Tesi realitzada a Endor Nanotechnologies S.L. / Novel stategies are needed to improve the limited efficacy of current cancer therapies. High expectations are directed towards nanotechnology-based applications in cancer medicine. We have developed a drug delivery system based on hyaluronic acid (HA) ­coated gold nanoparticles (AuNPs) that targets CD44, a cell surface glycoprotein overexpressed by various cancer cells. This nanocarrier (EDS: Endor Drug Delivery System) provides a platform for the conjugation of anticancer agents for a more efficient cancer treatment. We show that the unique characteristics of AuNPs remain unchanged when the targeting ligand and a chemotherapeutic agent are conjugated. HA-coating stabilizes AuNPs and improves their biocompatibility. EDS is shown to target CD44 and is internalized through this receptor. The nanocarrier does not cause toxic effects in vitro or in vivo. After conjugating an anticancer agent (CIS: cisplatin) to the nanocarrier, EDS shows gradual drug release in physiological media due to changes in pH and hyaluronidase activity, and the drug reaches its target cells in its active form. In vivo efficacy of EDS­CIS conjugate is higher than that of free cisplatin. However, more safety and toxicological studies must be conducted. New drug candidates are being tested in order to validate EDS as a platform for antitumoral drugs. / Els actuals tractaments oncòlogics presentan una eficàcia limitada que forcen la recerca de noves teràpies mes eficients. En aquest sentit, la nanotecnologia ha generat moltes expectatives. Durant aquesta tesi, hem desenvolupat un sistema d’alliberaciò de fârmacs formats per nanopartícules d’or (AuNP) recobertes amb àcid hialurònic (HA), dirigit a CD44, una glicoproteïna que es sobreexpresa a la superfície cel.lular de diferents tipus de tumor. Aquest sistema (EDS: Endor Delivery System) proporciona una plataforma per a la conjugaciò de diferents fârmacs antitumorals per tal de tractar el câncer d’una manera més eficient. Aquesta tesi demostra que les propietats úniques que aporten les AuNP es mantenen quan la molqcula que dirigeix al tumor (HA) i l’agent antitumoral sòn conjugats. El recobriment d’HA estabilitza les AuNP, millorant la seva biocompatibilitat. A mps, tambp es demostra que l’EDS va dirigit a CD44, al qual s’uneix i ps internalitzat a les cèl.lules. El nanotransportador no presenta efectes tòxics ni in vitro ni in vivo. Quan el nanotransportador s’uneix a un agent antitumoral (Cisplatí, CIS), es va alliberant de manera gradual en medis fisiològics, a travps de l’acciò de les hialuronidases i del canvi de pH, alliberant el fârmac amb la seva forma activa. L’eficâcia in vivo del CIS conjugat a l’EDS ha mostrat ser superior a la del fârmac lliure. No obstant aixó, sòn necessaris més estudis de seguretat y toxicitat. Nous fàrmacs antitumorals estan sent estudiats per tal de validar l’EDS com una plataforma per a l’alliberaciò de fârmacs antitumorals.

Tesi realitzada al Centre de Supercomputació de Barcelona (BSC) / A complete understanding of complex formation between proteins and ligands, a crucial matter for pharmacology and, more in general, in biomedicine, requires a detailed knowledge of their static and dynamic atomic interactions. The main objective of this thesis is to test recent developments in conformational sampling techniques in providing such a dynamical view. We aim at developing new protocols and methods for such a study. Moreover, we want to show how its application can aid in addressing existing problems in the biophysics of protein ligand interactions. Moreover, we apply and refine novel computational approaches aiming at a comprehensive description of the protein and protein-ligand energy landscape, progressing into the rational design of new inhibitors for particular targets. We provide here a summary of the main results. PELE was used for induce fit docking in protein kinases, mammalian target of rapamycin (mTOR) and BCL-2 family protein, particularly MCL-1 protein. Results produced a detailed atomic description of the binding modes of ligand/drug to the selected target. Overall, these results provide new data to understand the mechanism of action of these molecules, and provide new structural data that will allow the development of more Specific inhibitors for cancer treatments. Importantly, we demonstrate the critical role of sampling the protein-ligand dynamics in order to improve the docking score. Moreover, the findings reported here clearly shown the capabilities of PG (and its derivatives) for use in particular apoptotic targets. Following the previous goal, we aim at the implementation of the atomic detailed knowledge into the rational design of new inhibitors, aiming to enhance specificity and binding strength. Motivated by our success with validation studies (applied to several systems for protein-ligand interaction and induce fit procedure) we attempted to design a new inhibitor for a specific target. For doing so, we used the system from our second study: Molecular interactions of prodiginines with the BH3 domain of BCL-2 family members. We have shown how PELE can be used in effectively design improved compounds with significant better docking results. The PELE was applied to steroid Nuclear Receptors to unbiased simulations, where substrate/ligands were placed in the active site, to freely move through the protein and finding the channels, or outside the receptors allowed ligand to freely explore the protein surface. In this study, we demonstrated the applicability of the PELE method in solving relevant biophysical problems. In particular, using PELE we introduced a new structural and dynamic paradigm for ligand binding in steroid nuclear receptors. Using PELE, we create a protocol involving sequence comparison and all­atom protein-ligand induced fit simulations to predict PR resistance at the molecular level. We introduced a significant advance in predicting the affinity of different drugs against HIV-1 protease with several mutations. This study shows how computational techniques are capable of quantitatively discriminating resistance variants of HIV-1 protease. This application is fully automated and installed on PELE web server. Beside these main objectives based on methods application, we aim to add methodological improvements derived from the application and validation studies. We performed method development and studied PELE protocols to model long-time protein dynamics by means of normal mode perturbation and constrained minimization. New backbone perturbation combined with normal modes increased the capability of PELE method to explore local dynamics and large conformational changes.

Tesi realitzada a l’institut d’investigacions Biomèdiques Agust Pi i Sunyer (IDIBAPS) / La presente tesis se enmarca dentro del estudio de la lesión por isquemia-reperfusión (I/R), y sus efectos sobre la regeneración, en hígados esteatósicos y no esteatósicos. Uno de los principales riesgos en la cirugía hepática es la hemorragia que se produce durante las resecciones hepáticas. Para reducir este riesgo se realiza una oclusión vascular del flujo sanguíneo que entra en el hígado (isquemia). Si bien esto reduce el sangrado durante la cirugía, hay que tener presente las lesiones provocadas por la interrupción del flujo sanguíneo. Esta lesión hepática por isquemia, se agrava al restablecer el flujo sanguíneo (reperfusión). La esteatosis es la acumulación de cantidades excesivas de triglicéridos y otras grasas en las células hepáticas. Esta acumulación de grasa hepática es un factor de riesgo importante en la cirugía hepática, y se asocia con un mayor índice de complicaciones y mayor mortalidad postoperatoria. Se estima que más del 20% de pacientes programados para resección hepática presentan algún grado de esteatosis y, por lo tanto, es evidente la necesidad de desarrollar estrategias para minimizar los efectos adversos de la lesión por I/R en los hígados esteatósicos. En los últimos años, las investigaciones se han centrado en las adipocitoquinas como potenciales dianas terapéuticas en distintas patologías relacionadas con la obesidad y el síndrome metabólico; y en distintos antioxidantes para disminuir los daños por I/R hepática. En la presente tesis se investigan el papel del RBP4 - adipocitoquina principalmente sintetizada en el hígado - y del retinol - potente antioxidante - en la lesión hepática por I/R y en el fallo en la regeneración asociada a la hepatectomía parcial en hígados esteatósicos y no esteatósicos. La memoria consta de 6 capítulos, la bibliografía y un anexo. En la introducción se recopilan los antecedentes sobre resección hepática, lesión por I/R, las estrategias que se han establecido hasta el momento para reducir esta lesión y aumentar la regeneración, y las características de los hígados esteatósicos. El papel del RBP4 y del retinol, así como sus mecanismos de acción se discutirán también en esta sección. En el capítulo 2 se describen los objetivos de la presente tesis. En el capítulo 3 se detalla el diseño experimental y los materiales y métodos utilizados. En el capítulo 4 se describen los resultados obtenidos; y en el capítulo 5 se discuten tales resultados. El último capítulo consiste en las conclusiones obtenidas a partir de los resultados de la presente tesis. La memoria finaliza con una lista exhaustiva de referencias que nos han permitido establecer las hipótesis de partida y complementan la información aportada; y un anexo donde se recogen los artículos principales que han dado lugar a esta tesis doctoral y la lista de artículos complementarios obtenidos en relación con los experimentos desarrollados en estos últimos años. / In this Ph.D thesis we study the ischemia and reperfusion (I/) injury, and its effects on hepatic regeneration in steatotic and non steatotic livers. In clinical situations, partial hepatectomy (PH) under I/R, is usually performed to control bleeding during parenchymal dissection. Steatosis is the accumulation of excessive amounts of triglycerides and other fats in the liver cells. Hepatic steatosis, a major risk factor for liver surgery, is associated with an increased complication index and increased postoperative mortality after major liver surgery. It is estimated that over 20% of patients scheduled for PH have some degree of steatosis. Therefore, it is needed to develop strategies to minimize the adverse effects of I/R injury in steatotic livers. In recent years, research has focused on adipocytokines as potential therapeutic targets in various diseases associated with obesity and metabolic syndrome, and various antioxidants to reduce hepatic I/R injury. In this thesis we investigate the role of RBP4 - adipocytokine mainly synthesized in the liver - and retinol - powerful antioxidant - liver injury in I/R and in regeneration failure associated with PH in steatotic and non steatotic livers.

En el año 1949, el litio fue propuesto por primera vez por Cade para el tratamiento específico de la psicosis maniaca. Desde entonces se han realizado muchos estudios clínicos que han demostrado la eficacia de este ión para controlar la manía. Por otro lado existen evidencias que sugieren que el litio puede tener un efecto protector frente a las psicosis recurrentes y episodios maniaco-depresivos.Las acciones tanto bioquímicas cono farmacológicas del litio han sido estudiadas en diferentes especies animales incluido el hombre y entre los tejidos mas frecuentemente utilizados cabe destacar el hígado, riñón, corazón y muy especialmente el cerebro. Sin embargo no se han podido establecer hasta el presente cuáles son los mecanismos de acción de este ión, bien porque las concentraciones utilizadas de litio eran muy elevadas y por tanto tóxicas para su utilización terapéutica, o bien porque los resultados obtenidos eran contradictorios. A pesar de ello existen en la actualidad un gran número de teorías que intentan explicar el mecanismo de acción del litio en las enfermedades afectivas, aunque ninguna ha resultado ser definitiva, por lo que el principal objetivo de esta tesis ha sido intentar esclarecer un poco mas los efectos farmacológicos del litio y muy especialmente los que están ligados a la inhibición del sistema adenilciclasa-AMPc.La elección del plexo mientérico-músculo longitudinal de íleon de cobayo como modelo experimental para estudiar los efectos del litio se debió:1/ A la presencia en esta preparación de una gran cantidad de receptores distintos: colinérgicos, adrenérgicos, serotoninérgicos, histaminérgicos, purinérgicos, opiáceos,. en ocasiones relacionados con este ión.2/ A que algunos de los principales efectos secundarios producidos por el litio son náuseas, vómitos y diarrea, relacionados tanto con el sistema nervioso entérico como con el sistema nervioso central.3/ A los escasos trabajos publicados referentes a los efectos del litio en esta preparación.En nuestro intento de dilucidar el mecanismo de acción de las sales de litio hemos empleado las siguientes técnicas:Baños de órgano aislado conteniendo las preparaciones de plexo mientérico-músculo longitudinal de íleon de cobayo, estimuladas eléctricamente, a los que se añadía directamente las diferentes sustancias a ensayar.También estudiamos en baños de órgano aislado, los efectos producidos por el litio sobre las preparaciones de plexo mi entérico-músculo longitudinal de íleon procedentes de animales tratadas crónicamente con diferentes dosis de litio, ya que se ha comprobado que las acciones terapéuticas de este ión aparecen a partir de la primera semana de tratamiento.Por último y debido a la gran importancia de las teorías que postulan en tejidos como cerebro, hígado, riñón, etc., una inhibición por parte del litio sobre la adenilciclasa, pusimos a punto una técnica radioactiva isotópica de desplazamiento para valorar los niveles de AMPc en homogenizados de preparaciones de plexo mi entérico-músculo longitudinal de íleon, provenientes tanto de animales tratados coma no tratados con litio.Entre los principales resultados obtenidos en baño de órgano aislado, cabe destacar que el cloruro de litio inhibe en el plexo mientérico-músculo longitudinal de íleon de cobayo la liberación de acetilcolina a nivel presináptico, siendo esta inhibición especifica de este ión, ya que el efecto del cloruro sódico era muy inferior al obtenido con concentraciones idénticas de cloruro de litio.Así mismo comprobamos que las sales de litio no modifican la inhibición producida por la morfina pero si que disminuyen de forma estadísticamente significativa a partir de concentraciones de 0'5x10(-2)M el efecto de la noradrenalina, histamina y serotonina. También demostramos que ni los bloqueantes opiáceos, beta -adrenérgicos, histaminérgicos y serotoninérgicos antagonizan la acción del litio y sólo los agentes bloqueantes alfa-adrenérgicos inhiben aunque sólo parcialmente el efecto de este ión.La presencia de un inhibidor de la fosfodiesterasa, 3-isobutil 1-metil xantina (lBMX) potencia por un lado en un 30% el efecto de la noradrenalina, mientras que por otro antagoniza en un 50% el producido por el litio.Para el tratamiento crónico con litio utilizamos 8 cobayos por dosis, siendo éstas de 0'05, 1, 2, 4 y 8 mEq/Kg/día, administradas por vía intraperitoneal durante 14 días. Hay que señalar que cuanto mayor era la dosis de litio menor era el aumento de peso de los animales, hasta llegar con 8 mEq/kg/día a una importante pérdida de peso corporal, produciéndose así mismo con esta dosis una mortalidad del 25% de los animales. En cuanto a los niveles de litio en suero después de los 14 días de tratamiento, los valores iban aumentando a medida que incrementábamos la dosis de este ión hasta llegar con 8 mEq/Kg/día a niveles de litio muy tóxicos para los animales.Respecto a las preparaciones de plexo mientérico-músculo longitudinal de íleon provenientes de animales tratados crónicamente, hay que destacar que las dosis bajas de este ión producen al iniciar las experiencias en baño de órgano aislado una mayor inhibición que las dosis altas sobre el efecto del litio añadido de forma aguda. Sin embargo, después de lavar las preparaciones durante 1 hora, se observa una potenciación de la inhibición del litio exógeno especialmente con las dosis más altas de este ión, lo que se podría deber a una sensibilización del plexo mientérico-músculo longitudinal de íleon de cobayo proporcional a la dosis de litio.Al comparar las curvas dosis-respuesta obtenidas con diferentes concentraciones de cloruro de litio antes y después de poner al baño de órgano aislado un inhibidor de la fosfodiesterasa, IBMX, comprobamos que en todas las dosis y con todas las concentraciones de litio se produce una inhibición, estadísticamente significativa, por parte del IBMX, lo que reafirma el antagonismo de este inhibidor de la fosfodiesterasa sobre la acción del litio no solo en los animales controles, sino también en los tratados crónicamente con diferentes dosis de este ión.En relación a los niveles de AMPc obtenidos mediante una técnica radioactiva de desplazamiento isotópico, hay que destacar que el litio inhibe directamente la acumulación de AMPc producida por el IBMX en preparaciones de animales controles, siendo la inhibición proporcional a la concentración de litio utilizada. De nuestros resultados se deduce también que el plexo mentérico-músculo longitudinal de íleon de cobayo es algo más sensible que el cerebro de rata al efecto de este ión.Para el estudio de los niveles de AMPc en preparaciones de plexo mientérico-músculo longitudinal de íleon, procedentes de cobayos tratados crónicamente, se siguió la misma técnica que con los animales controles, aunque en este caso no se añadía cloruro de litio de forma exógena sino que se medían directamente los niveles basales de AMPc así como la acumulación de este nucleótido cíclico producida por el IBMX después de los 14 días de tratamiento con litio respecto a los niveles basales, observarnos que sólo aparece una disminución estadísticamente significativa con dosis muy altas y consecuentemente tóxicas de litio, 8 mEq/Kg/día, mientras que con la presencia de IBMX ya se observa una inhibición estadísticamente significativa con dosis muy bajas de este ión, 1 mEq/Kg/día. Sin embargo, a partir de la dosis en la que se empiezan a observar efectos secundarios (2 mEq/Kg/día), la inhibición no aumenta, manteniéndose constante entre un 30 y un 35%, lo que se podría deber a una estabilización del efecto del litio a lo largo de los días que dura el tratamiento crónico.En resumen, las experiencias que hemos descrito en esta tesis aportan nuevos datos que permiten interpretar de una forma más precisa el mecanismo de acción del litio y además demuestran que la preparación de plexo mientérica-músculo longitudinal de íleon de cobayo es un buen modelo para el estudio del mecanismo de acción de este ión. / In 1949 Cade proposed for the first time the use of lithium salts in the treatment of manic psychoses. Since then many clinical studies have been done showing the efficacy of lithium in the control of mania.The pharmacological and biochemical actions of lithium have been studied in different animal species, including man, but up to now, it has not been possible to define the proper mechanism of action of lithium salts.The main objective of this thesis is to contribute to the clarification of the pharmacological effects of lithium, especially the ones implicating the inhibition of the adenylciclase-cAl1P system.To achieve the proposed goal we have employed the isolated guinea pig myenteric plexus preparation from control guinea pigs and from guinea pigs chronically treated with different doses of lithium.Our results show that lithium salts do not modify the morphine effects, but statistically decrease the noradrenaline, histamine and serotonin effects. The opiate, beta-adrenergic, histalllinergic and serotoninergic blocking agents does not antagonize the actions of lithium. The alpha-adrenergic blocking agents partially inhibit the lithium effects. The presence of a phosphodiesterase inhibitor, 3-isobutyl 1-methyl xanthine (lBMX), potentiates the noradrenaline effects by 30% and antagonizes the lithium effects by 50%.Using a radioisotope displacement technique for the determination of the cAMP levels in homogenates of the guinea pig myenteric plexus, we demonstrate the capacity of lithium to inhibit the cAMP accumulation induced by IBMX in control preparations. This inhibition is proportional to the lithium concentration.With the chronically treated animals we observe that in the absence of IBMX, lithium statistically inhibits the cAMP levels at very high doses of lithium (8 mEq/Kg/day). In the presence of IBMX the inhibition of the cAMP accumulation is obtained at very low doses of lithium, (1 mEq/Kg/day). An interesting coincidence is that at the same levels of doses that produce some side effects (starting at 2 mEq/Kg/day), the inhibition of the cAMP accumulation remains constant (30%-35%).

La activación de JNK (c-Jun N-terminal Kinase) ha sido relacionada en modelos in vivo e in vitro con la neurodegeneración inducida por glutamato, ácido kaínico (KA) y privación neurotrófica. Además, la activación de la vía de JNK se ha descrito en enfermedades neurodegenerativas crónicas como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. En mamíferos, se han identificado tres genes (Jnk1, Jnk2 y Jnk3) que codifican para distintas isoformas de JNK con diferente distribución tisular. Así, mientras que JNK1 y JNK2 están ampliamente distribuidas por los tejidos, JNK3 está básicamente localizada en el sistema nervioso central y, en menor medida, en corazón y testículo. La expresión de JNK3 específica de cerebro contribuye a que esta isoforma se presente como posible diana terapéutica en enfermedades neurodegenerativas. Además, diferentes estudios han evidenciado, que en ratones deficientes para JNK3 (Jnk3-/-), éstos demuestran neuroprotección y resistencia ante la excitotoxicidad del KA, ante la toxicidad del β-amiloide o en situaciones de hipoxia-isquemia. De acuerdo con esto, en la presente tesis se han estudiado los mecanismos moleculares y celulares responsables de la neuroprotección observada en ausencia de la isoforma JNK3, bajo la acción de diferentes estímulos neurotóxicos: i) el KA, como modelo experimental de epilepsia, y ii) el ácido 3-nitropropiónico (3NP), como modelo experimental de la enfermedad de Huntington. En primer lugar, se ha evidenciado que la falta de JNK3, además de reducir la muerte neuronal y la astrogliosis ante la acción del KA, modula la activación de otras MAPK, como ERK1/2 y p38. Sin embargo, la deleción de JNK3 no confiere neuroprotección ante la acción del 3NP, presentándose la vía de la calpaína/CDK5 como la responsable de la neuroprotección en este modelo experimental. En segundo lugar, se ha analizado la actividad transcripcional inducida por la ausencia de JNK3. Se ha observado una relación entre la falta de JNK3 y la activación de la vía de supervivencia de PI3K/AKT, mediante la regulación específica del gen Pik3cb. Además, esta relación no se ha detectado respecto a la ausencia de la isoforma JNK1. Por último, de acuerdo con los resultados obtenidos anteriormente se estudió comparativamente el efecto de la ausencia de JNK3 y JNK1 en el modelo del KA. Los análisis realizados de muerte neuronal, reactividad glial y expresión génica evidenciaron que la ausencia de JNK1, igual de lo que ocurría en ausencia de JNK3, mostraba neuroprotección frente a la muerte neuronal inducida por KA. En concordancia, se detectó una falta de inducción de los genes Fasl, Casp8 y Casp3 implicados en la vía extrínseca de la apoptosis tanto en ausencia de JNK3 como de JNK1. Por otro lado, la ausencia de JNK3 mostró una reducción de la reactividad astroglial y microglial inducida por KA, mientras que la ausencia de JNK1 manifestó una reducción de la reactividad astroglial. Sugiriendo que ambas isoformas divergen en las vías de actuación. / The JNK pathway activation has been implicated in in vitro and in vivo models of neurodegeneration induced by glutamate, kainic acid (KA) and neurotrophic deprivation. Moreover, activation of the JNK pathway has been described in chronic neurodegenerative diseases. In mammals, there are three genes (Jnk1, Jnk2 and Jnk3) that encode different isoforms of JNK. Whereas JNK1 and JNK2 are widely distributed, JNK3 is mainly located in central nervous system and to a lesser extent in heart and testis. Specifically, JNK3 plays a crucial role in neuronal death and different studies have shown that the lack of the Jnk3 gene confers neuroprotection to kainic acid (KA), amyloid-β and hypoxia-ischemia situations. However, the specific mechanism involved in such neuroprotection has not yet been elucidated. The present thesis was undertaken in order to clarify the molecular and cellular mechanisms responsible for the neuroprotection observed in mice lacking Jnk3 in different neurodegeneration models: i) kainic acid epilepsy model and ii) 3-nitropropionic acid (3-NP) model of Huntington’s disease. Firstly, the results revealed that the lack of JNK3 protein attenuated the neuronal death induced by kainic acid and modulate the activation/inactivation of p38 and ERK1/2. Although the lack of JNK3 does not confer neuroprotection against 3-NP toxicity. Secondly, our results indicated that the activation of PI3K/AKT pathway in Jnk3 null mice was due to the increased of Pi3kcb transcription and this mechanism is specifically related to the lack of JNK3. Finally, according to the results obtained above, we comparatively analyzed the effect of the absence of JNK3 and JNK1 in KA model. Neuronal death, glial reactivity and gene expression analyses showed that the absence of JNK1, just as what detected in the absence of JNK3, showed neuroprotection against neuronal death induced by KA. Accordingly, a lack of induction of Fasl, Casp3 and Casp8 genes, involved in the extrinsic pathway of apoptosis, was detected in the absence of JNK3 and JNK1. Furthermore, the absence of JNK3 showed a reduction of microglial and astroglial reactivity, while the absence of JNK1 only showed a reduction of astroglial reactivity. Taking together, this data suggesting that both isoforms differ in the way of action.

El resveratrol es un polifenol que se encuentra principalmente en la uva y el vino tinto. Además se ha demostrado que es un mimético de la restricción calórica a través de la activación de Sirtuina 1. Diversos estudios indican que la restricción calórica, y por consiguiente el resveratrol, puede incrementar la longevidad. El resveratrol aumenta la tasa metabólica, la sensibilidad a insulina, la biogénesis mitocondrial, la resistencia física y reduce la acumulación de grasas en ratones. Asimismo, el resveratrol puede ser un fármaco efectivo para prevenir la neurodegeneración asociada a la edad y mejorar los déficits cognitivos y los marcadores neuropatológicos de la enfermedad de Alzheimer (EA). En este estudio hemos analizado el efecto de una dosis baja de resveratrol administrada a través de la dieta durante 8 semanas en ratones SAMP8, un modelo de envejecimiento acelerado que presenta marcadores relacionados con la EA; y una dosis alta durante 7-10 meses en ratones SAMP8 y APP/PS1, un modelo de EA familiar. Los resultados indicaron que la dosis alta de resveratrol aumenta la esperanza de vida en SAMP8. Además, observamos un aumento en la activación de las vías de AMPK y SIRT1, junto con una reducción del déficit cognitivo y de la carga de amiloide tanto en SAMP8 como en APP/PS1. Por último, se caracterizó el estado cognitivo y los marcadores neuropatológicos de la EA en un nuevo modelo que combina las características de los ratones transgénicos APP/PS1 con un fondo génico de senescencia acelerada proveniente de los ratones SAMP8. Los resultados muestran que este nuevo modelo presenta alteraciones en las vías estudiadas, demostrando que el fenotipo de senescencia acelerada exacerba la patología amiloide y tau a edades tardías manteniendo los déficits cognitivos presentes en APP/PS1 y SAMP8. / Resveratrol is a polyphenol found primarily in grapes and red wine. It has also proven to be a caloric restriction mimetic through activation Sirtuin 1. Several studies indicate that caloric restriction and therefore resveratrol, can increase longevity. Resveratrol increases the metabolic rate, insulin sensitivity, mitochondrial biogenesis, physical endurance and reduces fat accumulation in mice. Furthermore, resveratrol may be an effective drug for preventing age-related neurodegeneration, improve cognition and decrease the neuropathological markers of Alzheimer's disease (AD). In this study we analyzed the effect of a low dose of resveratrol administered via the diet for 8 weeks in SAMP8 mice, a model of accelerated aging; and a high dose for 7-10 months in SAMP8 and APP/PS1 mice, a model of familial AD. The results indicated that high doses of resveratrol increases lifespan in SAMP8. In addition, we observed an increase in the activation of AMPK and SIRT1 pathways, along with a reduction of cognitive deficits and amyloid burden in both SAMP8 and APP/PS1. Finally, cognitive status and neuropathologic markers of AD were characterized in a new model that combines characteristics of APP/PS1 transgenic mice in a senescence-accelerated background from SAMP8 mice. The results showed that this new model presents alterations in the studied pathways, demonstrating that the phenotype of accelerated senescence exacerbates amyloid and tau pathology in later life, maintaining the cognitive deficits present in APP/PS1 and SAMP8.

L’objectiu d’aquesta tesi doctoral ha estat elucidar nous mecanismes moleculars que expliquessin els efectes antiinflamatoris i antidiabètics de l’oleat. A més, també s’ha volgut aprofundir en l’estudi dels mecanismes moleculars mitjançant els quals l’activació del PPARß/d evita processos inflamatoris i de resistència a la insulina. Així doncs, el primer objectiu d’aquesta tesi doctoral ha estat estudiar si l’oleat és capaç d’exercir els seus efectes antiinflamatoris i antidiabètics mitjançant mecanismes que modulin l’estrès del RE en cèl•lules musculars esquelètiques. A més, tenint en compte que l’AMPK inhibeix l’estrès del RE, en aquest estudi es va voler elucidar si l’oleat, mitjançant l’activació de l’AMPK, evitava l’estrès del RE responsable de l’aparició de la inflamació i RI induïda pel palmitat. Els resultats obtinguts mostren que l’oleat evita l’estrès del RE induït pel palmitat en miotubs murins C2C12 i humans LHCN-M2. Els efectes de l’oleat sobre l’estrès del RE, així com els seus efectes antiinflamatoris i antidiabètics semblen involucrar la cinasa AMPK, atès que la inhibició farmacològica i molecular d’aquesta proteïna, va revertir els efectes de l’oleat sobre els nivells d’expressió gènica dels marcadors d’estrès del RE, d’inflamació i de RI. En resum, les dades d’aquest estudi indiquen que l’oleat evita l’estrès del RE, la inflamació i la RI produïda pel palmitat en cèl•lules musculars esquelètiques, mitjançant mecanismes que involucren l’activació de l’AMPK. El segon objectiu d’aquesta tesi doctoral ha estat determinar si l’activació de PPARß/d és capaç d’evitar la inflamació i la RI en múscul esquelètic mitjançant mecanismes que involucren l’estrès del RE, així com elucidar si la cinasa AMPK està involucrada en aquest procés. Els resultats obtinguts evidencien que l’activació farmacològica de PPARß/d redueix l’estrès del RE induït per lípids en cèl•lules musculars esquelètiques. Tanmateix, l’activació farmacològica de PPARß/d també va evitar l’estrès del RE, la inflamació i la RI induïda per coneguts activadors d’estrès del RE en cèl•lules musculars esquelètiques mitjançant mecanismes que involucraven l’AMPK. Com a resum, podem concloure que l’activació de PPARß/d evita la inflamació i la RI induïdes per l’estrès del RE en cèl•lules musculars esquelètiques mitjançant mecanismes que involucren l’activació de l’AMPK. Per tant, els resultats obtinguts en aquesta tesi doctoral destaquen el paper de l’AMPK com a proteïna clau a l’hora d’inhibir la inflamació i la RI secundària a l’estrès del RE. Així, podem proposar que el seguiment d’una dieta mediterrània, la qual conté l’oli d’oliva com a greix essencial, juntament amb la pràctica d’exercici físic, podria ser una bona estratègia per a la prevenció de la DM2. De la mateixa manera que l’oleat, l’activació farmacològica de PPARß/d inhibeix l’estrès del RE responsable de la inflamació i la RI en múscul esquelètic mitjançant l’activació de l’AMPK. Així doncs, els resultats d’aquesta tesi doctoral aporten nous mecanismes antidiabètics de l’oleat i dels activadors de PPARß/d que podrien ser bones estratègies futures per a la prevenció de la RI i de la DM2. / Although it is known that oleate has many beneficial effects for the prevention of type 2 diabetes mellitus, the mechanisms by which oleate improves insulin resistance are not completely known. The first objective of this thesis was to examine whether oleate could prevent palmitate-induced endoplasmic reticulum (ER) stress, which is involved in the link between lipid-induced inflammation and insulin resistance. The studies were conducted in mouse C2C12 and human LHCN-M2 myotubes. Palmitate increased the levels of ER stress markers, whereas oleate did not. In palmitate-exposed cells incubated with a lower concentration of oleate, the effects of palmitate were prevented. Moreover, the ability of oleate to prevent palmitate-induced ER stress, inflammation and insulin resistance was reversed in the presence of the AMP-activated protein kinase (AMPK) inhibitor, compound C, or by overexpression of a dominant negative AMPK construct. Overall, these findings indicate that oleate prevents ER stress, inflammation and insulin resistance in palmitate-exposed skeletal muscle cells by activating AMPK. The second objective of this thesis was to examine whether peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)ß/d could prevent ER stress-associated inflammation and insulin resistance in skeletal muscle cells. Studies were conducted in mouse C2C12 and human LHCN-M2 myotubes, and in skeletal muscle from wild-type and PPARß/d-deficient mice and mice exposed to a high-fat diet. The PPARß/d agonist GW501516 prevented lipid-induced ER stress in mouse and human myotubes and in skeletal muscle of mice fed a high-fat diet. PPARß/d activation also prevented thapsigargin- and tunicamycin-induced ER stress in human and murine skeletal muscle cells. In agreement with this, PPARß/d activation prevented ER stress-associated inflammation and insulin resistance, and glucose-intolerant PPARß/d-deficient mice showed increased phosphorylated levels of inositol-requiring 1 transmembrane kinase/endonuclease-1a in skeletal muscle. Our findings demonstrate that PPARß/d activation prevents ER stress through the activation of AMPK, and the subsequent inhibition of extracellular-signal-regulated kinase (ERK)1/2 due to the inhibitory crosstalk between AMPK and ERK1/2, since overexpression of a dominant negative AMPK construct (K45R) reversed the effects attained by PPARß/d activation. These findings indicate that PPARß/d prevents ER stress, inflammation and insulin resistance in skeletal muscle cells by activating AMPK.

Tesi realitzada al Laboratori de Recerca Translacional de l’Institut de Català d’Oncologia i Institut de d’Investigació Biomèdica de Bellvitge (ICO-IDIBELL) / La viroteràpia amb adenovirus oncolítics es basa en la lisi selectiva de la cèl•lula tumoral a través de la replicació viral. Les principals limitacions d’aquesta teràpia són: la limitada arribada del virus al tumor després de l’administració sistèmica, la baixa dispersió intratumoral i la resposta immune antiviral. En aquesta tesi hem presentat estratègies per millorar la disseminació intratumoral basades en l’augment de l’alliberament viral i en la millora de l’extravasació i penetració del virus al parènquima tumoral, augmentant en els dos casos l’eficàcia antitumoral. Una de les principals barreres a la dispersió intratumoral són els fibroblasts que infiltren el tumor, i que reben el nom de fibroblasts associats a tumor o CAFs. Els CAFs presenten un fenotip tumorigènic i a més no són permissius a la replicació viral. Amb l’objectiu de superar aquesta barrera vam dur a terme un procés de bioselecció a partir d’un estoc d’adenovirus salvatge mutagenitzat. Després de vàries rondes de replicació en CAFs vam aïllar varis mutants que presentaven un alliberament viral incrementat en aquestes cèl•lules. Vam escollir el mutant que presentava el millor fenotip i vam identificar la mutació responsable del seu fenotip a partir de la seqüenciació del genoma complet i del mapatge funcional. La mutació responsable del fenotip és la mutació iLG397T que provoca la truncació de l’extrem C-terminal de la proteïna i-leader de l’adenovirus. Aquest mutant presenta un alliberament viral i una citotoxicitat incrementades en CAFs, fibroblasts normals i un panell de línies cel•lulars tumorals. La truncació de la proteïna i-leader augmenta l’eficàcia antitumoral de l’adenovirus en models de tumors subcutanis en ratolins immunodeficients establerts a partir de cèl•lules tumorals i de mescles de cèl•lules tumorals i fibroblasts, sense afectar a la toxicitat hepàtica i hematològica. Amb l’objectiu d’augmentar encara més la potència oncolítica de l’adenovirus vam combinar la mutació iLG397T amb la mutació E3/19K-445A aïllada prèviament pel nostre grup i que també augmenta l’alliberament viral. El virus amb les dues mutacions presentava un alliberament incrementat però perdia producció de la progènie viral. Per augmentar la potència antitumoral de l’adenovirus oncolític ICOVIR15, vam introduir la mutació iLG397T al seu genoma, generant l’ICOVIR-15i. Aquest virus també presenta alliberament viral, citotoxicitat i eficàcia antitumoral incrementades en un model de carcinoma de pulmó humà. En el model de hàmster siri, un model immunocompetent i semipermissiu a la replicació de l’adenovirus, aquest virus presentava eficàcia antitumoral només al combinar-lo amb gemcitabina. Aquesta combinació augmentava la proliferació de limfòcits després de l’estimulació amb cèl•lules tumorals, i a més el seu efecte no s’observà en el model murí immunodeficient amb tumors subcutanis de hàmster siri. Aquests resultats ens permeten suggerir que l’efecte antitumoral de la combinació de l’ICOVIR-15i amb gemcitabina es deu a una resposta immune antitumoral. També vam demostrar que la combinació amb verapamil, un inhibidor dels canals de calci, augmentava l’alliberament viral, la citotoxicitat i l’eficàcia antitumoral en varis models tumorals. Finalment amb l’objectiu d’augmentar l’extravasació del virus cap a la massa tumoral vam introduir el pèptid de penetració tumoral iRGD a la càpsida del l’adenovirus oncolític ICOVIR-15K. Aquest pèptid permet la internalització de les macromolècules a les que està unit a través de la interacció amb integrines i neuropilina-1 sobreexpressades a la vasculatura i a les cèl•lules tumorals, i de la proteòlisi per part una proteasa tumoral. La inserció d’aquest pèptid a la càpsida de l’adenovirus millorà la transducció tumoral sense afectar a la resta d’òrgans, la disseminació intratumoral i l’eficàcia antitumoral del virus. Aquestes diferents estratègies milloren la disseminació intratumoral del virus i l’eficàcia antitumoral i poden ser combinades amb altres estratègies com la degradació de la matriu extracel•lular per millorar encara més l’eficàcia de la teràpia. / Virotherapy with oncolytic adenoviruses holds promise as a new cancer treatment. The main barriers to virotherapy are the poor tumor targeting after systemic administration, the limited intratumoral dissemination hampered by the fibroblasts, and the extracellular matrix present in the tumors and the antiviral immune response. In this thesis we present different strategies to enhance adenovirus intratumoral dissemination based on optimizing adenovirus release and enhancing its extravasation and penetration into the tumor. After multiple rounds of replication in cancer associated fibroblasts (or CAFs) of a mutagenized stock of adenovirus wild type, we isolated an enhanced-release mutant. The mutation responsible for this phenotype, the iLG397T mutation, was identified by sequencing and functional mapping. This mutation enhances adenovirus release and cytotoxicity in CAFs, normal fibroblasts, and a panel of tumor cells. Moreover this mutation increases the antitumor efficacy of the virus in immunodeficient mice with tumors established from tumor cells and mixtures of tumor cells and CAFs. To increase the potency of the oncolytic adenovirus ICOVIR-15, we introduced the iLG397T mutation into its genome, generating the ICOVIR-15i. This virus also displayed enhanced release, cytotoxicity, and antitumor efficacy in a lung carcinoma model. In Syrian hamsters, an immunocompetent semi-permissive model, only the combination of ICOVIR-15i with gemcitabine shows antitumor activity. This antitumor activity led to a lymphocyte proliferation increase after stimulation with tumor cells, and was not observed when the same experiment was performed in immunodeficient mice. These results suggest that the antitumor efficacy of the combination of ICOVIR-15i and gemcitabine is associated to an immune response against tumor antigens. We also described the combination of the virus with verapamil, a calcium channel blocker, to enhance adenovirus release, cytotoxicity and antitumor efficacy. Finally to improve adenovirus extravasation and penetration into the tumor mass, we inserted the iRGD tumor penetrating peptide into ICOVIR15K capsid. The iRGD peptide enhanced internalization into cells by the interaction with integrins and neuropilin-1, after a proteolytic cleavage by a tumor protease. Integrins and neuropilin-1 are overexpressed in the tumor cells and vasculature. The insertion of the iRGD peptide enhanced tumor transduction, intratumoral dissemination of the virus and antitumor efficacy.

El text de la secció 1 dels capítols 1 i 2 ha estat retirat seguint instruccions de l’autora de la tesi, en existir participació d’empreses, existir conveni de confidencialitat o existeix la possibilitat de generar patents / El texto de la sección primera de los capítulos 1 y 2 ha sido retirado siguiendo instrucciones de la autora, al existir participación de empresas, convenio de confidencialidad o la posibilidad de generar patentes / The text of 1st. Section of Chapters 1 and 2 has been withdrawn on the instructions of the author, as there is participation of undertakings, confidentiality agreement or the ability to generate patent / En la actualitat, la gran majoria de les noves entitats químiques emergents, són entitats químiques amb una permeabilitat acceptable però amb una absorció molt limitada degut a la seva baixa solubilitat (Classe II segons BCS). Per aquest motiu, la investigació i el desenvolupament de noves entitats químiques ha avançat en l’estudi i la selecció de formulacions basades en solucions i suspensions sòlides. Aquestes formulacions s’aconsegueixen quan el principi actiu es presenta en forma de solució ò suspensió molecular englobat en un excipient o bé una mescla d’excipients vehiculitzants. Això pot ésser molt avantatjós alhora de millorar la solubilitat del principi actiu. Aquesta tesi doctoral, fruit de la col•laboració entre varies disciplines, per tal d’aconseguir formulacions viables i millorades que continguin molècules de Classe II (segons BCS), es centra en els aspectes galènics d’aquest estudi, la metodologia emprada per destriar i caracteritzar formulacions viables, el canvi d’escala, la producció de mostres per a estudis “in vivo” i la transformació final de totes aquestes tasques de pre-formulació inicial en l’elaboració de formes farmacèutiques. En els estudis experimentals duts a terme s’ha realitzat un cribratge ràpid de formulacions binàries i ternàries per l’estudi de solucions i suspensions sòlides mitjançant tècniques innovadores i eficients. S’ha comprovat que les tècniques de cribatge ràpid a escala de laboratori emprant la premsa per fusió i el “solvent casting” són viables i representatives, de forma qualitativa, dels resultats que s’obtenen per tècniques d’extrusió per fusió i fins hi tot dels resultats “in vivo”. La tècnica de “solvent casting” miniaturitzat permet, de forma eficient, solventar el repte d’analitzar una combinatòria molt elevada de mostres per trobar possibles formulacions candidates. S’ha demostrat també, la viabilitat industrial de les formulacions obtingudes en el cribratge, així s’han ratificat la relació dels resultats, a nivell qualitatiu, de l’estudi del cribratge amb els estudis “in vivo” Posteriorment s’han emprat els resultats d’aquest cribratge per l’elaboració de formes farmacèutiques que permetin l’administració oral de fàrmacs poc solubles de forma estable, segura i eficaç. L’estudi extens del capítol 2 ha demostrat la viabilitat de l’elaboració de formes farmacèutiques, tant d’alliberació immediata com controlada, que continguin solucions o suspensions sòlides, tant de tipus sòlid com semisòlid, que han demostrat una millora de la solubilitat del principi actiu. / At present, the vast majority of new chemical entities emerging have acceptable permeability but a very limited absorption due to its low solubility (according to BCS Class 2). For this reason, research and development of new chemical entities has advanced the study and selection of formulations based on solid solutions and solid suspensions. These formulations are obtained when the active ingredient is in the form of a solution or a suspension embedded molecularly into an excipient or mixture of excipients. This can be extremely advantageous to improve the solubility of the active ingredient. This thesis is the result of collaboration between various disciplines, to achieve viable and improved formulations containing class 2 molecules (as BCS), and focuses on formulation aspects of this study, the methodology used to screen and characterize viable formulations, the scale-up, manufacturing of samples for “in vivo" studies and finally moving these concepts to the development of dosage forms. In the experimental studies, rapid screening of binary and ternary formulations for the study of solid solutions and suspensions using innovative and efficient techniques were carried out. It has been proven that the rapid screening techniques at laboratory scale using the melt press and "solvent casting" are viable and representative, qualitatively, of the results obtained by extrusion techniques. We also demonstrated the feasibility of industrial formulations obtained in the screening, and have confirmed the relation of the results, qualitatively; to the "in vivo" studies. Subsequently the results of the screening were the basis for the development of dosage forms that allowed oral administration of low solubility drugs that were proven stable.

El principio activo investigado es el elomotecan, un análogo semisintético de las camptotecinas que presenta actividad antitumoral al inhibir la topoisomerasa I y II. Los objetivos de esta investigación son: i) desarrollar un método analítico fiable y adecuado para el análisis de las muestras plasmáticas de elomotecan en ratón, rata, perro y mono, ii) caracterizar el comportamiento farmacocinético del elomotecan tras su administración a las especies animales mencionadas y iii) desarrollar un modelo de escalado entre especies que permita predecir el comportamiento del elomotecan en el hombre. La técnica analítica utilizada para el análisis de las muestras plasmáticas de las diferentes especies ensayadas fue la extracción en fase sólida on-line acoplada a la cromatografía líquida de alta eficacia y a la espectrometría de masas en tándem con ionización por electrospray (On-line SPE-HPLC-MS/MS). El análisis farmacocinético de los datos concentración plasmática vs tiempo obtenidos en los diferentes estudios realizados, se efectuó mediante la aproximación no compartimental y la aproximación poblacional, comparándose así ambas aproximaciones. Para el desarrollo del modelo alométrico se empleó la aproximación poblacional, usándose algunos de los factores correctores del aclaramiento descritos en la bibliografía. Las conclusiones de la investigación evidencian que el modelo de tres compartimentos con eliminación de primer orden desde el compartimento central es el que se ajustó más satisfactoriamente los datos, a excepción del mono, en el que el modelo seleccionado fue el de dos compartimentos con eliminación de primer orden desde el compartimento central. En el ámbito de dosis ensayado, el elomotecan presentó un comportamiento lineal en todas las especies. El volumen de distribución observado se consideró medio (1.9 a 4.9 L/kg) y el aclaramiento bajo-medio con una tasa de extracción comprendida entre 0.086 y 0.7. El modelo alométrico desarrollado infra predice el aclaramiento observado en humanos posiblemente debido a las diferencias en el metabolismo y elimicación del elomotecan en las diferentes especies empleadas en el desarrollo preclínico del fármaco. / Elomotecan is a camptothecin analogue belonging to the homocamptothecin family (hCPT) that can inhibit both topoisomerases I and II. The main objectives of this study were: i) to develop a bioanalytical method reliable to quantify the samples of elomotecan in mouse, rat, dog and monkey plasma, ii) to establish the pharmacokinetics properties of elomotecan in mouse, rat, dog and monkey from different preclinical studies and iii) to develop an allometric scaling model to predict the behavior of elomotecan in man from preclinical data. The plasmatic samples were analyzed by an on-line solid-phase extraction coupled to liquid chromatography- tandem mass spectrometry method (on-line SPE-LC-ESI-MS/MS) using the threefold deuterated elomotecan as internal standard. The PK analysis was realized using the non-compatimental and the population approach. The allometric scaling model was developed using the nonlinear mixed-effects modeling using different correction factors to improve the clearance prediction in man. The three-compartment kinetic model with first order elimination process provided the best fit of the data in mouse, rat and dog. For monkey data, the two-compartment kinetic model with first order elimination process provided the best fit. In the dose range tested, elomotecan had a lineal behaviour in all the species. The volume of distribution was medium (1.9 a 4.9 L/kg) and the clearance was considered low-medium with a extraction ratio between 0.086 and 0.7. The allometric model underestimated the clearence observed in humans, probably due to the differences between species in the metabolism and elimination process