No description available.

Light regulates many biological processes through light-sensitive proteins called opsins. Opsins are involved in vision, but they are also expressed in extraretinal tissue, where their roles are far less clear. Fish have large opsin repertoires, derived from a long history of gene duplication and divergence, making them useful models to study opsin diversity and function. I introduce the deep-sea sablefish (Anoplopoma fimbria) as a model for opsin research for three main reasons: i) the availability of a draft genome and transcriptome, simplifying the characterization of this species’ opsin repertoire, ii) the proximity of the only sablefish aquaculture facility in the world, providing exclusive access to a large number of individuals at all developmental stages, iii) the observation that sablefish occupy very different light environments during the course of development, ranging from well-lit shallow waters to the aphotic zone, which provides a light environment context for opsin gene expression data. My survey of the genome showed that sablefish have 36 distinct opsin genes (7 visual and 29 non-visual), even though they spend most of their lives in the dark. The sablefish opsin sequences and repertoire are similar to those of other teleost fish. To test the hypothesis that the sablefish opsin repertoire is being expressed/transcribed during the comparatively brief period of time when this species is exposed to light (the free-swimming larval stage through to the juvenile stage), I quantified the expression of five paralogous genes from a well-studied non-visual opsin family (OPN4’s) in the brain across life stages. Data show statistically stable expression of Opn4m1 and Opn4m3 among life stages, a rough association of Opn4x1 and Opn4m2 expression with age and light environment, and little-to-no expression of Opn4x2. I localized proteins encoded by the most highly expressed class of OPN4 genes in the brain, the Opn4m genes, to the surface of the optic tectum just below a cranial ‘window’; a zone that has been shown to express dozens of opsins in zebrafish (a distant relative, with their ancestor diverging more than 230 million years ago). Thus, in some cases, expression appears to be correlated with light exposure not only temporally, but also spatially. By studying non-visual opsins in sablefish, I have challenged and broadened the current understanding of opsin evolution and function in fish and provided the foundation for future studies to test brain regions for light-sensitivity, perform opsin gene knock-outs, and explore potential light-independent processes. / Graduate / 2023-09-06

When it comes to cell types, the cerebral cortex is one of the most diverse regions in the mammalian brain. Mouse cortical neurons are generated during development from radial glial cells (RGCs). But how these stem cells generate the different neuronal subtypes is still an open question. In the adult, transcription factors, specially homeobox genes, have been identified as determinants of neuronal types throughout the animal kingdom. Thus, in this study, we hypothesise that different subpopulations of neuronal progenitors (RGCs) give rise to subsequent subtypes of neurons in the cortex, and these populations can be defined by homeobox gene expression. Starting from a scRNA- seq analysis, we identified differentially expressed genes across different progenitor populations in the developing cortex: Adnp2, Homez and Hmbox1. We characterised their mRNA and protein expression across cortical layers in postnatal mice and found that these genes are also differentially expressed among layers. We also find discordances between scRNA-seq data, mRNA expression, and protein expression data that could indicate specific post-transcriptional regulation of these genes. Altogether, these results point to a role of homeobox genes in neuronal identity.

Η πρωτεΐνη ΒΜ88 είναι νευροειδική πρωτεΐνη με ευρεία κατανομή σε κύτταρα του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος των θηλαστικών. O βιοχημικός χαρακτηρισμός του μορίου έδειξε ότι πρόκειται για διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εντοπίζεται κυρίως στις μεμβράνες ενδοκυττάριων οργανιδίων (μιτοχόνδρια, ενδοπλασματικό δίκτυο) ενώ το μεγαλύτερο τμήμα του μορίου της προσανατολίζεται προς το κυτταρόπλασμα. Στο ενήλικο κεντρικό νευρικό σύστημα η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε νευρώνες ενώ δεν ανιχνεύεται σε γλοιοκύτταρα. Αναπτυξιακά, η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 ανιχνεύεται κατά την έναρξη της νευρογένεσης στον εγκέφαλο του αρουραίου ενώ τα επίπεδα της έκφρασή της αυξάνονται µε την ηλικία και παραµένουν υψηλά στο ενήλικο ζώο. Λειτουργικά πειράματα in vitro υπερέκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 συσχετίζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 με την έξοδο των κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο και την έναρξη της διαδικασίας διαφοροποίησής τους προς νευρωνικό φαινότυπο. Τα παραπάνω δεδομένα μας ώθησαν να μελετήσουμε την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά τη διαδικασία της νευρογένεσης και της διαφοροποίησης των νευρώνων in vivo, έτσι ώστε να διερευνήσουμε το ρόλο της κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου. Για το σκοπό αυτό επιλέξαμε ως σύστημα μελέτης τον αναπτυσσόμενο φλοιό του τελεγκεφάλου των τρωκτικών. Αρχικά χαρτογραφήθηκε η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στο φλοιό του αναπτυσσόμενου τελεγκεφάλου κατά την εμβρυϊκή ηλικία Ε14-Ε18 και πραγματοποιήθηκαν πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού με αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και έναντι μαρτύρων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού όπως είναι η κυκλίνη D1 (μάρτυρας της φάσης G2/M του κυτταρικού κύκλου) και το ανάλογο της θυμιδίνης BrdU (που ενσωματώνεται κατά τη φάση της αντιγραφής του DNA - φάση S του κυτταρικού κύκλου). Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται τόσο στους διαφοροποιημένους νευρώνες, όσο και σε ενεργά πολλαπλασιαζόμενα προγονικά κύτταρα του αναπτυσσόμενου φλοιού του αρουραίου και του ποντικού. Κατόπιν, διερευνήσαμε αν η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται κατά την περίοδο της νευρογένεσης ειδικά, σε προγονικά κύτταρα της γενεαλογίας των νευρώνων ή αν εκφράζεται και σε πρόδρομα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας του τελεγκεφάλου. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν διπλές και τριπλές ανοσοϊστοχημικές χρώσεις με αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και έναντι νευρωνικών ή γλοιΐκών μαρτύρων, σε συνδυασμό με αντισώματα έναντι μαρτύρων κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Παρατηρήθηκε ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται αποκλειστικά και μόνο σε κύτταρα της νευρωνικής γενεαλογίας και όχι σε πολλαπλασιαζόμενα ή διαφοροποιημένα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν από το γεγονός ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 προσδιορίστηκε και σε νευροεπιθηλιακά κύτταρα του τύπου «ακτινωτής γλοίας» που σύμφωνα με την τρέχουσα αντίληψη, αποτελούν την πλειοψηφία του πληθυσμού των πρόδρομων νευρογενετικών κυττάρων του φλοιού κατά την εμβρυϊκή ηλικία Ε14-Ε18. Αργότερα μόνο, τα κύτταρα αυτά θα αποτελέσουν προδρόμους της γλοιϊκής γενεαλογίας, και συγκεκριμένα μετά τη 18η εμβρυϊκή ημέρα και κατά τις πρώτες ημέρες μετά τη γέννηση. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν συνδυαστικά πειράματα σήμανσης των πρόδρομων κυττάρων του εγκεφάλου με δύο διαφορετικούς μάρτυρες της φάσης S του κυτταρικού κύκλου, με τα οποία έγινε εφικτή η παρακολούθηση in vivo, και για το διάστημα 12 και 24 ωρών, του πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και της διαφοροποίησης μιας ομάδας πρόδρομων νευρικών κυττάρων. Τα πειράματα αυτά οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σχετίζεται με τις ασύμμετρες κυτταρικές διαιρέσεις, η εμφάνιση των οποίων σηματοδοτεί την έναρξη της νευρογένεσης στο φλοιό και την εμφάνιση των πρώτων μεταμιτωτικών νευρώνων. Έτσι, φαίνεται ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα πρόδρομα νευρογενετικά κύτταρα προκαλεί την έξοδό τους από τον κυτταρικό κύκλο. Η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 μελετήθηκε και στον εγκέφαλο του ενήλικου αρουραίου όπου εντοπίστηκε, εκτός από τους ώριμους νευρώνες, και στα πρόδρομα κύτταρα του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου (RMS) όπου λαμβάνει χώρα η δευτερογενής νευρογένεση. Το αποτέλεσμα αυτό έρχεται σε συμφωνία με τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας και συνδέουν επιπλέον την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 με τη διαδικασία της νευρογένεσης στον ενήλικο εγκέφαλο. Τέλος, μελετήσαμε τόσο την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 όσο και τα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου ΒΜ88 στον αναπτυσσόμενο εγκεφαλικό φλοιό ποντικών που φέρουν τη μετάλλαξη Small eye (ποντίκια Sey/Sey). Στα ποντίκια αυτά δεν είναι λειτουργικό το γονίδιο Pax6 που είναι υπεύθυνο για την επαγωγή της νευρογένεσης στο ραχιαίο μέρος του τελεγκεφάλου. Έτσι, ο αριθμός των νευρώνων που παράγονται στο φλοιό αυτών των μεταλλαγμένων ποντικών είναι ελαττωμένος στο μισό από αυτόν που συναντάμε στα ποντίκια φυσικού τύπου. Όπως αναμενόταν, παρατηρήθηκε ότι τόσο η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 όσο και τα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου ΒΜ88 είναι μειωμένα στα ποντίκια Sey/Sey. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της εργασίας μας έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 χαρακτηρίζει τη γενεαλογία των νευρώνων από τα πρόδρομα εμβρυϊκά κύτταρα μέχρι τους ώριμους νευρώνες και επομένως αποτελεί ένα νέο μάρτυρα της νευρωνικής γενεαλογίας. Επιπλέον, δείξαμε ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 συγκεντρώνει τις απαραίτητες ιδιότητες που χαρακτηρίζουν ένα «νευρογενετικό παράγοντα». Συγκεκριμένα: α) εκφράζεται τόσο στους διαφοροποιημένους νευρώνες όσο και σε ενεργά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα της νευρωνικής γενεαλογίας, β) δεν εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας, γ) εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα νευρώνων κατά τη διάρκεια της νευρογένεσης στο ενήλικο άτομο και τέλος δ) η έκφρασή της μειώνεται σε ζώα που φέρουν μεταλλάξεις οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση ελαττωματικής νευρογένεσης. Η κατανομή της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου καθώς και ο εντοπισμός της σε βλαστικά κύτταρα του ενήλικου εγκεφάλου, η συσχέτιση της έκφρασης του μορίου με τις ασύμμετρες νευρογενετικές κυτταρικές διαιρέσεις καθώς και η χαρακτηριστική αύξηση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά τη μετάβαση των προγονικών κυττάρων σε διαφοροποιημένους νευρώνες, όλα συνηγορούν για τη συμμετοχή του μορίου στις διαδικασίες της εξόδου από τον κυτταρικό κύκλο και τη διαφοροποίηση των νευρώνων in vivo. Οι παρατηρήσεις αυτές, όχι μόνον είναι συμβατές με προηγούμενα πειραματικά δεδομένα όσον αφορά τον προσδιορισμό του ρόλου της πρωτεΐνης σε in vitro βιολογικά συστήματα, αλλά δημιουργεί ενδιαφέρουσες προοπτικές για την αξιοποίηση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε θεραπευτικές προσεγγίσεις για την αντιμετώπιση νευροεκφυλιστικών ασθενειών ή/και τραυματισμών του εγκεφάλου. / BM88 is a neuron-specific protein widely expressed in the cells of the mammalian central and peripheral nervous system. Its biochemical characterization revealed that is an integral membrane protein, located at the membranes of intra-cellular organelles (mitochondria, endoplasmic reticulum) with the bulk of the protein facing towards the cytoplasm. In the adult central nervous system BM88 is expressed in neurons but it is not detected in glial cells. During development, BM8 is initially expressed at the onset of neurogenesis in the rat brain, its levels rise along age and remain high in the adult. In vitro experiments of BM88 protein over-expression suggest that BM88 is implicated in cell cycle exit and the initiation of differentiation into a neuronal phenotype. These findings lead us to study the expression of BM88 during neurogenesis and neuronal differentiation in vivo in purpose to investigate its role in brain development. For this reason, we have chosen as a model of study the developing cortex of rodent telencephalon. Initially, we investigated the distribution of BM88 protein in the developing cortex. To this end, we performed double-labeling experiments in sections from the developing rat brain at embryonic days E14 and E18 using antibodies to BM88 and markers of the cell cycle such as cyclin D1 (G2/M phase marker) and BrdU, a thymidine analogue that is incorporated during DNA replication (S phase marker). The findings from these experiments revealed that BM88 protein is expressed in the differentiated neurons as well as in actively proliferating progenitor cells of the developing cortex of rat and mouse. We next sought to investigate whether BM88 is expressed during neurogenesis specifically in the progenitor cells of the neuronal lineage or in the progenitor cells of the glial lineage of the telencephalon as well. For this reason we performed double and triple-labeling experiments with antibodies to BM88 and to markers of the neuronal or glial lineages, in combination with markers of the cell cycle. We observed that BM88 protein is expressed exclusively in the neuronal progenitors and never in the proliferating or differentiated cells of the glial lineage. The above results were supported also by the fact that BM88 protein was detected in neuroepithelial “radial glial” cells that are cells recently reported to be the majority of neuronal progenitors of the cortex during the embryonic days E14-E18. These cells will turn into glial progenitors only after the embryonic day E18 and during early postnatal days. Moreover, we developed an experimental protocol that allowed us to mark the progenitor cells of the brain with two different markers of the S phase of the cell cycle. Thus, we could observe in vivo, during a period of 12 and 24 hours, the migration and differentiation of a group of neural progenitor cells. The results from this experiment lead us to the conclusion that the expression of BM8 protein is associated with the asymmetric cell divisions that mark the onset of neurogenesis in the cortex and the appearance of the first post-mitotic neurons. Thus, it appears that the expression of BM88 protein in the neuronal progenitor cells causes their exit from the cell cycle. BM88 protein expression was also detected in the adult rat brain, not only in the mature neurons but also in the precursor cells of the rostral migratory stream (RMS), where the secondary neurogenesis occurs. This result is in accordance with our previous observations and support additionally that there is a correlation between BM88 expression and the process of neurogenesis in the adult brain. Finally, we investigated the expression of BM88 protein as well as the transcriptional levels of BM88 gene in the developing cortex of Small eye mutant mice (Sey/Sey mice). These mice lack the functional Pax6 gene that is responsible for the induction of neurogenesis in the dorsal telencephalon. Thus, the number of neurons that are produced in the cortex of the mutant mice is reduced by half in comparison to that of the wild type mice. As expected we observed reducer levels of expression both of BM88 protein and BM88 transcripts in the Sey/Sey mice. To conclude, the results of our study demonstrate that BM88 protein marks the lineage of neurons, all along from the stage of embryonic precursor cells to the stage of mature neurons, and for this reason is a new marker of the neuronal lineage. Furthermore, we showed that BM88 protei has all the characteristics that can identify a molecule as a “neurogenic factor”. More specifically: a) it is expressed both in differentiated neurons and in actively proliferating cells of the neuronal lineage, b) it is absent in the precursors of the glial lineage, c) it is present in the adult neuronal precursors, and finally d its expression is reduced in mutants with neurogenic defects. The expression pattern of BM88 protein during brain development, its presence in stem cells in the adult brain, its association with the asymmetric divisions of neurons as well as the characteristic high levels of BM88 protein expression during the neuronal transition from the progenitor stage to the differentiated stage, all together coincides to the implication of BM88 in the exit from the cell cycle and in the differentiation of neurons in vivo. These observations not only agree with previous experimental data, but also create new perspectives for the use of BM88 protein in therapeutic approaches in order to control the neurodegenerative diseases or/and brain damages.

No description available.