La dermatitis atópica canina es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel que cursa con un incremento en la concentración sérica de IgE alérgeno-específicas. Una de las poblaciones celulares más implicadas en el inicio y el desarrollo de esta enfermedad son los mastocitos cutáneos. Los mastocitos son activados en el organismo tras la interacción de los alérgenos con las IgE unidas a su membrana y el consiguiente entrecruzamiento de los receptores de alta afinidad para las IgE (FcRI). De esta forma, se induce la desgranulación de los mastocitos y la liberación y síntesis de mediadores celulares que favorecen el desarrollo de la inflamación. En el hombre y en el ratón existen estudios que demuestran que las IgE tienen un papel regulador de la expresión de los receptores FcRI en la membrana de los mastocitos. Así, una concentración elevada de IgE induce la sobreexpresión de los receptores FceRI, y provoca la liberación por parte de los mastocitos de concentraciones mayores de mediadores inflamatorios que contribuyen al desarrollo de los procesos alérgicos.Hasta el momento, en el perro no existían datos al respecto, y sin embargo es una especie que sufre procesos alérgicos con una alta incidencia. Por ello, el presente estudio pretende evaluar de qué forma influyen las modificaciones en el nivel de IgE del microambiente del mastocito canino sobre su capacidad de liberación y síntesis de mediadores inflamatorios, en concreto de la histamina y el factor de necrosis tumoral (TNF-).Durante este estudio se han llevado a cabo 3 fases:- En primer lugar, se ha conseguido la activación de los mastocitos cutáneos caninos a través de los receptores FcRI y se han desarrollado y puesto a punto técnicas para medir diferentes mediadores (histamina, TNF-a) liberados por estas células .- En segundo lugar se han investigado nuevos métodos para mantener viables los mastocitos caninos en cultivo, mediante la utilización de un factor de crecimiento (SCF) específico para estas células. Paralelamente, se ha evaluado la utilidad de la línea celular de mastocitos neoplásicos C2 como fuente celular alternativa en estos estudios.- Finalmente, se han analizado las consecuencias que presenta la exposición de los mastocitos a una concentración elevada de IgE sobre la liberación de la histamina y el TNF-a liberados, así como sobre la expresión de los receptores FcRI en su membrana.Los principales resultados fruto de la realización de este trabajo se pueden resumir en los siguientes puntos:- Los mastocito caninos cutáneos son capaces de liberar histamina y sintetizar TNF-a, tras su estimulación a través de los receptores FcRI. - Los mastocitos cutáneos caninos pueden ser mantenidos en cultivo mediante la adición de SCF como factor de crecimiento celular, conservando su capacidad secretora.- La co-estimulación de los mastocitos caninos con SCF y anti-IgE potencia de forma significativa la liberación de histamina y TNF-a.- La adición al medio de cultivo de los mastocitos de concentraciones altas de IgE provoca una sobreexpresión de los receptores FcRI en la membrana de estas células. Y ello se traduce en un aumento en la producción de TNF-a cuando estas células son estimuladas a través de sus receptores FcRI. / Canine atopic dermatitis is a chronic imflammatory and pruritic skin disease characterized by an increase in the concentration of allergen specific IgE in the serum of the patients. Skin mast cells play an important role in the pathogenesis of this disease. The binding of IgE to the IgE-high affinity receptor (FcRI) on mast cells membrane, and its subsequent crosslinking by an allergen, is the first step in the cascade of reactions leading to the release of MC proinflammatory mediators, in part responsible for the development of the disease.In addition to its crucial role in mast cell activation, IgE has been shown to regulate the FcRI expression on human and murine mast cell surface. An increase in the concentration of IgE can, therefore, lead to an overexpression of the FcRI receptors, causing an increase in the mediators released by the sensitized mast cells, that can contribute to the development of the allergic process. Although dogs suffer with a high incidence allergic processes, this phenomenon mediated by IgE had not been studied in this specie yet. The main goal of the present study was to analyze whether an increase in the IgE concentration of canine mast cell microenvironment can influence the mast cells mediators release (histamine and TNF- through an IgE-dependent stimulation.This study was carried out in 3 phases:- The first part consisted in setting up the technique to sensitize and activate mast cells through the FcRI receptor, and to measure the different mediators(histamine and TNF-) released by these cells. - We then investigated new methods to maintain viable mast cells in vitro. For this purpose, cells were cultured with Stem Cell Factor (SCF) an specific mast cell growth factor. We also investigated the usefulness of a mastocytoma cell line (C2) as an alternative cell source to perform the experiments.- Finally, we analyzed whether the addition of IgE serum in the culture medium may influence mast cells histamine release and TNF- production after an IgE-dependent stimulation, and also the FcRI expresión in mast cell membrane.The main results of the present study are the following:- Cutaneous mast cells are able to release histamine and synthesize TNF- after an IgE mediated activation.- Cutaneous mast cells can be maintained in vitro by the addition of SCF to the cellular culture medium, maintaining its secretory activity.- The co-stimulation of mast cells with SCF and anti-IgE significantly potentiates the release of histamine and TNF.- The in vitro exposure of skin mast cells to increased serum IgE concentrations enhances their ability to release TNF-upon immunological stimulation.- The significant increase in the number of FcRI positive cells (MC) cultured with IgE-rich serum may reflect an up-regulation of the FcRI on the surface of these cells.

La Legislación de la Unión Europea establece límites muy rigurosos para la presencia de residuos de herbicidas derivados de la urea en aguas y en alimentos. Muchos de estos herbicidas son termolábiles y se descomponen durante el análisis por cromatografía de gases (CG), si bien se pueden determinar de manera indirecta a partir de los productos de degradación.El presente trabajo se propone como objetivos; estudiar el comportamiento de herbicidas derivados de la urea en CG con columnas capilares, evaluar su cuantificación en base a sus productos de degradación térmica, poner a punto un nuevo método de análisis en aguas y vegetales basado en la MEFS y la determinación por CG y aplicarlo al análisis de muestras reales.Para la consecución de los objetivos, se realizó un estudio bibliográfico de las propiedades físico-químicas y de las técnicas de extracción y de determinación, un estudio de los factores que influyen en el análisis por CG y en la MEFS desde matrices acuosas, se calcularon experimentalmente las constantes de distribución aparentes fibra/agua que rigen la MEFS y se aplicó la MEFS al análisis de residuos en aguas naturales y en muestras de vegetales.De los ensayos realizados se obtuvieron las siguientes conclusiones: Los herbicidas derivados de la urea se pueden determinar por CG con detectores de nitrógeno-fósforo, captura electrónica y espectrometría de masas a partir de sus productos de degradación térmica, formados en el inyector con buena sensibilidad y reproducibilidad.La temperatura del inyector es el factor más importante de todos los que influyen en la degradación térmica. La inyección a 300ºC facilita la degradación completa y reproducible de los herbicidas estudiados antes de su interacción con la fase estacionaria de la columna, por lo que es la temperatura elegida para llevar a cabo el resto de los análisis. El disolvente empleado en la inyección de fenilureas es muy importante, así se forman los ésteres carbámicos análogos con metanol y etanol y los isocianatos análogos con acetonitrilo, diclorometano y acetato de etilo mientras que metabenzotiazuron forma un benzotiazol, clorsulfuron una triazina y una fenilsulfonamida con independencia del disolvente empleado.La extracción en fase sólida con discos de octilsílice y posterior análisis de los extractos por cromatografía de gases permite la detección de los herbicidas seleccionados en aguas a concentraciones inferiores a 0'1 mg/L con recuperaciones speriores al 87%.La fibra de poliacrilato muestra mejor eficacia que las de polidimetilsiloxano para la extracción de los herbicidas permitiendo con un tiempo de extracción razonable (60min) alcanzar límites de detección inferiores a 0'1 mg/L.La MEFS con fibra de poliacrilato seguidas de CG permiten el análisis de los herbicidas seleccionados en aguas a concentraciones inferiores a 0'1 mg/L. En la MEFS, el aumento de la fuerza iónica y la dilución de la muestra disminuyen las interferencias de los ácidos húmicos en aguas y la de las partículas sólidas de origen vegetal en hortalizas, proporcionando límites de detección inferiores a los Límites Máximos de Residuos legislados para cebollas, patatas y zanahorias.La MEFS acoplada con la cromatografía de gases permite el análisis de ureas herbicidas en muestras de hortalizas a concentraciones muy por debajo de las exigidas en los Límites Máximos de Residuos Legislados. Una doble extracción realizada a pH 4 y a pH 11, es suficiente para conocer por separado los residuos que proceden de fenilureas herbicidas y los residuos de anilinas que son sus metabolitosLa MEFS acoplada con CG no emplea disolventes y permite realizar la extracción desde muestras acuosas y la determinación de manera automática. Su aplicación en alimentos con alto contenido en agua, abre muchas posibilidades de futuro en el campo del análisis de residuos de plaguicidas en alimentos. / Substituted ureas are an important group of pesticides that are used as herbicides (phenylureas and sulfonylureas) and insecticides (benzoylureas). Phenylurea herbicides (PUHs) are largely used in field applications for pre- and post-emergence weed control in a variety of crops. The main groups of phenylurea herbicides are the N-phenyl-N',N'-dialkylureas, N-phenyl-N'-methoxyureas and compounds containing a heterocyclic group. More recently a group of sulfonylurea herbicides (SUHs) has been developed. Multiresidue and single residue methods generally consist of the same basic steps, but multiresidue methods allow the determination of a large number of pesticides in a single analysis, reducing thus time and cost of analysis. The Maximum Admissible Concentration (MAC) of pesticides in drinking water, defined by European Community Directive as 0.1 mg L-1 for individual pesticides and 0.5 mg L-1 for the sum of pesticides posed certain demands to the analytical methods for pesticide residue determination. Gas chromatographic conditions for determining eight phenylurea æchlortoluron, diuron, fluometuron, isoproturon, linuron, metabenzthiazuron, metobromuron and monuronæ and one sulfonylurea æchlorsulfuronæ herbicides were assessed. Degradation products of herbicides formed in the injector were used for identification. Most phenylureas formed their respective carbamic acid methyl esters, metabenzthiazuron formed an aminobenzothiazol and chlorsulfuron formed an aminotriazine plus a phenylsulfonamide.On-column injections of standards at different temperatures (from -30ºC to 400ºC) using columns with four stationary phases (BPX70, BPX35, BP10 and BPX5) were evaluated to identify the best chromatographic behaviour. The best suited column was BP10-30m. The effect of other factors such as injection mode, injector design, sample volume and the solvent used were also investigated. Instrument detection limits (IDLs) ranged from 0.05 ng for chlorsulfuron to 3 ng for monuron with the NPD and, from 0.01 ng for chlorsulfuron to 5 ng for metabenzthiazuron with the ECD. The RSDs (n=4) were lower than 4% at the 12-25 ng level. The method was applied to analyse surface waters extracted with C18 Empore disks with recoveries higher than 85%. Down to 0.1 mg·L-1 of each herbicide could be determined. Chlortoluron was found (11.4 mg·L-1) in a water sample and its presence was confirmed by gas chromatography-mass spectrometry.Degradation products of chlorsulfuron, chlortoluron, diuron, fluometuron, isoproturon, linuron, metabenzthiazuron, metobromuron, and monuron formed in the gas chromatographic injector were used for identification of their respective herbicide. The spectra of the derived compounds were obtained with a quadrupole mass spectrometric detector working in scan mode (20-450 amu). The solvent used for phenylurea herbicide injection (ethanol, methanol, dichloromethane, and acetonitrile) had influence on the generated compounds. When methanol and ethanol were used as solvents, the major products formed from phenylureas were carbamic acid esters. When acetonitrile or dichloromethane were used, the main derivatives were phenylisocyanates. However, chlorsulfuron and metabenzthiazuron generated a triazine plus a phenylsulfonamide and a benzothiazolamine respectively regardless of the assayed solvent. Linuron and diuron showed the same behaviour and gave degradation products with the same mass spectra. The thermal reactions occurred instantaneously in the injector block favoured by the high selected temperature (300ºC).The derived compounds from urea herbicides can be determined using a BP10-30m column and a Selected Ion Registering (SIR) program based on two to three m/z ions as a way to sensitively detect the presence of urea herbicides in environmental extracts. With standards in methanol the instrumental detection limits ranged from 0.1 pg for chlorsulfuron (detected as 2-chlorobenzensulfonamide) to 1 pg for monuron and metobromuron (both detected as their analogous carbamic acid methyl esters). The RSD were below 9 % at the 5 ng·L-1 level. The response was linear (r > 0.9986) within the 5 ng·L-1 to 25 mg·L-1 range. The unequivocal identification of some phenylurea herbicides was not always possible because some herbicides having analogous structures such as diuron and linuron gave the same derivative.Under the proposed conditions matrix effects were low enough to permit calibration with samples proceeding from ecological (non-pesticide treated) crops. Twelve commercial samples of each carrots, onions and potatoes were analyzed and only three samples of potatoes contained residues of linuron at levels below MRL.

Les malalties articulars representen un problema de salut rellevant amb un prevalença molt alta (a Europa pot variar entre el 11% i el 25%) i que continua augmentant dia a dia en el món occidental. Durant els últims 20 anys, les cèl·lules mare mesenquimals adultes (CMMA) i les seves propietats regeneratives s’han estudiat intensament per trobar aplicacions factibles per a la cura d’aquestes malalties. La combinació d’aquestes cèl·lules amb materials sintètics, com els biopolímers, ha fet sorgir una nova branca mèdica, la medicina regenerativa. El treball que es presenta a continuació aborda el desenvolupament d’una teràpia basada en la medicina regenerativa pel tractament de lesions osteocondrals, on el cartílag articular afectat no es pot reparar ni regenerar per si sol. Es planteja el disseny i la realització d’un assaig preclínic per a la regeneració d’una lesió osteocondral artificial en model animal, oví en aquest cas, mitjançant una combinació de CMMA i un biopolímer. Com a punt de partida, es realitzen estudis de caracterització de les diferents fonts cel·lulars de CMMA provinents de tres teixits diferents: cartílag hialí, moll d’os i greix. S’han posat a punt els mètodes d’aïllament i expansió, i s’ha realitzat una caracterització de les cinètiques de creixement de les CMMA, obtenint resultats que indiquen una relació inversament proporcional entre la densitat de sembra i la velocitat específica màxima de creixement. Es demostra que les CMMA són mesenquimals amb l’anàlisi del fenotip, la fisiologia, la morfologia i la multipotencialitat que han mostrat al ser analitzades. Es dissenya un assaig preclínic per a la regeneració de lesions osteocondrals, en el model animal escollit, mitjançant un constructe format per CMMA i un polímer sintètic, l’Àcid poli-làctic-co-glicòlic (PLGA). La fabricació i la caracterització del constructe PLGA-CMMA es realitza en funció de l’assaig dissenyat. El PLGA s’estudia a nivell de porositat i de la seva capacitat per ser colonitzat homogèniament per les CMMA. Histològicament es demostra la colonització homogènia de les CMMA. Un cop caracteritzat el constructe es posa a punt un experiment pilot on s’aïllen CMMA de cartílag hialí extretes d’una ovella, s’expandeixen, es colonitzen en un cilindre de PLGA i es reintrodueixen artroscòpicament a l’articulació femorotibial, on prèviament s’ha generat una lesió osteocondral artificial, per avaluar la possible regeneració o reparació amb els resultats macroscòpics, imatges de ressonància magnètica i histologia de les mostres. Els resultats mostren un constructe biocompatible i bioreabsorbible que regenera cartílag hialí en alguns casos. Per confirmar aquests resultats es realitza un assaig preclínic de les mateixes característiques que el pilot, amb la comparació de les diferents fonts cel·lulars caracteritzades, amb un nombre superior d’animals i amb els temps d’estudi ampliats a 6 i 12 mesos . Els resultats mostren la seguretat del tractament desenvolupat i una eficàcia major en el tractament basat en l’aplicació de PLGA colonitzades amb CMMA provinents de moll d’os. Aquesta memòria s’estructura, doncs, de manera que inicialment es fa una introducció (capítol 1), on es realitza una descripció exhaustiva del cartílag hialí, els diferents tractaments de les patologies osteocondrals, el concepte de la medicina regenerativa, les CMMA, els biopolímers i les interaccions cèl·lula-polímer. Seguidament (capítol 2), es plantegen els principal objectius del treball. Al capítol 3 es realitza la caracterització cel·lular de les CMMA. A continuació ( capítol ) es realitzen els estudis previs amb el PLGA, les CMMA i la seva colonització, per a posar a punt el estudi pilot en model animal. Al capítol 5 es realitza l’assaig preclínic. En el capítol 6, s’exposen les principals conclusions extretes del treball. Finalment, es presenten els materials i mètodes emprats (capítol 7), i s’afegeix l’apèndix (capítol 8). / The joint diseases represent a significant health problem with a very high prevalence (in Europe varies between 11% and 25%) and still rising every day in the western world. Last 20 years, the adult mesenchymal stem cells and their regenerative properties have been studied intensively to find feasible applications for the cure of these diseases. The combination of these cells with synthetic materials such as biopolymers, has emerged a new branch of medicine, regenerative medicine. The work presented below focuses on the development of a therapy-based regenerative medicine for the regeneration of osteochondral injury where the cartilage is affected and cannot repair or regenerate itself. In this dissertation we present a design and realization of a preclinical trial for osteochondral injury regeneration, in sheep animal model, through a combination of CMMA and a biopolymer. As starting point, studies were performed to characterize different cellular sources of CMMA from three different tissues: hyaline cartilage, bone marrow and fat. Different methods have been set up for isolation and expansion of CMMA, and growth kinetics have been characterized, obtaining results that indicate an inverse relationship between seeding density and the maximum specific growth rate. We show that the CMMA are mesenchymal stem cell because of phenotype analysis, physiology, morphology and multipotentiality. A preclinical trial for regeneration of osteochondral lesions in animal model (sheep) is designed and composed by a construct consisting in CMMA colonized in a synthetic polymer, poly-Lactic Acid-co-glycolic (PLGA). The fabrication and characterization of PLGA-CMMA construct is performed based on the trial design. The PLGA is studied in terms of porosity and its ability to be homogeneously colonized by the CMMA. The homogeneous colonization of CMMA is demonstrated histologically. Once the construct is characterized, we set up a pilot experiment where hyaline cartilage was taken from a sheep and then CMMA were isolated, expanded, colonized in a cylinder of PLGA and reintroduced arthorscopically to the femorotibial joint, where previously we had generated an artificial osteochondral injury, to assess the regeneration or repair of articular cartilage. The regeneration evaluation was based on the macroscopic results, magnetic resonance imaging and histology samples. The results show the construct to be biocompatible, bioreabsorbible and hyaline cartilage regeneration in some cases. To confirm these results we performed a preclinical trial of the same features as the pilot, with comparison of different cell sources characterized before (bone marrow, hyaline cartilage and fat), with a larger number of animals and extended period study to 6 and 12 months. The results show safety and higher efficacy in the treatment based on the application of PLGA colonized with CMMA from bone marrow. This work is structured initially with an introduction (Chapter 1), which performs an exhaustive description of the hyaline cartilage, the different treatments of osteocondral pathologies, the concept of regenerative medicine, the CMMA, the biopolymers and cell-polymer interactions. Then (chapter 2), we set the main objectives of the work. In chapter 3 cellular characterization of CMMA is performed. Then (chapter 4) the preliminary studies with PLGA, the CMMA and colonization is performed in order to set up the pilot study in animal model. Chapter 5 performs preclinical trial. Chapter 6 summarizes the main conclusions of the work. Finally, there is the materials and methods (Chapter 7) used in this work, and Appendix (Chapter 8).

El abuso de sustancias en los países occidentales ha acontecido un problema de salud pública. Lamentablemente, estas sustancias de abuso son además una carga para las personas que no las consumen, por ello, la población pediátrica es especialmente vulnerable. Desde la década de los ochenta, la eventual presencia y disposición de una sustancia de abuso en el organismo y su correlación con efectos clínicos y/o subjetivos ha sido evaluada mediante el análisis de plasma u orina. Sin embargo, realizar estas determinaciones en fluidos y matrices biológicas diferentes a la sangre y la orina (de aquí su nombre “fluidos y matrices no convencionales”) resultan ser mucho más atractivas. Valoración de la exposición a sustancias de abuso durante el inicio de la gestación mediante el análisis de placenta. La determinación de sustancias de abuso en muestras de placenta obtenidas cómo material de descarte en mujeres que interrumpieron voluntariamente su embarazo sirvió para confirmar la transmisión de las drogas de abuso al feto durante el primer trimestre de gestación. Exposición pasiva a drogas de abuso mediante el análisis de cabello. En este trabajo se ha utilizado el análisis de cabello con el fin de esclarecer la prevalencia insospechada de exposición a cocaína en niños de edad preescolar visitados en un servicio de urgencias pediátrico sin presentar signos indicativos de una exposición a sustancias de abuso. Las muestras de cabello de 21 niños (23.3%) fueron positivas para cocaína (COC) (rango de concentración: 0,3 – 5.96 ng/mg cabello) y además una de ellas fue positiva para 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA) y otra para opiáceos. En el 88% de los casos positivos, también se halló la presencia de COC en la muestra de cabello del padre que acompañaba a su hijo a la visita hospitalaria. En vista de los resultados obtenidos, abogamos por el cribado mediante el análisis de cabello para esclarecer la presencia de COC y otras sustancias de abuso en niños pertenecientes a ambientes de elevado riesgo de exposición a sustancias de abuso. Valoración de la exposición pasiva a humo de tabaco mediante el análisis de dientes de leche. El uso de los dientes de leche, los cuales empiezan a formarse en la etapa prenatal puede informar acerca de la acumulación de nicotina (NIC) y otros metabolitos durante toda la infancia. Por ello, se ha desarrollado una metodología basada en la LC-MS-MS con el fin de poder detectar cantidades ínfimas de estos metabolitos en dientes de leche. Los resultados en 64 muestras de dientes mostraron que tan solo la NIC era capaz de discriminar estadísticamente entre los niños expuestos ambientalmente al humo de tabaco. Estos prometedores resultados abogan por la inclusión de la monitorización de los niveles de NIC en dientes en estudios epidemiológicos con el fin de categorizar la exposición acumulativa al humo de tabaco durante toda la infancia. Discusión y conclusiones. Esta tesis pone de manifiesto la alta exposición pasiva e insospechada a las principales sustancias de abuso tanto legal (tabaco) como ilegal (cocaína) gracias al empleo de biomarcadores detectados en matrices no convencionales como la placenta, el pelo y los dientes de leche en niños diferentes etapas de la infancia. En conclusión, con el fin de detectar la exposición a sustancias de abuso en las diferentes etapas de la infancia (incluyendo la etapa prenatal y la etapa postnatal) es recomendable utilizar diferentes matrices no convencionales (o alternativas) con el fin de minimizar la invasividad en la recogida de las muestras en comparación con las matrices utilizadas tradicionalmente. / The substance abuse in developed countries has become a public health problem. Unfortunately, these substances of abuse are also a burden for people who do not consume; therefore, the pediatric population is especially vulnerable. Since the eighties, the possible presence of a substance abuse in the body and its correlation with clinical effects and / or subjective effects has been assessed analyzing plasma or urine. However, the determination of this substances in biological fluids and matrices different than blood and urine (hence the name "non-conventional fluids and matrices") are much more attractive. For the non-invasiveness in the collection of the samples and the fact that can provide much more information about the exposure, biological matrices such as placenta, hair and teeth, are good matrices to assess chronic exposure to drugs of abuse during different stages of the childhood. Assessment of the exposure to substances of abuse during early gestation by analysis of the placenta. The determination of drugs of abuse in samples of placenta obtained as discard material in women who voluntarily terminated their pregnancy served to confirm the transmission of drugs of abuse to the fetus during the first trimester of gestation. Passive exposure to drugs of abuse using hair analysis. In this work we used hair analysis to clarify the unexpected prevalence of cocaine exposure in preschool children visited in the pediatric emergency department with no signs indicative of exposure to substances of abuse. Hair samples from 21 children (23.3%) were positive for cocaine (concentration range: 0.3 - 5.96 ng / mg of hair) and also one of them was positive for MDMA and another one for opiates. In 88% of positive cases, also found the presence of cocaine in the hair sample of the parent who accompanied his son to the hospital visit. In view of these results, we advocate screening by hair analysis to ascertain the presence of cocaine and other substances of abuse in children from high-risk environments of exposure to substances of abuse. Assessment of passive exposure to tobacco smoke by the analysis of dedicious teeth. We used decidious teeth, which begin to form in the prenatal stage, to report the accumulation of nicotine (NIC) and other metabolites throughout childhood. Therefore, we have developed a methodology based on LC-MS-MS in order to detect minute amounts of these metabolites in decidious teeth. The results obtained in 64 samples of teeth showed that only the NIC was able to discriminate statistically among children exposed to tobacco snuff environmentally. These promising results argue for the inclusion of monitoring NIC levels in teeth in epidemiological studies to categorize cumulative exposure to passive smoke throughout childhood. Discussion and conclusions. This thesis reveals the unsuspected high passive exposures to the main substances of abuse both legal (tobacco) and illegal (cocaine) by the use of biomarkers detected in non-conventional matrices such as the placenta, hair and teeth in children different stages of childhood. In conclusion, in order to detect exposure to substances of abuse in different stages of childhood (including prenatal and postnatal) is recommended to use different non-conventional matrices (or alternatives) in order to minimize the invasiveness collecting samples as compared with traditionally used matrices.

La maximización del beneficio en salud para los pacientes exige, dada la coyuntura política y económica del estado español, la priorización de los recursos en salud. Ésta debe obedecer a la valoración de un estadio evolutivo social y plasmar la complejidad de los diversos factores que convergen en el campo de la salud. Con el uso combinado de variables de resultado en salud (VRS) clínicas, económicas y humanísticas, podría alcanzarse una adecuada priorización de recursos, ya que éstas pueden reflejar los distintos atributos y dimensiones del estado de salud del paciente y de la población junto al desempeño del sistema sanitario. Se desconoce qué VRS son adecuadas en gestión sanitaria. El objetivo de la investigación es el de diseñar una metodología estándar que permita la elaboración de Catálogos de VRS por patología para su uso en gestión sanitaria y aplicar la metodología propuesta para la realización de un Catálogo de VRS en esquizofrenia. Los pasos para la elaboración de un Catálogo de VRS por patología son los siguientes: 1) Estudio de la enfermedad; 2) Identificación de las VRS que se utilizan para evaluar la enfermedad (revisión sistemática de la literatura); 3) Categorización de las VRS por el objetivo que persiguen medir; 4) Evaluación de la utilidad de las VRS para la toma de decisiones en gestión sanitaria, para ello, se calcula el Índice de Utilidad (IU), en una escala del 0 al 10, considerando 7 propiedades de la VRS: viabilidad para su uso en la práctica clínica habitual, validez, sensibilidad, facilidad de interpretación, amplitud, fiabilidad y experiencia en uso. El IU se divide en tres tramos en función de la puntuación obtenida, transformándose en un grado de recomendación alto (A), medio (B) o bajo (C), de la VRS, para su uso en gestión sanitaria. 5) Elaboración del instrumento para facilitar la implementación de los resultados obtenidos, es decir, elaboración del Catálogo. La esquizofrenia se caracteriza tanto por la heterogeneidad de los síntomas, entre los distintos individuos que la padecen, como por su variabilidad en el curso. De las 736 referencias identificadas en la revisión sistemática, 98 artículos fueron incluidos en la revisión. Estos contienen 263 VRS que se clasificaron en 3 dominios, 10 tipos, 30 subtipos y, dependiendo del subtipo, en clases y grupos. Los principales resultados por dominio y grado de recomendación son: 66 variables clínicas (7,7% de alta, 47,7% de media y 44,6% de baja utilidad); 78 variables humanísticas (16,7% de alta; 38,5% de media y 44,9% de baja utilidad); 119 variables económicas (5,9% de alta, 17,6% de media, y 76,5% de baja utilidad). Se utilizan muchas VRS con objetivos muy diversos. Esta situación refleja la dificultad existente para evaluar los diferentes dominios que enmarca esta patología. El 40,7% de las VRS podrían ser apropiadas y válidas para su uso en gestión sanitaria, grado de recomendación A y B. Para muchas VRS no hay suficiente evidencia para su uso en gestión sanitaria, pese a ello, son utilizadas. Una mejor comprensión de la validez y utilidad de estas VRS, en especial de aquellos tipos con mayor escasez de variables adecuadas es altamente recomendado, así como el desarrollo de escalas con indicadores de uso de recursos y pérdida de productividad. La calidad de la asistencia sanitaria y el estado de salud de los pacientes con esquizofrenia podría mejorarse si los gestores sanitarios utilizasen en su gestión diaria las VRS recomendadas en esta revisión. Un Catálogo de VRS por patología podría resultar una herramienta útil para mejorar la eficiencia del sistema, pudiendo incidir en: medir la eficacia y efectividad de las intervenciones médicas, fármacos y otras tecnologías sanitarias; estimar las necesidades de la población para planificar y organizar los recursos en consecuencia; distribuir los recursos conforme a la evidencia científica disponible; priorizar entre diferentes programas y tecnologías sanitarias; fomentar la integración de los servicios asistenciales y asegurar la continuidad del proceso asistencial; promover la democratización de los procesos por la inclusión de la sociedad en la toma de decisiones y; sustentar una atención global centrada en el paciente que respete sus valores y preferencias. / A catalogue of outcomes for use in the healthcare decision-making process: methodological design and application Outcomes have become increasingly necessary in the decision-making process to define, monitor, and measure healthcare policies and to reallocate resources in an efficient way. This has generated a wide range of new outcomes that incorporate patient and payer perspectives and can be scored in several ways; from individual questions to more complex questionnaires and indicators. The objective of this study is to design a methodology to assess outcomes’ utility for the decision-making process and to apply this methodology to schizophrenia. To assess and classify the utility of outcomes a systematic review, an evidence-based Utility Index (UI) and a classification of the outcomes into high, medium and low utility is proposed. The UI, from 0 to 10, takes into account seven components: feasibility for routine use, scope, previous experience on its use, validity, sensitivity, reliability, and understanding. The first three properties were scored in a scale from 0 to 2, whereas the last four in a scale from 0 to 1. An intermediate score was established for each property. Depending on the UI obtained, outcomes were grouped into three categories: high (UI: 7.5–10), medium (UI:>5–<7.5), and low (UI: <5) utility outcomes for the healthcare decision-making process. Of 736 citations identified, 98 met inclusion criteria. A total of 263 outcomes were identified: 66 clinical (7.7% high, 47.7% medium and 44.6% low utility); 78 humanistic (16.7% high; 38.5% medium and 44.9% low utility); and 119 economic outcomes (5.9% high, 17.6% medium and 76.5% low utility). Numerous and diverse outcomes are being used in schizophrenia. This may reflect the difficulty in evaluating schizophrenia and the lack of consensus on the use of outcomes. For many outcomes, not enough evidence has been found to support their systematic use in healthcare decision-making. A better understanding of the validity and appropriateness of outcomes, especially in groups with higher needs (e.g., social functioning), is highly recommended, as is the development of economic scales. The quality of care and health status of patients with schizophrenia could be improved if decision makers base their decisions using the high utility outcomes recommended in this review. The use of adequate outcomes would allow to improve the value of healthcare provision and to guide optimal disease management services proactively.

La cirugía de la epilepsia es una alternativa terapéutica en pacientes con epilepsia focal refractaria a los fármacos antiepilépticos, y para su correcta realización es indispensable localizar de forma precisa la zona cerebral responsable de las crisis epilépticas (Zona Epileptógena, ZE). La Tomografía por emisión de positrones (PET) es una técnica de neuroimagen funcional que puede aportar información diagnóstica y localizadora en los casos en que la Resonancia magnética (RM) cerebral y los registros vídeo-electroencefalográficos (EEG) no son capaces de localizar o caracterizar la ZE. El presente trabajo pretende evaluar la utilidad clínica de la PET en la localización de la ZE en casos de epilepsias sin lesión aparente por RM (epilepsia no lesional) y en casos de múltiples lesiones por RM (epilepsia asociada a esclerosis tuberosa, ET), así como en la caracterización de tumores cerebrales epileptógenos cuyo correcto diagnóstico diferencial tiene implicaciones en la planificación quirúrgica. En el caso de la epilepsia no lesional, se han estudiado 31 pacientes pediátricos mediante PET con el radiofármaco 2-[18F]fluoro-2-desoxi-D-glucosa (18F-FDG), la cual es capaz de mostrar áreas hipometabólicas corticales relacionadas con la ZE. Se estudió además el valor añadido de la fusión de imágenes PET con la RM del mismo paciente (PET/RM). Tanto la PET-FDG como la fusión PET/RM detectaron algún área hipometabólica en el 68% de pacientes. En el 58% de los pacientes el hipometabolismo tuvo algún grado de co-localización con la ZE según los hallazgos por vídeo-EEG. Se demostró además que las imágenes de fusión PET/RM son capaces de guiar una re-inspección dirigida de las RM previamente consideradas normales, poniendo de manifiesto pequeñas displasias corticales inicialmente no detectadas en 9 pacientes. En el caso de la epilepsia en pacientes con ET, una enfermedad que cursa con múltiples tumores hamartomatosos o túbers en el cerebro, se analizaron 12 pacientes mediante PET con alfa-[11C]metil-L-triptófano (11C-AMT). Trabajos previos han sugerido que un aumento de captación de 11C-AMT en un túber cortical en concreto lo identifica como la lesión responsable de las crisis epilépticas. En nuestro estudio, se detectaron 2 túbers intensamente hipercaptantes en 2 pacientes, y otros túbers con hipercaptación discreta en 4 pacientes. Solamente los túbers con hipercaptación intensa mostraron ser epileptogénicos según los registros EEG. En un análisis por lesiones (126 túbers en los 12 pacientes), la PET-AMT mostró una sensibilidad del 12% y una especificidad del 100% en la detección del túber epileptógeno. En el caso de los tumores epileptógenos, se revisaron 52 pacientes operados por tumores de lento crecimiento (21 gliomas, 10 gangliogliomas y 21 tumores disembrioplásticos neuroepiteliales o DNET) a los que se les había realizado una PET con [11C]metil-L-metionina (11C-MET), un radiotrazador habitualmente utilizado en neurooncología. Todos los gliomas y gangliogliomas mostraron hipercaptación moderada o intensa en la PET-MET, mientras que solamente los DNET mostraron un nivel de captación normal de 11C-MET (en 9 de los 21 DNETs). Un análisis semicuantitativo de las imágenes PET-MET mostró una sensibilidad de 89% y una especificidad de 90% para la discriminación de los DNET frente a otros tipos tumorales. En conclusión, la PET con diferentes radiotrazadores es una técnica útil en la valoración prequirúrgica de pacientes con epilepsia refractaria en diferentes situaciones clínicas: -La PET-FDG detecta áreas hipometabólicas relacionadas con la ZE en una proporción significativa de pacientes, y la fusión PET/RM es capaz de revelar pequeñas lesiones previamente no detectadas. -La PET-AMT es una técnica poco sensible pero altamente específica en la detección del túber responsable de las crisis en pacientes epilépticos con ET. -La detección de una captación normal por PET-MET en tumores epileptógenos de lento crecimiento es muy sugestiva de una histología de DNET. / Epilepsy surgery is an alternative approach in patients with medically-resistant focal epilepsy, and its goal is the removal of the cortical region causing the seizures, i.e., the epileptogenic zone (EZ). Positron Emission Tomography (PET) is a functional neuroimaging technique which can contribute to the presurgical detection and characterization of the EZ. The aim of this study was to evaluate the clinical utility of PET in the presurgical evaluation of epilepsy in different clinical settings: (1) patients with no detectable lesion by Magnetic Resonance Imaging (non-lesional MRI), (2) patients with tuberous-sclerosis (TS) related epilepsy and multiple brain lesions, and (3) patients with epileptogenic tumors. All patients had received at least one MRI scan and scalp video-electroencephalographic (EEG) recordings as part of their presurgical work-up. The non-lesional cohort comprised 31 pediatric patients who underwent PET with 2­[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose radiotracer (18F-FDG). PET-FDG images detected hypometabolic cortical areas in 21/31 (68%) patients, and this hypometabolism showed some degree of concordance with the EZ defined by video-EEG in 18 patients. Through the spatial coregistration of PET with the MRI of the same patient, a second interpretation of MRI studies was carried out focusing on the exact anatomic region in which the hypometabolism was located. This analysis led to the detection of previously missed focal cortical dysplasias in 9 cases. The TS-related epilepsy cohort comprised 12 patients with multiple cortical hamartomas or “tubers”, who underwent PET with alpha-[11C]methyl-L-tryptophan (11C-AMT), a radiotracer whose uptake is supposed to be selectively increased in the tuber responsible of the seizures. Two of 12 patients demonstrated a tuber with clearly increased 11C-AMT uptake, and tubers with mild increased uptake were also detected in 4 patients. Only those two tubers with clearly increased 11C-AMT uptake proved to be epileptogenic on intracerebral EEG recordings, thus yielding a PET-AMT per-lesion sensitivity of 12% and specificity of 100%. Finally, we reviewed 52 patients with epileptogenic tumors (21 gliomas, 10 gangliogliomas and 21 dysembryoplastic-neuroepithelial-tumors or DNT) which had undergone a PET with [11C]methyl-L-methionine (11C-MET) prior to surgical resection. All gliomas and gangliogliomas were associated with increased 11C-MET uptake, whereas 9/21 DNTs had normal 11C-MET uptake. Semiquantitative PET ratios showed a cutoff threshold that distinguished DNTs from other tumor types with 90% specificity and 89% sensitivity. In conclusion, PET with the evaluated radiotracers is a useful neuroimaging tool in the presurgical work-up of patients with refractory epilepsy, as it significantly contributes to the localization and characterization of the EZ.

El objetivo principal de este estudio consiste en la investigación y desarrollo de la formulación de un nuevo medicamento semisólido con acetato de hidrocortisona en forma farmacéutica de enema rectal. Esta formulación pretende cubrir un vacío terapéutico en el tratamiento de la Enfermedad inflamatoria intestinal, en concreto la colitis ulcerosa. Para ello es necesario tener en cuenta las especificaciones indicadas en la modificación de la Ley del Medicamento y posteriores circulares del Ministerio de Sanidad y Consumo, donde se establecen los requisitos técnico-sanitarios que deben cumplir estos medicamentos para garantizar su calidad, seguridad y eficacia, así como las Recomendaciones internacionales “Note for Guidance on Pharmaceutical development (ICH Q8)”, en donde se establecen asimismo las bases para completar el apartado 3.2.P.2. del desarrollo farmacéutico del documento de registro según el formato “Common Technical Document” (CTD). Para ello se ha realizado una investigación galénica que comprende una parte tecnológica y una parte de estabilidad. En concreto, se han investigado las características químicas, físicas y tecnológicas de la materia prima motivo de estudio (hidrocortisona), con el fin de establecer su calidad y su cumplimiento con los criterios de aceptación, tanto de Farmacopea como propios, que aseguren la obtención de un medicamento de calidad, seguro y eficaz. Asimismo se ha estudiado el diseño de una formulación robusta y adecuada en concordancia con el principio activo y su forma farmacéutica, lo que implica la realización del correspondiente estudio de preformulación en donde se incluya la investigación experimental de la compatibilidad de excipientes con el principio activo. También se ha establecido la técnica de elaboración más adecuada, lo que implica establecer las condiciones idóneas de elaboración y la validación de la técnica establecida. Ello implica también el correspondiente estudio de transposición a escala industrial, con el fin de obtener lotes industriales que den lugar a unidades de dosificación que cumplan con las especificaciones establecidas en el diseño y desarrollo de la formulación. Se ha llevado a cabo la investigación y desarrollo de una nueva metódica analítica indicativa de la estabilidad, adaptada a la nueva formulación, como control de calidad y para los estudios de estabilidad del nuevo medicamento. Se ha realizado el estudio de validación correspondiente al método de análisis. Por último, dado que uno de los objetivos de la tesis es el desarrollo de un medicamento estable, es necesario realizar la correspondiente investigación de la estabilidad de la fórmula definitiva, tanto en condiciones forzadas como a tiempo real, siguiendo los criterios establecidos en la norma ICH. Así se podrá garantizar que el medicamento desarrollado mantiene las características de eficacia y seguridad durante su período de validez. / The aim of the study is to perform the development of a formulation of a new semi solid drug with hydrocortisone acetate in a rectal enema pharmaceutical dosage form. This formulation is intended to cover a therapeutic void in the treatment of the inflammatory intestinal disease, specifically ulcerative colitis. It is then necessary to take into account the specifications shown in the modification of the “Ley del medicamento” and subsequent circulars of the Ministry of Health and Consumer where the technical and sanitary requirements that medicines should comply are established in order to assure the quality, safety and efficacy of the drug. In addition, it is also needed to take into account the international guidelines “Note for Guidance on Pharmaceutical development (ICH Q8)”, where basis for fulfill the paragraph 3.2.P.2. of the pharmaceutical development of the regulatory technical file according to the format “Common Technical Document” (CTD), are established. For this purpose it has been performed a galenic research including the technological part and the stability part. Specifically it has been study the chemical, physical and technological characteristics of the raw material (hydrocortisone) with the aim of establish it quality and that it complies with the acceptance criteria from Pharmacopoeia as well as own requirements that assure obtaining a medicine with quality, safety and efficacy. In addition, the design of a robust formulation according with the active pharmaceutical ingredient and its pharmaceutical dosage form has been studied. This means performing the corresponding pre formulation study where the experimental compatibility between excipient and active pharmaceutical ingredient is included. The most suitable manufacturing process has been also established. This means having the suitable manufacturing conditions as well as the proposed process validation. The scale up study needs also to be set up in order to obtain industrial batches with dosage units, which complies with the established specifications in the design and development of the formulation. The development of a new analytical method stability indicating has been conducted. This method can be easily used in the quality control and for the stability studies of the new drug. Analytical validation was conducted in addition.

OBJETIVO. El estudio busca la valoración de la actividad antioxidante e inmunomoduladora in vitro de quince aceites esenciales, cuatro fracciones de aceites esenciales y tres compuestos (timol, carvacrol y eugenol). MÉTODOS. Las muestras fueron caracterizadas por GC y GC-MS. El ensayo del DPPH y la cuantificación de la producción de ROS por oxidación de la 2´,7´-diclorofluorescina diacetato (DCFH-DA) en los leucocitos humanos estimulados (PMA o H2O2) permitieron estudiar la actividad antioxidante. Además se determinó la producción de NO en leucocitos humanos estimulados (LPS) mediante la reacción de Griess y la actividad de la MPO (aislada o en presencia de células) por oxidación del clorhidrato de o-dianisidina. La evaluación por citometría de flujo de la fagocitosis de partículas fluorescentes en neutrófilos humanos y la valoración de la actividad en las vías clásica y alternativa del complemento utilizando suero humano como fuente del complemento permitieron analizar el efecto inmunomodulador de las muestras bajo estudio. PRINCIPALES RESULTADOS. El aceite de clavo y el eugenol mostraron una intensa actividad de captación del radical libre del DPPH (IC50= 13,2 µg/mL y 11,7 µg/mL, respectivamente) y de inhibición de la producción de ROS en neutrófilos estimulados por PMA (IC50= 7,5 µg/mL y 1,6 µg/mL) o H2O2 (IC50= 22,6 µg/mL y 27,1 µg/mL). Los aceites de nuez moscada, jengibre y palmarosa fueron también muy activos en las células estimuladas con PMA mientras que el aceite de orégano español y el carvacrol indujeron aún más producción de ROS en neutrófilos estimulados con H2O2. El pre-tratamiento con clavo, jengibre, eugenol, carvacrol y acetato de bornilo produjo una IC50 in vitro <50,0 µg/mL en los experimentos de inhibición de la producción de NO. La actividad inhibidora sobre la MPO, lo mismo en experimentos con el enzima aislado que en presencia de leucocitos, fue más intensa en el clavo, el tomillo rojo, el orégano español, el eugenol, el timol y el carvacrol. Los isómeros carvacrol y timol mostraron un comportamiento dispar en los ensayos realizados en presencia de leucocitos. La mayoría de los aceites esenciales (nuez moscada, clavo, niaulí, árbol del té, laurel, limón, tomillo rojo, jengibre) y los terpenos de nuez moscada, el eugenol, y el carvacrol inhibieron la fagocitosis de forma leve o moderada (inhibición del 25 al 40% a dosis comprendidas entre 40 y 60 µg/mL); la mayor inhibición se encontró en el timol (72% a 56 µg/mL). Todas las muestras fueron inactivas sobre la vía alternativa del sistema del complemento. En la vía clásica el aceite de clavo, el eugenol, los aceites esenciales de palmarosa, tomillo rojo y estragón, y el carvacrol, fueron los más activos, con valores de IC50 entre 65 y 78 µg/mL. CONCLUSIONES. Tomando el conjunto de pruebas realizadas, la actividad fue mayor en los aceites esenciales ricos en compuestos fenólicos y monoterpenos oxigenados. La divergencia de comportamiento entre el carvacrol y el timol fue más evidente en los ensayos realizados en presencia de leucocitos. El aceite esencial de clavo y el eugenol, su componente mayoritario y responsable de la actividad, han mostrado el mejor perfil antioxidante e inmunomodulador, lo cual justifica su empleo como promotores del crecimiento en los animales de granja. / OBJECTIVES. The aim of the present study was to investigate the in vitro antioxidant and immunomodulatory activity of fifteen essential oils, four essential oil fractions, and three compounds (thymol, carvacrol, and eugenol). METHODS. Samples were characterized by GC and GC-MS. Antioxidant activity was investigated by DPPH and ROS production assays in activated human neutrophils. The effect on NO production, MPO activity, phagocytosis and the complement system were also researched. KEY FINDINGS. Clove oil and eugenol showed strong activity on DPPH free-radical scavenging (IC50.= 13.2 µg/mL and 11.7 µg/mL, respectively) and ROS production in neutrophils stimulated by PMA (IC50= 7.5 µg/mL and 1.6 µg/mL) or H2O2 (IC50= 22.6 µg/mL and 27.1 µg/mL). Nutmeg, ginger and palmarosa oils were also highly active on PMA stimulated cells while Spanish oregano and carvacrol induced further ROS production in neutrophils stimulated by H2O2. Pre-treatment with clove, ginger, eugenol, carvacrol and bornyl acetate produced an in vitro IC50< 50,0 µg/mL in NO inhibition experiments. MPO inhibitory activity in cell-free experiments or in leukocytes presence was the highest for clove, red thyme, Spanish oregano, eugenol, thymol and carvacrol. Isomers carvacrol and thymol displayed a disparate behaviour in tests performed in leukocytes presence. Most of the oils (nutmeg, clove, niaouli, tea tree, bay laurel, lemon, red thyme, ginger), nutmeg terpenes, eugenol, and carvacrol showed mild to moderate inhibition of phagocytosis (25−40% inhibition at doses ranging from 40 to 60 μg/mL); highest inhibitory activity was found for thymol (72% at 56 μg/mL). All samples were inactive in the alternative pathway of complement system, whereas on classical pathway, clove oil, eugenol, palmarosa oil, red thyme oil, tarragon oil, and carvacrol showed the highest activity, with IC50 values ranging from 65 to 78 μg/mL. CONCLUSIONS. Considering tests altogether, activity peaked in oils rich in phenolics and oxygenated monoterpenes. A disparate behaviour between carvacrol and thymol was more evident in tests performed in leukocytes presence. Eugenol proved to be responsible for clove oil activity, showing both substances the best immunomodulatory and antioxidant profile and supporting its use as growth promoters in farm animals.

La present tesis doctoral, presentada com a compendi de publicacions, té com a objectiu general l’estudi de la diversitat en l’espai químic i l’establiment de relacions amb l’espai biològic mitjançant l’ús de tècniques computacionals. Per aconseguir aquest objectiu es van definir dues línies de recerca: l’estudi de noves reaccions multicomponent, i l’estudi de la interacció lligand-receptor per una diana poc comuna i la seva aplicació per al desenvolupament de fàrmacs antigripals. El capítol dedicat a la reactivitat inclou dues publicacions (Preciado S. et al. Angewandte Chemie International Edition, 2012, 51, pp 6874–6877; Llabrés S. et al. Chemistry, a European Journal, 2013, 40, pp 13355– 13361) on es racionalitza el mecanisme d’una nova reacció multicomponent anomenada Mannich Ritter Amidina (MRA). Aquesta es va descobrir mitjançant un canvi d’un reactiu de la reacció multicomponent de Povarov, que va resultar en un producte tetracíclic. Aquest nou producte té una estereoquímica inesperada ja que la unió de dos anells es produeix en syn. Es va dur a terme l’exploració química d’aquesta reacció, la qual va concloure que aquesta reacció MRA només funcionava si s’usaven alguns alquens activats determinats, com ara tipus dihidropirà i ciclohexadiè, i en canvi no en alquens tipus enamides cícliques. A més, quan s’utilitza el ciclohexadiè, la reacció MRA dóna lloc a dues reaccions que entren en competició. L’estudi computacional de explica com la conformació de l’estat de transició és un factor clau en l’estereoselectivitat de la reacció MRA. L’habilitat de deformar la conformació cadira i de bot de l’anell que té caràcter de doble enllaç explica els diferents rendiments de la reacció. El capítol dedicat al disseny d’inhibidors del canal M2 del virus de la grip A inclou dues publicacions (Rey-Carrizo M. et al. Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 57, pp 5738–5747; Rey-Carrizo M. et al. European Journal of Medicinal Chemistry, 2015, 96, pp 318–329) i un manuscrit (en preparació) centrats en el desenvolupament de nous compostos inhibidors del canal M2 nadiu i de la seva variant V27A. Els fàrmacs que inhibeixen aquest canal són amantadina i rimantadina, però la FDA no recomana el seu ús perquè l’aparició de soques mutants ha reduït molt la seva eficàcia. El risc d’una possible pandèmia i l’aparició de soques resistents ha promogut un esforç continuat en la recerca de nous fàrmacs antigripals. En col·laboració interdisciplinar entre diversos grups de disseny, síntesi i avaluació farmacològica, en aquest capítol s’ha estudiat el mecanisme d’acció de fàrmacs inhibidors del canal M2 nadiu i del canal mutant V27A, una mutació generada per l’ús dels fàrmacs. El treball computacional s’ha centrat en l’elucidació dels modes d’unió d’aquests compostos en ambdós canals i en les relacions estructura-activitat mitjançant tècniques de dinàmica molecular i càlculs de mecànica quàntica. Per últim, també s’ha explorat el mecanisme d’unió al lloc d’unió del canal mitjançant dinàmica molecular i tècniques de mostreig exhaustiu, com ara la metadinàmica. Aquests estudis han permès identificar dos llocs d’unió en el porus del canal, i caracteritzar el mecanisme d’unió, que afecta la rotació de l’inhibidor a l’interior del canal. Tanmateix, han permès explicar la dràstica disminució d’activitat d’amantadina pel canal mutat V27A. / The aim of this doctoral thesis is to use computational techniques to expand the chemical space and to explore its interaction with the biological space. To address these two goals, it has been elaborated as a compendium of publications following two main research lines. First, the rationalization of the mechanism of a novel multicomponent reaction known as Mannich Ritter Amidine (Preciado S. et al. Angew. Chemie Int. Ed., 2012, 51, pp 6874 – 6877; Llabrés S. et al. Chemistry, a Eur. J., 2013, 40, pp 13355 - 13361). Second, the development of new inhibitors of the M2 proton channel in order to obtain new antiflu drugs active against resistant strains of influenza A (Rey-Carrizo M. et al. J. Med. Chem, 2014, 57, pp 5738 – 5747; Rey-Carrizo M. et al. Eur. J. of Med. Chem, 2015, 96, pp 318-329). The novel multicomponent reaction (MRA) leads to a tetracyclic compound with syn stereoselectivity. The chemical exploration of this reaction revealed different outcomes and different yields depending on the alkene reactant. Computational calculations showed how the ability to adopt a chair-like conformation during the transition state determines the outcome and the stereochemical properties. The cyclohexadiene lead to two different products from two competing reactions, MRA and aza Diels Alder in 10:90 ratio. Computational calculations explained the outcome and the ratio in the cyclohexadiene case. The development of new M2 channel inhibitors is a multidisciplinary effort in the framework of collaborations with experimental research groups. Using several molecular modelling techniques, such as molecular dynamics simulations and enhanced sampling techniques, we postulate the existence of two distinct binding sites of amantadine in the interior of the channel and determine the mechanism for ligand binding, which involves the flip of amantadine in the pore. Moreover, the results provide a direct explanation for the drastic reduction in inhibitory potency against the V27A mutant channel. Overall, the results provide useful guidelines to design novel antiflu compounds.

En las últimas décadas se ha observado un aumento muy notable de la prevalencia de enfermedades metabólicas como la obesidad, el síndrome metabólico y la resistencia a la insulina. Por ejemplo, en Estados Unidos, casi tres cuartas partes de la población adulta presentan sobrepeso u obesidad. De éstos, casi una tercera parte padecen el síndrome metabólico. En España, un estudio de la Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad (SEEDO) realizado en el año 2000, muestra una prevalencia de la obesidad del 14.5% entre individuos de 25 a 60 años (Aranceta y col., 2003). Por otro lado, la prevalencia mundial estimada para la diabetes en la población adulta era de un 6.4% en el año 2010 y se prevé que este porcentaje aumente hasta un 7.7% en el año 2030, constituyendo la diabetes mellitus de tipo 2 el 90% de los casos (Nolan y col., 2011). Los malos hábitos alimenticios, así como un estilo de vida sedentario, son factores que promueven la aparición de todas estas alteraciones (Johnson y col., 2007). En los últimos años se ha observado un incremento por parte de la población en la ingesta calórica total, a la vez que se ha producido un cambio en la proporción en la que algunos nutrientes forman parte de la dieta humana. En este aspecto, cabe destacar el aumento en el consumo de fructosa debido, principalmente, a su utilización como edulcorante en bebidas refrescantes (Elliot y col., 2002; Lim y col., 2010). De hecho, son muchos los estudios que relacionan este aumento en el consumo de fructosa con la aparición de enfermedades metabólicas (Gross y col., 2004; Welsh y col., 2010). Debido a que la administración de fructosa en ratas produce unos desequilibrios metabólicos similares a los que sufren los humanos con síndrome metabólico, se ha aceptado a la rata alimentada con fructosa como un buen modelo para el estudio de este síndrome (Nagai y col., 2002). Mediante este modelo experimental, nuestro grupo de investigación demostró cómo la administración de fructosa al 10% (peso/volumen, p/v) en el agua de bebida en ratas Sprague-Dawley durante 14 días provocaba una serie de alteraciones metabólicas, entre las que se incluyen esteatosis hepática, hipertrigliceridemia, hiperleptinemia, resistencia a la insulina e intolerancia a la glucosa (Roglans y col., 2007; Vilà y col., 2008; Rebollo y col., 2014b). En el presente trabajo se ha profundizado en el estudio de estas alteraciones metabólicas inducidas por una ingesta de fructosa, así como los mecanismos moleculares implicados. Se ha valorado, además, el efecto que una suplementación de fructosa puede producir sobre otras vías de interés, como son el estrés de retículo endoplasmático, la inflamación o la autofagia hepática. Mediante un estudio comparativo entre una ingesta de fructosa y una de glucosa, se ha analizado el efecto exclusivo que presenta el consumo de fructosa sobre la aparición de dichas alteraciones metabólicas. / In recent decades the prevalence of metabolic diseases such as obesity, metabolic syndrome and type 2 diabetes mellitus has notably increased. Bad eating habits and sedentary lifestyle are factors that promote the occurrence of these disorders (Johnson et al., 2007). During the lasts years total caloric intake has increased, and also the rate at which certain nutrients are part of the human diet has changed. In this sense, the increase in fructose consumption has an important role, mainly due to its use as a sweetener in soft drinks (Elliot et al., 2002; Lim et al, 2010). In fact, many studies link the increase in fructose consumption with the onset of metabolic disorders (Gross et al., 2004. Welsh et al, 2010). Since fructose administration in rats produces metabolic imbalances similar to those suffering in humans with metabolic syndrome, it has been accepted that rat fed with fructose as a good model for the study of this syndrome (Nagai et al., 2002). Using this experimental model, our research group demonstrated previously how the administration of fructose at 10% (w/v) in drinking water in Sprague-Dawley rats for 14 days caused several metabolic disorders, including hepatic steatosis, hypertriglyceridemia, elevated plasmatic leptin levels, insulin resistance and glucose intolerance (Roglans et al., 2007; Vilà et al, 2008;. Rebollo et al, 2014b). In this work we studied the metabolic alterations induced by fructose intake during 56 days in female Sprague-Dawley rats, as well as the molecular mechanisms involved. Also we assessed the effect of fructose supplementation on other pathways of interest, such as endoplasmic reticulum stress, inflammation or liver autophagy. Through a comparative study between fructose and glucose intake, we have analyzed the specific effect of the consumption of fructose on the occurrence of these metabolic alterations.