsabbaus, der jeder Metastasierung vorausgehen muss (WOODHOUSE et al. 1997). Bei der Frau ist im Blut messbares Relaxin ein Marker für metastatischen Brustkrebs (BINDER et al. 2004), für die Hündin scheint dagegen der Relaxinblutspiegel nicht aussagekräftig zu sein (SCHWEIZER 2010). Möglicherweise wird aber Relaxin lokal im caninen Mammagewebe exprimiert wie von GOLDSMITH et al. (1994) und SILVERTOWN et al. (2003) postuliert, so dass es wie in humanen Tumoren auto- oder parakrin Invasivität und Metastasierung (KLONISCH et al. 2007) fördern könnte. Daher sollte in der vorliegenden Arbeit die intratumorale Expression des Relaxins und seiner Rezeptoren sowie bekannter Faktoren des Bindegewebsabbaus untersucht und auf ihre prognostische Eignung überprüft werden. In zwei Studienabschnitten (LAMP et al. 2009; LAMP et al. 2011) wurden CMT-Gewebeproben von n=31 (LAMP et al. 2009) respektive n=59 Hündinnen (LAMP et al. 2011) mittels quantitativer Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) auf ihre Expression von Relaxin, seinen Rezeptoren, RXFP1 und RXFP2, sowie den Matrixmetalloproteinasen MMP-1, -2, -3, -9 und MMP-13, den Östradiolrezeptoren, ERα und ERβ, und dem Progesteronrezeptor (PR) analysiert. In beiden Studienabschnitten wurden die Plasmakonzentrationen der Hormone Relaxin, Östradiol und Progesteron auf mögliche Zusammenhänge mit der lokalen Genexpression überprüft. Im zweiten Studienabschnitt (LAMP et al. 2011) wurde darüber hinaus die Expression von Relaxin und RXFP1 auch immunhistologisch an n=9 CMT-Proben untersucht und in einer Multivarianzanalyse die prognostische Eignung aller untersuchten Parameter getestet. Die Expressionsanalyse konnte zeigen, dass CMT sowohl ein bisher unbekannter Ort der Relaxinexpression beim Hund sind als auch den Hauptrezeptor des Relaxins, RXFP1, exprimieren. Diese Ergebnisse der mRNA-Untersuchung ließen sich immunhistologisch bestätigen. Darüber hinaus ergab die immunhistologische Untersuchung, dass Relaxin vorwiegend im myoepithelialen Anteil der untersuchten CMT exprimiert wird. In den epithelialen CMT-Zellen fand sich die stärkste RXFP1-Reaktivität, so dass RXFP1 mit der von anderen Autoren beschriebenen MMP-2- und MMP-9-Expression in epithelialen Zellen kolokalisiert ist (PAPPARELLA et al. 1997; HIRAYAMA et al. 2002; PAPPARELLA et al. 2002). Die quantitativen Expressionsanalysen zeigten Korrelationen der Expressionsintensitäten von Relaxin, RXFP1 und MMP-2 auf. Die RXFP1 Expression war in dieser Studie sogar ein unabhängiger Marker für Metastasierung mit einem 15-fach höheren Risiko für Metastasierung für Patienten mit einer Expression oberhalb des studienspezifischen Cut-Offs. Alle untersuchten lokalen Genexpressionen waren von den systemischen Plasmakonzentrationen von Relaxin, Östradiol und Progesteron unabhängig. Die Resultate legen eine Bedeutung des intratumoral exprimierten Relaxins für eine auto- oder parakrine Steuerung der MMP-Expression, die für Invasivität und Metastasierung wichtig ist, nahe. Aufgrund des mRNA-Nachweises, der Kolokalisation der Proteine von RXFP1 und MMP-2 und -9 sowie der Korrelation der Genexpression von Ligand (Relaxin), Rezeptor (RXFP1) und Effektormolekül (MMP-2) ist es wahrscheinlich, dass CMT über das Relaxin eine autonome Steuerung ihrer Invasivität vornehmen können. RXFP1 scheint dabei eine Regulationsfunktion in der Relaxinsensibilität der CMT-Zelle zuzukommen, die in Zukunft durch die Messung der RXFP1-Expressionsintensität prognostisch nutzbar sein könnte. Zudem ist RXFP1 im CMT damit auch ein möglicher Ansatzpunkt für eine neue, auf Relaxinanaloga basierende, antimetastatische Therapie, die bereits an humanen Tumorzellen und in Mausmodellen erprobt wird (FENG et al. 2007; HOSSAIN et al. 2010). Durch den Nachweis von Relaxin und RXFP1 im CMT und ihre wahrscheinliche Relevanz für die Metastasierung ergeben sich somit neue Möglichkeiten für eine exaktere Prognose und verbesserte antimetastatische Therapie von CMT sowie die Chance, den Hund als Modell für die Erforschung Relaxin basierter Therapien des humanen Brustkrebses zu nutzen. / Canine mammary tumours (CMT) are one of the main reasons of death in female dogs (SIMON et al. 2001). Due to its peripheral location, it is normally not the primary tumour, but its metastases, which are life-threatening as they often impair the function of vital organs, such as lung, heart or brain (CLEMENTE et al. 2010). Currently used techniques for the detection of metastasis can either barely describe invasive growth patterns or detect already existing metastases. Molecular markers to determine the metastatic potential early and reliably, before metastatic spreading has occurred, are still lacking. The peptide hormone relaxin is well known as an inductor of matrix metalloproteinases (MMP) in numerous physiological as well as pathological situations in humans (TOO et al. 1984; UNEMORI und AMENTO 1990; PALEJWALA et al. 2001; BINDER et al. 2002; KLONISCH et al. 2007; HENNEMAN et al. 2008). MMP are key-enzymes of connective tissue remodelling which is a prerequisite for metastasis (WOODHOUSE et al. 1997). In women, the plasma relaxin concentration is a marker for metastatic breast cancer (BINDER et al. 2004). However, in dogs, the concentration of circulating relaxin seems to have no diagnostic value (SCHWEIZER 2010). But, possibly relaxin is expressed locally in the canine mammary tissue as postulated by GOLDSMITH et al. (1994) and SILVERTOWN et al. (2003) and it could therefore act as a pro-invasive and pro-metastatic factor in an auto- or paracrine manner as it does in various human tumours (KLONISCH et al. 2007). Thus, the present study should examine the intratumoural expression of relaxin and its receptors as well as factors of connective tissue remodelling and evaluate their prognostic abilities. In two sections of the study (LAMP et al. 2009; LAMP et al. 2011), CMT-tissue samples from n=31 bitches (LAMP et al. 2009) and n=59 bitches (LAMP et al. 2011), respectively, were analysed for their expression of relaxin, its receptors RXFP1 and RXFP2, MMP-1, -2, -3, -9 and MMP-13 as well as the oestradiol receptors ERα and ERβ and the progesterone receptor (PR) using quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR). Additionally, the plasma concentrations of the hormones relaxin, oestradiol and progesterone were tested for possible connections with the local gene expression. In the second section of the study, the expression of relaxin and RXFP1 was also examined immunohistologically in n=9 CMT tissue samples (LAMP et al. 2011) and the prognostic value of all parameters examined was assessed by a multivariate analysis. The expression analysis showed that CMTs are a novel site of expression of relaxin and its main receptor RXFP1 in the dog. These results were confirmed by the immunohistological examination. Moreover, the immunohistological analysis demonstrated that relaxin seems to be expressed mainly in myoepithelial cells. However, the strongest signals for RXFP1 were located in epithelial cells of the CMT, thus RXFP1 is colocalised with the expression of MMP-2 and MMP-9 reported in epithelial CMT-cells (PAPPARELLA et al. 1997; HIRAYAMA et al. 2002; PAPPARELLA et al. 2002). The quantitative expression analysis revealed correlations of expression intensities for relaxin, RXFP1 and MMP-2. The expression of RXFP1 presented as an independent marker for metastasis with a 15-fold risk increase for patients with an expression intensity above the study-specific cut-off. All local gene expressions examined where independent from systemic plasma concentrations of relaxin, oestradiol and progesterone. The results propose an important role for intratumourally expressed relaxin as an auto- or paracrine modulator of MMP expression, which is important for invasiveness and metastasis. Due to the mRNA detection, the protein colocalisation of RXFP1 with MMP-2 and MMP-9 as well as the correlation of gene expressions of the ligand (relaxin), the receptor (RXFP1) and the effector (MMP-2) it is highly probable that CMT can autonomously regulate their invasiveness via locally expressed relaxin. RXFP1 seems to have a regulatory function in the relaxin responsiveness of CMT cells, which may be of prognostical use in the future. In addition, RXFP1 is also a possible target for a novel antimetastatic therapy based on relaxin analoga which has been tested in human tumour cells and mice (FENG et al. 2007; HOSSAIN et al. 2010). The detection of relaxin and RXFP1 in the CMT and their probable relevance for metastasis could be a basis for a more precise prognosis of CMT, improved anti-metastatic therapies in the dog and the use of the dog as a model for relaxin-based therapies of human breast cancer.

Canine Mammatumoren (CMT) sind eine der häufigsten Todesursachen bei Hündinnen (SIMON et al. 2001). Durch ihre periphere Lage sind zumeist nicht die Primärtumoren, sondern ihre Metastasen lebensbedrohlich, da diese häufig wichtige Organe wie Lunge Herz und Gehirn befallen (CLEMENTE et al. 2010). Aktuell angewandte Untersuchungsmethoden zur Erkennung von Metastasierung können entweder das invasive Wachstum beschreiben oder bereits bestehende Metastasen detektieren, jedoch fehlen bislang molekulare Marker, die frühzeitig und zuverlässig das metastatische Potential eines CMT anzeigen bevor Metastasen aufgetreten sind. Das Peptidhormon Relaxin ist in zahlreichen physiologischen und pathologischen Situationen beim Menschen als ein Induktor von Matrixmetalloproteinasen (MMP) bekannt (TOO et al. 1984; UNEMORI und AMENTO 1990; PALEJWALA et al. 2001; BINDER et al. 2002; KLONISCH et al. 2007; HENNEMAN et al. 2008). MMP sind Schlüsselenzyme des Bindegewebsabbaus, der jeder Metastasierung vorausgehen muss (WOODHOUSE et al. 1997). Bei der Frau ist im Blut messbares Relaxin ein Marker für metastatischen Brustkrebs (BINDER et al. 2004), für die Hündin scheint dagegen der Relaxinblutspiegel nicht aussagekräftig zu sein (SCHWEIZER 2010). Möglicherweise wird aber Relaxin lokal im caninen Mammagewebe exprimiert wie von GOLDSMITH et al. (1994) und SILVERTOWN et al. (2003) postuliert, so dass es wie in humanen Tumoren auto- oder parakrin Invasivität und Metastasierung (KLONISCH et al. 2007) fördern könnte. Daher sollte in der vorliegenden Arbeit die intratumorale Expression des Relaxins und seiner Rezeptoren sowie bekannter Faktoren des Bindegewebsabbaus untersucht und auf ihre prognostische Eignung überprüft werden. In zwei Studienabschnitten (LAMP et al. 2009; LAMP et al. 2011) wurden CMT-Gewebeproben von n=31 (LAMP et al. 2009) respektive n=59 Hündinnen (LAMP et al. 2011) mittels quantitativer Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) auf ihre Expression von Relaxin, seinen Rezeptoren, RXFP1 und RXFP2, sowie den Matrixmetalloproteinasen MMP-1, -2, -3, -9 und MMP-13, den Östradiolrezeptoren, ERα und ERβ, und dem Progesteronrezeptor (PR) analysiert. In beiden Studienabschnitten wurden die Plasmakonzentrationen der Hormone Relaxin, Östradiol und Progesteron auf mögliche Zusammenhänge mit der lokalen Genexpression überprüft. Im zweiten Studienabschnitt (LAMP et al. 2011) wurde darüber hinaus die Expression von Relaxin und RXFP1 auch immunhistologisch an n=9 CMT-Proben untersucht und in einer Multivarianzanalyse die prognostische Eignung aller untersuchten Parameter getestet. Die Expressionsanalyse konnte zeigen, dass CMT sowohl ein bisher unbekannter Ort der Relaxinexpression beim Hund sind als auch den Hauptrezeptor des Relaxins, RXFP1, exprimieren. Diese Ergebnisse der mRNA-Untersuchung ließen sich immunhistologisch bestätigen. Darüber hinaus ergab die immunhistologische Untersuchung, dass Relaxin vorwiegend im myoepithelialen Anteil der untersuchten CMT exprimiert wird. In den epithelialen CMT-Zellen fand sich die stärkste RXFP1-Reaktivität, so dass RXFP1 mit der von anderen Autoren beschriebenen MMP-2- und MMP-9-Expression in epithelialen Zellen kolokalisiert ist (PAPPARELLA et al. 1997; HIRAYAMA et al. 2002; PAPPARELLA et al. 2002). Die quantitativen Expressionsanalysen zeigten Korrelationen der Expressionsintensitäten von Relaxin, RXFP1 und MMP-2 auf. Die RXFP1 Expression war in dieser Studie sogar ein unabhängiger Marker für Metastasierung mit einem 15-fach höheren Risiko für Metastasierung für Patienten mit einer Expression oberhalb des studienspezifischen Cut-Offs. Alle untersuchten lokalen Genexpressionen waren von den systemischen Plasmakonzentrationen von Relaxin, Östradiol und Progesteron unabhängig. Die Resultate legen eine Bedeutung des intratumoral exprimierten Relaxins für eine auto- oder parakrine Steuerung der MMP-Expression, die für Invasivität und Metastasierung wichtig ist, nahe. Aufgrund des mRNA-Nachweises, der Kolokalisation der Proteine von RXFP1 und MMP-2 und -9 sowie der Korrelation der Genexpression von Ligand (Relaxin), Rezeptor (RXFP1) und Effektormolekül (MMP-2) ist es wahrscheinlich, dass CMT über das Relaxin eine autonome Steuerung ihrer Invasivität vornehmen können. RXFP1 scheint dabei eine Regulationsfunktion in der Relaxinsensibilität der CMT-Zelle zuzukommen, die in Zukunft durch die Messung der RXFP1-Expressionsintensität prognostisch nutzbar sein könnte. Zudem ist RXFP1 im CMT damit auch ein möglicher Ansatzpunkt für eine neue, auf Relaxinanaloga basierende, antimetastatische Therapie, die bereits an humanen Tumorzellen und in Mausmodellen erprobt wird (FENG et al. 2007; HOSSAIN et al. 2010). Durch den Nachweis von Relaxin und RXFP1 im CMT und ihre wahrscheinliche Relevanz für die Metastasierung ergeben sich somit neue Möglichkeiten für eine exaktere Prognose und verbesserte antimetastatische Therapie von CMT sowie die Chance, den Hund als Modell für die Erforschung Relaxin basierter Therapien des humanen Brustkrebses zu nutzen. / Canine mammary tumours (CMT) are one of the main reasons of death in female dogs (SIMON et al. 2001). Due to its peripheral location, it is normally not the primary tumour, but its metastases, which are life-threatening as they often impair the function of vital organs, such as lung, heart or brain (CLEMENTE et al. 2010). Currently used techniques for the detection of metastasis can either barely describe invasive growth patterns or detect already existing metastases. Molecular markers to determine the metastatic potential early and reliably, before metastatic spreading has occurred, are still lacking. The peptide hormone relaxin is well known as an inductor of matrix metalloproteinases (MMP) in numerous physiological as well as pathological situations in humans (TOO et al. 1984; UNEMORI und AMENTO 1990; PALEJWALA et al. 2001; BINDER et al. 2002; KLONISCH et al. 2007; HENNEMAN et al. 2008). MMP are key-enzymes of connective tissue remodelling which is a prerequisite for metastasis (WOODHOUSE et al. 1997). In women, the plasma relaxin concentration is a marker for metastatic breast cancer (BINDER et al. 2004). However, in dogs, the concentration of circulating relaxin seems to have no diagnostic value (SCHWEIZER 2010). But, possibly relaxin is expressed locally in the canine mammary tissue as postulated by GOLDSMITH et al. (1994) and SILVERTOWN et al. (2003) and it could therefore act as a pro-invasive and pro-metastatic factor in an auto- or paracrine manner as it does in various human tumours (KLONISCH et al. 2007). Thus, the present study should examine the intratumoural expression of relaxin and its receptors as well as factors of connective tissue remodelling and evaluate their prognostic abilities. In two sections of the study (LAMP et al. 2009; LAMP et al. 2011), CMT-tissue samples from n=31 bitches (LAMP et al. 2009) and n=59 bitches (LAMP et al. 2011), respectively, were analysed for their expression of relaxin, its receptors RXFP1 and RXFP2, MMP-1, -2, -3, -9 and MMP-13 as well as the oestradiol receptors ERα and ERβ and the progesterone receptor (PR) using quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR). Additionally, the plasma concentrations of the hormones relaxin, oestradiol and progesterone were tested for possible connections with the local gene expression. In the second section of the study, the expression of relaxin and RXFP1 was also examined immunohistologically in n=9 CMT tissue samples (LAMP et al. 2011) and the prognostic value of all parameters examined was assessed by a multivariate analysis. The expression analysis showed that CMTs are a novel site of expression of relaxin and its main receptor RXFP1 in the dog. These results were confirmed by the immunohistological examination. Moreover, the immunohistological analysis demonstrated that relaxin seems to be expressed mainly in myoepithelial cells. However, the strongest signals for RXFP1 were located in epithelial cells of the CMT, thus RXFP1 is colocalised with the expression of MMP-2 and MMP-9 reported in epithelial CMT-cells (PAPPARELLA et al. 1997; HIRAYAMA et al. 2002; PAPPARELLA et al. 2002). The quantitative expression analysis revealed correlations of expression intensities for relaxin, RXFP1 and MMP-2. The expression of RXFP1 presented as an independent marker for metastasis with a 15-fold risk increase for patients with an expression intensity above the study-specific cut-off. All local gene expressions examined where independent from systemic plasma concentrations of relaxin, oestradiol and progesterone. The results propose an important role for intratumourally expressed relaxin as an auto- or paracrine modulator of MMP expression, which is important for invasiveness and metastasis. Due to the mRNA detection, the protein colocalisation of RXFP1 with MMP-2 and MMP-9 as well as the correlation of gene expressions of the ligand (relaxin), the receptor (RXFP1) and the effector (MMP-2) it is highly probable that CMT can autonomously regulate their invasiveness via locally expressed relaxin. RXFP1 seems to have a regulatory function in the relaxin responsiveness of CMT cells, which may be of prognostical use in the future. In addition, RXFP1 is also a possible target for a novel antimetastatic therapy based on relaxin analoga which has been tested in human tumour cells and mice (FENG et al. 2007; HOSSAIN et al. 2010). The detection of relaxin and RXFP1 in the CMT and their probable relevance for metastasis could be a basis for a more precise prognosis of CMT, improved anti-metastatic therapies in the dog and the use of the dog as a model for relaxin-based therapies of human breast cancer.

Relaxin and insulin-like peptide-3 (INSL3) are closely related reproductive hormones that are derived from a common ancestor. Relaxin was initially named for its ability to relax the pubic symphysis in pregnant guinea pigs at parturition. Since then relaxin has been found to be involved in many physiological processes based on its ability to stimulate the breakdown and remodeling of collagen fibers. INSL3 is also known as Leydig insulin-like hormone and the relaxin-like factor, and is produced by the Leydig cells in the testis, the thecal and luteal cells of the ovary, the thyroid, placenta and mammary gland. INSL3 induces transabdominal testicular descent by stimulating the development of the gubernacular ligament, which subsequently swells and contracts to pull the fetal testes towards the inguinal wall. In adults however, evidence suggests that INSL3 is involved in reproductive function, acting to promote the survival of male and female germ cells.