Cette thèse porte sur le développement de nouvelles approches par marquage de spin suivi par spectroscopie RPE. Cette technique est bien adaptée pour suivre la dynamique structurale des protéines. Son principe repose sur l'insertion d'un radical nitroxyde, en un (ou plusieurs) site(s) choisi(s) d'une protéine et permet de sonder localement la structure de la protéine étudiée grâce aux différentes techniques de RPE (en onde continue et impulsionnelle).Dans une première partie, cette technique a été appliquée à la caractérisation de la dynamique structurale de l'IF1 de levure, un peptide inhibiteur de l'ATP-synthase. L'utilisation des spectroscopies de RPE et de dichroïsme circulaire a permis de montrer qu'IF1 de levure dimérise par sa partie médiane et que la partie C-terminale est désordonnée.La seconde partie est plus méthodologique et a pour but d'étudier et de caractériser un marqueur nouvellement synthétisé afin d'élargir les potentialités du marquage de spin. En effet, cette technique est notamment limitée par la faible diversité spectrale offerte par les sondes disponibles (trois raies). Le nouveau marqueur donne un spectre RPE à six raies grâce à la présence d'un noyau magnétique dans l'environnement du radical. Greffé sur une protéine modèle, nous avons montré que ce nouveau marqueur est tout autant capable de rendre compte de variations structurales qu'un marqueur classique. La superposition des signatures spectrales (trois raies + six raies) montre qu'il est possible de différencier les deux signatures spectrales et de sonder simultanément deux sites d'une protéine et de son partenaire. / This thesis focuses on the development of new approaches for site-directed spin labeling followed by EPR spectroscopy. This technique is well suited to monitor the structural dynamics of proteins. The insertion of a nitroxide radical, in one (or several) selected site(s) of a protein, allows probing the structure of the protein using different EPR spectroscopy approaches (continuous wave and pulsed).In a first part, this technique has been applied to characterize the structural dynamics of the yeast IF1, an inhibitory peptide of the ATP-synthase. Using EPR and circular dichroïsm spectroscopies we showed that yeast IF1 dimerizes by its central part and that the C-terminal part remains disordered.The second part is more methodological and the aim is to study and characterize a newly synthesized spin label in order to expand the potential of site-directed spin labeling. In particular, the technique is limited by the poor spectral diversity offered by the available labels (three lines). The new label gives a six lines EPR spectrum thanks to the presence of a magnetic nucleus in the environment of the radical. Grafted on a model protein, we demonstrated that this new label is as able as classical ones to report on structural variations. The superposition of the spectral signatures (three lines + six lines) showed that it is possible to differentiate the two spectral signatures and to probe two sites of a protein and its partner simultaneously.

L’étude des transitions structurales dans les protéines est d’un intérêt crucial car ces transformations sont impliquées dans de nombreux processus biologiques essentiels. De tels phénomènes structuraux peuvent être à l’origine de propriétés remarquables dans les protéines flexibles ou désordonnées, propriétés difficilement accessibles par les techniques structurales usuelles. Le marquage de spin couplé à la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) est une technique bien adaptée pour l’étude de ces transitions structurales. L’insertion d’un radical nitroxyde sur une cystéine, naturelle ou introduite par mutagenèse dirigée, située à un endroit clé de la protéine permet d’obtenir des informations locales sur les changements structuraux éventuels provoqués par l’ajout d’un partenaire.Cette technique a été appliquée à deux systèmes biologiques comportant un degré de flexibilité différent. La flexibilité de la protéine chaperon NarJ, intervenant dans la biogenèse du complexe Nitrate Réductase de la bactérie Escherichia coli, a été étudiée en présence de son peptide partenaire. Ces études ont permis d’une part de déterminer le site d’interaction et d’autre part, de montrer que l’association des deux partenaires entraîne un verrouillage dans une conformation préférentielle de NarJ. Le deuxième sujet d’étude est la protéine CP12 de Chlamydomonas reinhardtii, intervenant dans la régulation d’un complexe supramoléculaire du cycle de Calvin. La CP12 s’apparente à une protéine intrinsèquement désordonnée, ayant la particularité de posséder des cystéines naturelles et fonctionnelles. Le marquage classique a permis de mettre en évidence un nouveau rôle de son partenaire et de montrer que la CP12 garde un caractère désordonné dans le complexe. Par ailleurs, cette protéine a servi de système d’étude pour développer une nouvelle stratégie de marquage sur Tyrosine et démontrer sa faisabilité. / The study of structural transitions in proteins is of crucial interest because these transformations are involved in many biological processes. Such structural phenomena can be the source of remarkable properties in flexible or disordered proteins, properties hardly accessible by conventional structural techniques. Site-directed spin labeling combined with electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) is a technique well suited for the study of these structural transitions. The insertion of a nitroxide reagent on a cysteine, natural or introduced by site-directed mutagenesis, located in a key position of a protein provides local information on possible structural changes induced by the addition of a partner. This technique was applied on two biological systems with a different degree of flexibility. The flexibility of NarJ, a chaperon protein involved in the biogenesis of the complex nitrate reductase of Escherichia coli was studied in the presence of its peptide partner. These studies enabled us to determine the interaction site and to show that the association of the two partners induced a locked conformation of NarJ. The second system is the CP12 protein of Chlamydomonas reinhardtii, involved in the regulation of a supramolecular complex of the Calvin cycle. CP12 shares some similarities with the intrinsically disordered protein but having natural and functional cysteines. The conventional labeling allowed us to highlight a new role of its partner and to demonstrate that CP12 remains disordered in the complex. Moreover, this protein was used as a model system to develop a new labeling strategy on tyrosine and to demonstrate its feasibility.