The genus Phytophthora contains a large number of species that are known plant pathogens of a variety of important crops. Phytophthora sojae, a hemibiotroph, causes approximately 1-2 billion dollars (US) of lost soybean world-wide each year. P. infestans, the causative agent of the Irish potato famine, is responsible for over 5 billion dollars (US) worth of lost potato each year. These destructive plant pathogens facilitate pathogenesis through the use of small secreted proteins known as effector proteins. A large subset of effector proteins is able to translocate into host cells and target plant defense pathways. P. sojae Avr1b is able to suppress cell death triggered by BAX and hydrogen peroxide. The W-domain of Avr1b is responsible for this functionality, and is recognized by the Rps1b gene product to induce effector triggered immunity. These oomycete effector proteins translocate into host cells via a highly conserved N-terminal motif known as RXLR-dEER without the use of any pathogen encoded machinery. In fungi an RXLR-like motif exists, [R,K,H] X [L,F,Y,M,~I] X, that is able to facilitate translocation without pathogen encoded machinery. Both functional RXLR and RXLR-like motifs are able to bind phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns- 3-P) to mediate entry into host cells. The use of novel inhibitory mechanisms has shown effector entry can be blocked either by sequestering PtdIns-3-P on the outer leaflet of plant and animal cells or by competitive inhibition of the binding pocket of the RXLR or RXLR-like motifs. / Ph. D.

Diverse pathogens secrete effector proteins into plant cells to manipulate host cellular processes. The genome of Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa), the causative agent of downy mildew of Arabidopsis, contains at least 134 candidate RXLR effector genes. These genes contain an RXLR motif required for effector entry into host cells. Only a small subset of these candidate effectors is conserved in related oomycetes. Here, we describe a comparative functional characterization of the Hpa RXLR effector HaRxL96 and a homologous gene, PsAvh163, from the soybean pathogen Phytophthora sojae. HaRxL96 and PsAvh163 are induced during early stages of infection and carry a functional RXLR motif that is sufficient for protein uptake into plant cells. Both effectors can suppress or activate immune responses in soybean, Nicotiana, and Arabidopsis. Several SA-responsive defense genes are suppressed in Arabidopsis Col:HaRxL96 and Col:PsAvh163 during an incompatible interaction with Hpa Emoy2. Both effectors are localized to the nucleus and cytoplasm of plant cells. Nuclear localization of both effectors is required for proper virulence functions, including suppression of basal resistance and RPP4-mediated immunity to virulent and avirulent Hpa, respectively. In addition, both effectors interact with plant U-box (PUB) proteins that are conserved between diverse plant species. The targeted PUB proteins are negative regulators of plant immunity in Arabidopsis. These experiments demonstrate that evolutionarily-conserved effectors from different oomycete species can suppress immunity in plant species that are divergent from the source pathogen's primary host. / Ph. D.

L'agriculture mondiale a connu de profonds changements qui lui ont permis de faire face à l'augmentation constante de la demande alimentaire. Cependant, les conséquences de ces nouvelles pratiques agricoles sur l'environnement et la santé humaine font l'objet de préoccupations croissantes. Notamment, les politiques sanitaires actuelles visent à réduire l'utilisation des produits phytosanitaires. Aussi de nouvelles stratégies de protection des cultures doivent-elles être développées. Une meilleure compréhension des échanges moléculaires qui contribuent au succès des bioagresseurs est nécessaire. Ces échanges impliquent notamment la sécrétion de protéines qui interfèrent avec le métabolisme de l'hôte : les effecteurs. Certains d'entre elles sont accumulés au cours de la pénétration des premières cellules végétales, une étape décisive pour le succès de la tentative d'infection. Les travaux menés au cours de cette thèse se sont concentrés sur 3 de ces effecteurs, sécrétés par l'oomycète Phytophthora parasitica. L'analyse des lignées de surexpression chez Arabidopsis thaliana a permis de mettre en évidence des perturbations du développement et de la physiologie de certaines hormones végétales en réponse à l'accumulation de ces effecteurs. Ces données confirment l'importance de la manipulation des voies hormonales dans le cadre des interactions plantes-pathogènes et soutiennent l'hypothèse récente selon laquelle des effecteurs sécrétés par les agents pathogènes interfèrent avec un petit nombre de cibles clefs du métabolisme de l'hôte. Ces cibles constituent des candidats de choix pour développer des variétés plus résistantes. / Agriculture has undergone deep changes that have allowed to cope with the ever-increasing demand for food. However, the consequences of the new agricultural practices on the environment and human health are the subject of increasing concern. Notably, current health policies aimed at reducing the use of pesticides in agriculture. Thus, new strategies need to be developed for efficient crop protection. In particular, a better understanding of molecular exchanges that contribute to the success of pathogens is required. These exchanges include the secretion of proteins that interfere with host metabolism : the effectors. Some of them are accumulated during the penetration of the first plant cells, a crucial step for the success of the infection attempt. This thesis work focused on three of these effectors, secreted by the oomycete Phytophthora parasitica. The analysis of transgenic Arabidopsis thaliana lines highlighted perturbations of plant development and hormone physiology in response to the accumulation of these effectors. These data confirm the pivotal role of hormonal balance during plant-pathogen interactions and support the recent hypothesis that effectors secreted by evolutionarily distant plant pathogens interfere with a small number of key target host metabolism. These targets are good candidates to develop varieties that are more resistant to infection.

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Des nouvelles résistances aux agents pathogènes introgressées dans les plantes cultivées sont fréquemment contournées dans différents pathosystèmes, engendrant des épidémies et des pertes économiques. En conséquence, la compréhension des stratégies évolutives impliquées dans l’adaptation des populations pathogènes est nécessaire pour améliorer la gestion durable des résistances. Bremia lactucae, agent pathogène de la laitue est un organisme diploïde, hétérothallique avec des cycles de reproduction sexuée et asexuée. Cet oomycète est soumis aux fortes pressions de sélection exercées par des gènes de résistance de la plante hôte. Sous cette pression de sélection, les populations de B. lactucae ont montré une rapide adaptation aux résistances hôtes qui se sont donc avérées peu durables. L’étude de la structure génétique d’un agent pathogène peut permettre de comprendre les mécanismes évolutifs impliqués dans le contournement des résistances variétales. Ainsi, une étude de la structure génétique (neutre et potentiellement soumise à sélection) des populations de B. lactucae en France a été conduite afin d’identifier les forces évolutives impliquées dans le contournement des résistances de l’hôte et de déterminer l’influence des pressions de sélection des gènes de résistance de la plante hôte sur cette structure. J’ai validé 12 microsatellites, marqueurs moléculaires neutres, pour analyser la structure génétique de B. lactucae en France. Plus de 800 isolats ont été prélevés dans les plus importants bassins de production de la plante hôte, Lactuca sativa. Ces isolats ont été prélevés sur différentes variétés regroupées selon leur combinaison de gènes de résistance. Par ailleurs, une prospection dans le compartiment sauvage a permis d’échantillonner des isolats de B. lactucae sur la plante hôte adventice L. serriola. Le polymorphisme de plusieurs effecteurs candidats à motif RxLR, a été étudié dans différentes populations de Bremia. La faible diversité génétique et l’excès d’hétérozygotie observés sont en faveur d’une reproduction clonale mais de rares évènements de reproduction sexuée sont également suggérés par les résultats. Par ailleurs, la faible différenciation génétique entre populations suggère des flux de gènes importants à l’échelle des régions. Des flux de gènes ont également été mis en évidence entre le pathosystème du compartiment sauvage et le pathosystème du compartiment cultivé évoquant un possible rôle de réservoir génétique des plantes hôtes adventices. Une structuration des populations en plusieurs lignées clonales résultant de la pression de sélection des gènes de résistance des cultivars est également indiquée par l’analyse des résultats des marqueurs neutres et sélectionnés. La caractérisation de la structure des populations de B. lactucae nous permet de mettre en évidence le fort potentiel évolutif (flux de gènes importants, système de reproduction mixe, sélection de mutants et de migrants par les gènes de résistance) de B. lactucae expliquant la rapide adaptation aux résistances hôtes. Ainsi, nous pouvons suggérer des pistes de gestion des gènes de résistance comme favoriser l’utilisation de résistances quantitatives et l’utilisation de cultures d’association afin d’améliorer la durabilité des résistances. / Resistance genes introgressed into cultivated plants are frequently overcame by pathogens, causing outbreaks and economic losses. Therefore, understanding the evolutionary strategies involved in the adaptation of pathogen populations is needed to improve the sustainable management of resistance. Bremia lactucae, the lettuce downy mildew, is under strong selection pressure exerted by host resistance genes. Under this selection pressure, B. lactucae populations showed a rapid adaptation to host resistance. The study of pathogen genetic structure may help to understand the evolutionary mechanisms involved in the overcoming of resistant genes. Study of the genetic structure (neutral and potentially selected markers) of B. lactucae populations in France was conducted in order to identify the evolutionary forces involved in the adaptation of the plant pathogen and to determine the influence of selective pressure of host resistance genes on the population structure. We developed 12 microsatellites markers, to study genetic structure of B. lactucae populations in France. Over 800 isolates were collected from the most important production areas of the host plant, Lactuca sativa. These isolates were taken from different cultivars grouped according to their resistance gene combinations. Moreover, a prospection in the wild compartment allowed sampling isolates of B. lactucae on the wild host L. serriola. The polymorphism of several RxLR candidate effectors was studied in several Bremia populations. Our results showed clonality in Bremia populations but rare events of sexual reproduction are also suggested. Weak genetic differentiation between populations suggested important gene flow between populations at French regional scale. Gene flow was also found between the wild and the crop pathosystems indicating a possible role of wild host plants as genetic reservoir. Moreover, analyzing the population genetic structure suggests the presence of different clonal lineages, resulting probably from selection pressure of resistance genes. Characterizing the population structure of B. lactucae allowed to highlight the strong evolutionary potential (significant gene flow, mixed mating system, selection by resistance genes) of B. lactucae explaining its rapid adaptation to host resistance. Thus, we can suggest some management strategies of resistance genes as promoting the use of quantitative resistance and use of crop association to improve the durability of resistance.

Le mildiou de la vigne est causé par l’oomycète Plasmopara viticola, qui s’attaque aux parties aériennes non-lignifiées affectant la production viticole. Une alternative à l’utilisation de pesticides est l’utilisation de variétés de vigne à la résistance durable, et un programme pour leur création par croisement entre espèces résistantes et la vigne cultivée, Vitis vinifera, est en cours. Ce programme nécessite l’identification de nouveaux gènes de résistance, ce que le projet vise à faire par (1) le criblage de vignes résistantes avec des effecteurs conservés chez P. viticola, (2) l’étude fonctionnelle d’effecteurs candidats. Le criblage de plantes résistantes n’a conduit à l’identification d’aucun nouveau facteur de résistance majeur. L’étude fonctionnelle d’effecteurs a permis la mise en évidence d’une nouvelle famille d’effecteurs chez P. viticola et a conduit à l’identification de deux effecteurs Pv33, nucléaire, et Pv47, associé au réticulum endoplasmique, qui induisent des défenses végétales. / Grapevine downy mildew is caused by the oomycete Plasmopara viticola, which attacks the aerial non-lignified tissues affecting wine production. An alternative to the use of pesticides is the use of vine varieties with sustainable resistances. A programme aiming to create such varieties by crossing resistant species with the cultivated grapevine, Vitis vinifera, is ongoing. Within this program requiring the indentification of new resistance genes, which the project aims to do by (1) screening resistant vines with effectors stored in P. viticola, (2) performing a functional study of candidate effectors. The screening of resistant plants did not lead to the identification of any new major resistance factors. The functional study of effectors revealed a new family of effectors in P. viticola and led to the identification of two effectors Pv33, nuclear, and Pv47, associated with the endoplasmic reticulum, which induce plant defences.

Des nouvelles résistances aux agents pathogènes introgressées dans les plantes cultivées sont fréquemment contournées dans différents pathosystèmes, engendrant des épidémies et des pertes économiques. En conséquence, la compréhension des stratégies évolutives impliquées dans l'adaptation des populations pathogènes est nécessaire pour améliorer la gestion durable des résistances. Bremia lactucae, agent pathogène de la laitue est un organisme diploïde, hétérothallique avec des cycles de reproduction sexuée et asexuée. Cet oomycète est soumis aux fortes pressions de sélection exercées par des gènes de résistance de la plante hôte. Sous cette pression de sélection, les populations de B. lactucae ont montré une rapide adaptation aux résistances hôtes qui se sont donc avérées peu durables. L'étude de la structure génétique d'un agent pathogène peut permettre de comprendre les mécanismes évolutifs impliqués dans le contournement des résistances variétales. Ainsi, une étude de la structure génétique (neutre et potentiellement soumise à sélection) des populations de B. lactucae en France a été conduite afin d'identifier les forces évolutives impliquées dans le contournement des résistances de l'hôte et de déterminer l'influence des pressions de sélection des gènes de résistance de la plante hôte sur cette structure. J'ai validé 12 microsatellites, marqueurs moléculaires neutres, pour analyser la structure génétique de B. lactucae en France. Plus de 800 isolats ont été prélevés dans les plus importants bassins de production de la plante hôte, Lactuca sativa. Ces isolats ont été prélevés sur différentes variétés regroupées selon leur combinaison de gènes de résistance. Par ailleurs, une prospection dans le compartiment sauvage a permis d'échantillonner des isolats de B. lactucae sur la plante hôte adventice L. serriola. Le polymorphisme de plusieurs effecteurs candidats à motif RxLR, a été étudié dans différentes populations de Bremia. La faible diversité génétique et l'excès d'hétérozygotie observés sont en faveur d'une reproduction clonale mais de rares évènements de reproduction sexuée sont également suggérés par les résultats. Par ailleurs, la faible différenciation génétique entre populations suggère des flux de gènes importants à l'échelle des régions. Des flux de gènes ont également été mis en évidence entre le pathosystème du compartiment sauvage et le pathosystème du compartiment cultivé évoquant un possible rôle de réservoir génétique des plantes hôtes adventices. Une structuration des populations en plusieurs lignées clonales résultant de la pression de sélection des gènes de résistance des cultivars est également indiquée par l'analyse des résultats des marqueurs neutres et sélectionnés. La caractérisation de la structure des populations de B. lactucae nous permet de mettre en évidence le fort potentiel évolutif (flux de gènes importants, système de reproduction mixe, sélection de mutants et de migrants par les gènes de résistance) de B. lactucae expliquant la rapide adaptation aux résistances hôtes. Ainsi, nous pouvons suggérer des pistes de gestion des gènes de résistance comme favoriser l'utilisation de résistances quantitatives et l'utilisation de cultures d'association afin d'améliorer la durabilité des résistances.

Disease outbreaks caused by oomycetes can be catastrophic. The first part of this dissertation describes development of a system to identify potential new and durable resistance (R) genes against P. sojae in soybean germplasm. We developed a system to screen soybean germplasm for genes that recognize core Phytophthora sojae RXLR effectors that are conserved within the pathogen species and essential for virulence. R genes that recognize these effectors will likely be effective and durable against diverse P. sojae isolates. We developed a system to deliver individual P. sojae effectors by Type III secretion into soybean using the bacterium Pseudomonas, and we screened 12 core effectors on a collection of 30 G. max lines that likely contain new resistance genes against P. sojae. We identified candidate R genes against 10 effectors. Genetic segregation ratios from crosses indicated that three of these genes have a simple inheritance pattern and would be amenable to breeding into elite cultivars. The second part of the dissertation involves use of a model plant-oomycete system to study the genetic basis of susceptibility to oomycete diseases. We compared host transcriptomes from a resistant and a susceptible infection of Arabidopsis thaliana by the downy mildew pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa). We identified five gene clusters with expression patterns specific to the susceptible interaction. Genes from each cluster were selected and null mutants were tested for altered susceptibility to virulent Hpa. Most A. thaliana null mutants showed enhanced disease susceptibility, suggesting their involvement in pattern-triggered immunity (PTI). A knockout mutant in the AtGcn5 gene was completely resistant to Hpa Emco5 suggesting that the gene/protein is necessary for Hpa to successfully colonize the plant. This study provided new molecular insights into plant-oomycete interaction and revealed a plant gene that could potentially be engineered to provide enhanced resistance to oomycete pathogens. / Ph. D.

Chronic exposure to the ubiqutious airborne fungus, Alternaria alternata, has long been implicated in the development and exacerbation of human allergy and asthma. Alt a 1 was identified previously by several groups as the major allergen secreted by A. alternata, due to its IgE-specific reactivity with sera from atopic patients. Despite the well-documented clinical importance of Alternaria and its major allergen, little knowledge exists regarding their role and interaction with the innate immune system. Here for the first time we characterize the innate immune response to A.alternata and verify the significance of Alt a 1 in contributing to this response in human airway cells and murine models. Our studies establish a baseline response for both a chronic and single-challenge murine inhalation model with Alternaria spores. Both models demonstrate live conidia induce a robust response, arguably more pathologically relevant compared to studies employing Alternaria extracts. We also elucidate the overall importance of Alt a 1 by utilizing recombinant Alt a 1 protein, A. alternata (Δalt a 1) deletion mutants, and an A.alternata (Alt a 1+) overexpression mutant. Both Alt a 1 protein and A. alternata conidia stimulated production of pro-inflammatory cytokines/chemokines in mice after a single intranasal challenge. Infiltration of effector cells (macrophages, neutrophils, eosinophils, and lymphocytes) into the lungs along with other hallmarks of airway inflammation was observed. In addition, Alt a 1 protein and conidia evoked secretion of pro-inflammatory cytokines in treated human airway epithelial cells while the Alt a 1+ overxpression mutant induced a significantly higher response. In contrast, spores of Δalt a 1 caused an attenuated response in both human cells and murine lungs suggesting that this single protein may play a major role in inducing the innate immune response in airway epithelium at the organismal level. Finally, we identified key biochemical properties of the Alt a 1 protein including a single histidine required for esterase activity and a unique RXLR-like motif which controls Alt a 1's ability to bind external lipids and enter human airway cells. Overall, these results improve our understanding of how Alternaria induces innate immunity and identifies possible therapeutic targets within allergenic proteins. / Ph. D.

L'agriculture mondiale a connu de profonds changements qui lui ont permis de faire face à l'augmentation constante de la demande alimentaire. Cependant, les conséquences de ces nouvelles pratiques agricoles sur l'environnement et la santé humaine font l'objet de préoccupations croissantes. Notamment, les politiques sanitaires actuelles visent à réduire l'utilisation des produits phytosanitaires. Aussi de nouvelles stratégies de protection des cultures doivent-elles être développées. Une meilleure compréhension des échanges moléculaires qui contribuent au succès des bioagresseurs est nécessaire. Ces échanges impliquent notamment la sécrétion de protéines qui interfèrent avec le métabolisme de l'hôte : les effecteurs. Certains d'entre elles sont accumulés au cours de la pénétration des premières cellules végétales, une étape décisive pour le succès de la tentative d'infection. Les travaux menés au cours de cette thèse se sont concentrés sur 3 de ces effecteurs, sécrétés par l'oomycète Phytophthora parasitica. L'analyse des lignées de surexpression chez Arabidopsis thaliana a permis de mettre en évidence des perturbations du développement et de la physiologie de certaines hormones végétales en réponse à l'accumulation de ces effecteurs. Ces données confirment l'importance de la manipulation des voies hormonales dans le cadre des interactions plantes-pathogènes et soutiennent l'hypothèse récente selon laquelle des effecteurs sécrétés par les agents pathogènes interfèrent avec un petit nombre de cibles clefs du métabolisme de l'hôte. Ces cibles constituent des candidats de choix pour développer des variétés plus résistantes.