Nos récepteurs d'intérêt, les récepteurs à l'angiotensine AT1 et AT2, appartiennent à la classe A de la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Jusqu'à très récemment, la rhodopsine bovine était le seul RCPG dont la structure cristallographique était résolue. La structure de la rhodopsine est employée couramment comme modèle en modélisation par homologie des RCPG de classe A. La structure de la rhodopsine est constituée de sept hélices transmembranaires. La plupart de ces hélices ne sont pas droites, mais cassées ou incurvées. Pour comprendre quels sont les motifs structuraux possibles pour les cassures d'hélices, nous avons réalisé une étude exhaustive des motifs d'hélices cassées au niveau d'un seul résidu de jonction (motif HXH) grâce à une base de données de structures d'hélices cassées développée localement. Les résultats montrent que le résidu de jonction n'admet qu'un nombre limité de conformations conduisant à la classification de ces cassures en six motifs bien distincts. Un de ces motifs correspond à une cassure au niveau d'un renflement. Ce motif se retrouve dans l'hélice transmembranaire 2 (TMH2) de la rhodopsine où une cassure se fait au niveau d'un motif GG correspondant à un renflement p. Ce motif GG, situé aux positions 2.56-2.57, n'est pas conservé parmi les RCPG mais une proline est fréquemment observée aux positions 2.58, 2.59 ou 2.60. Nos récepteurs d'intérêt AT1 et AT2 possèdent une proline à la position 2.58. L'étude de l'évolution de l'hélice transmembranaire 2 au sein de la famille des RCPG suggère fortement que la position en 2.58 correspond à une délétion d'un résidu au niveau de la cassure. Ceci est confirmé par des analyses structurales de la Protein Data bank. Ces résultats indiquent que la structure de la rhodopsine peut être utilisée directement pour modéliser l'hélice 2 lorsque la proline est en position 2.59 ou 2.60 (renflement p)/ Lorsque la proline est en position 2.58, la rhodopsine peut aussi être utilisée comme modèle structural à condition de prendre en compte la délétion d'un résidu au niveau du renflement, pour obtenir une cassure proline en coude classique.

L'activité constitutive est une propriété pharmacologique que possèdent de nombreuxrécepteurs couplés aux protéines G. Cependant, son rôle biologique reste largement inconnu.Nous avons étudié les relations entre la pharmacologie et le trafic intracellulaire du récepteurcannabinoïque CB1, un récepteur abondamment exprimé dans le cerveau qui possède uneactivité constitutive avérée. Exprimé dans les cellules HEK-293, l'activité constitutive durécepteur CB1 provoque un cycle continu d'endocytose et de recyclage du récepteur entre lamembrane plasmique et les endosomes intracellulaires : à l'équilibre, le récepteur CB1 estmajoritairement présent dans les endosomes. Le cycle fait intervenir une endocytose par puitsrecouverts de clathrine et un trafic intracellulaire dépendant de Rab5 et de Rab4, mais pas deRab11. Dans les neurones d'hippocampe en culture, ce cycle d'endocytose/recyclage durécepteur CB1 est limité au compartiment somatodendritique, et le récepteur est stable à lasurface de l'axone. Ce cycle dépend de l'activité constitutive du récepteur CB1 etl'endocytose sélective du récepteur dirige l'établissement de l'expression axonale durécepteur CB1 à la surface du neurone.

La FSH est une hormone qui joue un rôle central dans la fonction de reproduction. De ce fait, elle est utilisée en assistance médicale à la procréation (AMP) afin de recruter un pool de follicules et de l’amener jusqu'à l'ovulation. La FSH agit sur un récepteur spécifique (RFSH) qui active des voies de signalisation par l'intermédiaire des protéines G et des β-arrestines. L'étude in vitro d’un mutant et de variants du RFSH décrits chez l’homme nous a permis de mettre en évidence différents mécanismes conduisant à des biais de signalisation de ce récepteur. Ces altérations génétiques, en modifiant l'équilibre qui existe entre les différentes voies de signalisation activées par le RFSH, conduisent à des manifestations cliniques. En parallèle, nous avons mené une étude clinique sur le polymorphisme N680S du RFSH, qui nous a permis de confirmer et de prolonger les résultats de la littérature tout en corrélant les résultats obtenus in vitro à la signalisation des récepteurs N680 et S680. L’ensemble de nos résultats ouvre des perspectives pour le développement de nouvelles stratégies en AMP. / FSH is a hormone which is centrally involved in reproduction. For this reason, FSH is extensively used in in vitro fertilization (IVF) to recruit and lead a pool of follicle to ovulation. FSH acts on its cognate receptor (FSHR) which activates signaling pathways through the canonical G-protein pathways as well as through β-arrestin-dependent transduction mechanisms. In vitro studies of a mutant and of variants of the FSHR identified in patients allowed us to highlight different mechanisms leading to bias in the signaling pathways triggered by this receptor. These genetic alterations, by modifying the equilibrium that exists between the different signaling pathways activated by the FSHR, lead to clinical consequences. In parallel, we have carried out a clinical study centered on the N680S polymorphism of the FSHR. Our results confirm and extend previous studies from the literature while correlating the results we obtained in vitro with the functional consequences of the N680S polymorphism of the FSHR. Together, our results open new avenues for developing new strategies in IVF.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires. Ils contrôlent de nombreux processus physiologiques et leurs implications dans de nombreuses pathologies fait de cette famille une cible de près de 30% des médicaments. Cependant nombre d'entre eux sont orphelins et/ou possèdent des fonctions inconnues, constituant ainsi un réservoir important de cibles pharmacologiques.Afin de déterminer quelles peuvent être les applications thérapeutiques des RCPG, il faut être capable d'identifier les tissus dans lesquels ils s'expriment et ont des effets biologiques. Pour cela, nous avons développé une approche de PCR quantitative à haut débit permettant l'étude de l'ensemble des gènes codants les RCPG murin.Nous avons tout d'abord recherché tous les endoRCPG de souris et pour chacune des séquences identifiées un couple d'amorces a été synthétisé.Nous avons ensuite utilisé cette banque d'amorces dans deux modèles de différenciation cellulaire. La culture primaire de neurones granulaires du cervelet et une lignée de préadipocytes.Nous nous sommes appuyés sur l'hypothèse suivante : si l'expression d'un RCPG varie au cours d'un phénomène particulier, c'est qu'il est possiblement impliqué dans la régulation de celui-ci.Nous avons donc dans un premier temps identifié les endoRCPG dont l'expression variait au cours de la différenciation cellulaire. Dans un deuxième temps nous avons testé par des approches pharmacologiques et de biologie cellulaire l'implication de ces récepteurs dans la régulation des divers aspects de la différenciation cellulaire des modèles étudiés. / G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane receptors and control numerous physiological processes. Accordingly, ~45% of drugs used to treat human pathologies target a GPCR. However, a number of GPCRs are orphans and/or involved in unknown functions, which makes GPCRs an attractive reservoir of pharmacological targets.To identify novel therapeutic applications of GPCR ligands, it is necessary to identify organs in which GPCRs are expressed and have biological effects. To that end, we developed a high-throughput, real-time PCR approach to quantify each and every murine GPCR transcripts. We first established a census of all endo-GPCRs, i.e. those GPCRs having an endogenous ligand, encoded in the murine genome. We then designed and validated a primer pair for each identified sequence.We used this primer collection in 2 models of cell differentiation, namely primary cultures of cerebellar granule neuroblasts and the preadipocyte 3T3-L1 cell line. Our basic premise in this approach is that changes in the expression levels of a GPCR in a given biological phenomenon is an indication that this GPCR might be functionally relevant to the biological process under study.We first focused on GPCRs whose expression changed during cellular differentiation, which enabled the identification of candidate GPCRs in this phenomenon. Using pharmacological and genomic tools, we tested the implication of those candidates in various aspects of cell differentiation. In particular, we performed a detailed study of the role of the F2r thrombin receptor and Gprc5a orphan receptor in preadipocyte proliferation.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est caractérisée par une accumulation anormale de lymphocytes B matures. Les thérapies actuelles reposent sur l'utilisation d'inhibiteurs ciblant les kinases impliquées dans la voie du récepteur des cellules B (BCR), mais elles sont limitées par le niveau élevé de résistance à l’apoptose des cellules leucémiques. En effet, celles-ci échouent à éradiquer les cellules résistantes à l'apoptose, il est donc essentiel d'identifier d'autres voies de survie comme nouvelles cibles pour les thérapies anticancéreuses. La surexpression des récepteurs de surface couplés aux protéines G (RCPGs) entraîne une transformation cellulaire et joue ainsi un rôle essentiel dans les tumeurs malignes. Dans cette étude, nous montrons que le récepteur de la neurotensine de type 2 (NTSR2), un récepteur couplé aux protéines G, est un acteur essentiel dans les mécanismes de résistance à l'apoptose dans les cellules leucémiques. Le récepteur NTSR2 est surexprimé et constitutivement actif dans les cellules leucémiques, son activation dépend de son interaction avec le récepteur TrkB (Tropomyosin-related kinase B) et du recrutement des protéines Giα à la place de son interaction avec son ligand naturel, la neurotensine (NTS). L'interaction NTSR2-TrkB agit comme un oncogène conditionnel nécessitant le BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor), le ligand de TrkB, qui est fortement exprimé dans les cellules B leucémiques, contrairement à son ligand naturel la NTS. L'interaction NTSR2-TrkB active les voies de signalisation de survie, y compris les voies de Src et Akt, ainsi que l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) et Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra large). Néanmoins le récepteur TrkB seul ne protège pas les cellules B leucémiques d'une diminution drastique de la viabilité par apoptose lorsque NTSR2 est inactivé. L’ensemble de ces résultats suggèrent que l'interaction NTSR2-TrKB et l'activation soutenue des voies de signalisation dépendante de cette interaction constituent un mécanisme essentiel d’échappement à l'apoptose des cellules B leucémiques. Le ciblage du récepteur NTSR2 représente une stratégie prometteuse pour le traitement de cette pathologie. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the abnormal accumulation of mature B lymphocytes. Current therapies for CLL rely on using kinase inhibitors targeting B-cell receptor (BCR) pathways, but they are limited by the high level of apoptosis-resistant B-CLL cells, which results in a high frequency of patient relapse. Because current therapies fail to eradicate these apoptosis-resistant cells, it is essential to identify alternative survival pathways as novel targets for anticancer therapies. Overexpression of cell-surface G protein-coupled receptors (GPCRs) drives cell transformation, and thus plays a critical role in malignancies. In this study, we show that neurotensin receptor 2 (NTSR2), a G-protein-coupled receptor, is an essential driver of apoptosis resistance in B-CLL. NTSR2 was highly expressed and constitutively active in B-CLL cells, and its activation depended on its interaction with the tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) and the recruitment of Gi proteins, instead of its interaction with its natural ligand, neurotensin (NTS). The NTSR2-TrkB interaction acted as a conditional oncogenic driver requiring the TrkB ligand BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor), which is highly expressed in B-CLL cells, unlike its natural ligand NTS. The NTSR2-TrkB interaction activates survival signaling pathways, including the Src and AKT kinase pathways, as well as expression of the anti-apoptotic proteins Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) and Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra large). TrkB failed to protect B-CLL cells from a drastic decrease in viability via typical apoptotic cell death when NTSR2 was down-regulated. Taken together, the results suggest that the NTSR2-TrKB interaction and the sustained activation of signaling pathways reliant on this interaction constitute an essential driving force for apoptosis evasion of B-CLL cells. Targeting NTSR2 could represent a promising strategy for treating B-CLL malignancy.

La plus grande famille de récepteurs membranaires est constituée par des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG). Ces récepteurs sont impliqués dans un grand nombre de réponses cellulaires physiologiques et pathologiques et représentent la ciblé de une grande majorité des produits thérapeutiques. La fonction d’un récepteur est déterminée par la quantité de récepteur fonctionnel à la surface cellulaire, qui dépend de différents paramètres comme le niveau de biosynthèse, l’export vers la surface cellulaire à partir de stocks intracellulaires, l’endocytose et les modifications post-transcriptionelles (ex. phosphorylation). Le nouveau concept d’export régulé pour les RCPG présent l’importance physiologique de la rétention de récepteurs, leur relargage, leur interaction avec les partenaires chaperonnes et les escortes. Les études présentées ici concernent les mécanismes d’export régulé de deux RCPG, le récepteur métabotropique de l’acide γ-amino butyrique (GABAB) et le récepteur de chimiokines CC 5 (CCR5). GABAB est un récepteur constitué de deux sous-unités GB1 et GB2 et CCR5 est probablement un homo-dimer. GB1 ainsi que CCR sont retenus dans des compartiments intracellulaire (RE et appareil Golgi) d’où ils sont relâchés en réponse à un signal extern (CCR5) ou/et en interagissant avec protéines d’escorte (comme CD4 pour CCR5 et GB2 pour GB1). L’objectif de ces études était de comprendre le mécanisme de rétention de ces récepteurs et leur régulation. Dans ce contexte, nous avons déterminé en utilisant des approches biophysiques et biochimiques que ces récepteurs interagissent de façon spécifique avec les membres de Prenylated Rab Acceptors Family (PRAF). Ces protéines sont résidentes dans le RE (PRAF2 et PRAF3) et dans le appareil Golgi (PRAF1) où elles fonctionnent comme de gatekeepers pour les récepteurs. Nous avons pu démontrer que PRAF2 interagie de manière spécifique avec des motifs de rétention connus pour leur implication dans la rétention de récepteurs. Cette interaction détermine une rétention au niveau de RE donc régule de façon négatif l’export vers la membrane cellulaire. Dans le cas de récepteur GABAB, l’interaction de GB2 avec GB1 permet la libération de GB1 de sa rétention par PRAF2 par simple compétition. La modification de l’équilibre stoichiométrique entre les gatekeepers PRAF et les protéines d’escorte pour les récepteurs induit des modifications de la fonction du récepteur in vitro et in vivo. Les PRAFs sont ubiquitaires et peuvent interagir avec plusieurs RCPG représentant dans ce cas des régulateurs majors de la fonction de RCPG dans des conditions physiologiques et pathologiques. / The largest family of membrane receptors is constituted by conserved seven-membrane domain spanning receptors, the G-protein coupled receptors (GPCRs). They are involved in numerous cell responses and diseases thus being a major drug target. Receptor function is determined by the amount of active receptors at the cell surface, which depends on various parameters, such as the biosynthetic rate, the export to the cell surface from internal stores, the endocytosis and post-transcriptional modifications (i.e. phosphorylation). Only recently, the importance of the regulated export has emerged, shedding new light on the physiological role of receptor retention, release, chaperoning and escorting. This work concerns the regulated export mechanisms of two members of the GPCRs family, the chemokine receptor 5 (CCR5) and the metabotropic receptor of the g amino butyric acid (GABAB). Whereas CCR5 is likely a homo-dimer of 2 identical protomers, GABAB is an obligatory hetero-dimer of 2 distinct subunit known as GB1 and GB2. Both CCR5 and GB1 are retained in intracellular compartments (the ER and the Golgi) from which they are released in response to external signals (CCR5) and/or interaction with “private escort proteins” (CD4 for CCR5 and GB2 for GB1). The main goal of our work was to understand the mechanism of retention of these receptors and its regulation. In this context, we determined using biochemical and biophysical approaches that these GPCRs specifically interact with the members of the Prenylated Rab Acceptor Family (PRAF). These proteins are resident either in the ER (PRAF2 and PRAF3) or in the Golgi apparatus (PRAF1) where they function as receptor gatekeepers. Indeed, we could document for PRAF2 that this protein likely interacts directly with previously identified receptor retention motifs and inhibits receptor egress from the ER and subsequent trafficking to the plasma membrane. In the context of the GABAB receptor, PRAF2-dependent retention of GB1 can be overridden by GB2 via simple competition. Perturbing the stoichiometry of PRAF gatekeepers respective to that of receptors significantly perturbs receptor function both in vitro and in vivo. Because PRAFs are ubiquitous and seem to interact with many other GPCRs, they might represent major regulators of receptor function both in physiological and pathological conditions.

Mon laboratoire d’accueil avait montré que la densité de CCR5 à la surface des cellules cibles du VIH détermine très fortement leur infectabilité par les souches virales R5, et que les signaux d’activation cellulaire induits par la fixation virale et transitant par CCR5 favorisent une infection productive des cellules primaires. L’hypothèse de notre travail était que d’autres récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) exprimés dans les lymphocytes T CD4+ CCR5+ pourraient également influer sur le cycle de réplication des virus R5. Pour tester cette hypothèse, les RCPGs co-exprimés avec CCR5 dans les cellules T CD4+ ont été identifiés, puis la capacité des plus exprimés d’entre eux à s’hétérodimériser avec CCR5 et à perturber l’infection par le VIH a été déterminée. Au cours de cette thèse, j’ai initié l’étude de deux de ces récepteurs, EBI2 et A2A, et j'ai participé à l’étude d’un troisième, S1P1.J’ai montré que la présence d’EBI2 ou d’A2A qui chacun s’hétérodimérise avec CCR5, augmente la production virale dans des cellules HOS ou MT4, comme c’est le cas pour S1P1. Étudiant les changements au niveau des étapes du cycle viral provoqués par l’expression ou la stimulation de ces RCPGS, j’ai mis en évidence que le principal effet est une augmentation de la transcription virale. De plus, nous avons montré que la signalisation via S1P1 active le facteur de transcription NFKB et par là le promoteur du VIH. De plus, la stimulation de ce récepteur dans un modèle de cellules infectées de façon latente permet la réactivation du virus. Ce résultat ouvre la possibilité de tester la capacité d’agonistes de S1P1 à éliminer les cellules servant de réservoir chez les personnes vivant avec le VIH. / It was shown in the laboratory that CCR5 density at the surface of primary CD4+ T cells strongly determines their R5 HIV-1 productive infectability. This is due to the fact that viral envelope - CCR5 interaction triggers signals that boost the viral life cycle. Our working hypothesis was that other G-protein coupled receptors (GPCR) co-expressed with CCR5 might also modulate HIV replicative cycle. To test this hypothesis, the GPCR coexpressed with CCR5 in CD4+ T cells have been identified, and the ability of the most highly expressed of them to dimerize with CCR5 and to interfere with the infection has been determined. During this thesis, I have initiated the study of two of these GPCR, EBI2 and A2A, and participated in the study of another one, S1P1.I have shown that the presence of EBI2 or A2A that each heterodimerize with CCR5, boosts the viral production in HOS and MT4 cells, similarly to S1P1. Analyzing the stages of HIV life cycle modified by the expression and triggering of these GPCR, I unveiled that the major effect was an increase in HIV genome transcription. Furthermore, we have shown that S1P1 signaling activates the transcription factor NFKB and thereby the HIV promoter. Moreover, triggering S1P1 in an in vitro model of HIV reservoir cells results in the reversion of the viral latency. These findings suggest that S1P1 agonists might be used as latency reversing agents to purge the HIV reservoir.

GASP1 modulerait le trafic intracellulaire des RCPG après endocytose provoquée par les ligands. Au cours de ce travail nous nous sommes focalisés sur l’interaction de GASP-1 avec le récepteur beta2-adrénergique (B2AR) et ses conséquences fonctionnelles. Les agonistes du récepteur B2AR sont des bronchodilatateurs puissants utilisés dans le traitement de l’asthme. Avec le Dr N. Frossard, nous avons montré qu'un traitement chronique avec un agoniste B2AR induit le développement d'une hyper-réactivitée bronchique chez les souris sauvages mais pas chez les KO GASP1. Ce phénotype n’est pas relié à une différence dans la dégradation du récepteur B2AR entre les souris sauvages et KO GASP-1 mais est corrélé avec une augmentation du niveau de collagène dans les poumons des souris sauvages. Nos résultats indiquent que GASP1 joue un rôle important dans ce phénomène adaptatif qui serait relié à un remaniement des tissus bronchiques dépendant de cette protéine. / GASP1 have been shown to modulate the postendocytic sorting of different GPCRs.In order to better understand the role of GASP1 in regulating the activity and intracellular traffic king of GPCRs, we have focused our project on the functional consequences of the interaction between GASP1 and beta2-adrenergic receptor (B2AR). B2AR agonists are potent bronchodilators used in the treatment of asthma. With Dr. N. Frossard, we have shown that achronic treatment with a B2AR agonist induces the development of bronchial hyperresponsiveness in wild-type but not in KO GASP1 mice. Furthermore, we have shown that this phenotype is not related to a difference of B2AR receptor degradation between wild type and KO animals but correlates with an increase in collagen levels in the lungs of wild type mice that is not observed in GASP1KO animals. Altogether, our data suggest thatGASP1 is critically involved in these adaptations, which could be related to a GASP1-dependent modification of lung tissues.

La dilution isotopique, SID pour « Stable Isotope Dilution », est une méthode largement utilisée pour la quantification de peptides et protéines en spectrométrie de masse, généralement associée aux techniques d’ionisation ambiante. Les travaux de cette thèse sont donc consacrés à l’application de la méthodologie de la dilution isotopique (SID) en spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par une matrice (MALDI) pour la mesure d’interaction récepteur/ligand en pharmacologie. En effet, un nombre important de pathologies mettent en jeu des récepteurs membranaires tels que les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) en interaction avec différents ligands, souvent peptidiques. En particulier, le récepteur V1A est impliqué dans l’activité vasoconstrictrice de l’hormone peptidique AVP (Arginine VasoPressine) et la contraction de cellules musculaires ainsi que dans certains comportements sociaux. Ce récepteur a été choisi comme modèle d’étude nécessitant le marquage par voie chimique du ligand Homo-HO-LVA (pour « Hydroxy Linear Vasopressin Antagonist »), sélectionné pour sa forte affinité envers le récepteur V1A afin d’introduire l’entité permettant le dosage en SID/MALDI. Cette méthodologie est mise en œuvre via la génération d’une liaison covalente de la matrice HCCA (4-hydroxy-α-cyanocinnamic acid), couramment utilisée pour l’analyse peptidique pour obtenir le peptide modifié (JMV4854) par acylation en position N-terminale. Le but est alors de tirer profit de l’utilisation conjointe de ce marquage et de la matrice neutre HCCE (4-hydroxy-α-cyanocinnamate de méthyle) pour la détection spécifique et sensible de composés jusqu’à des concentrations picomolaires. L’étape stratégique de quantification par dilution isotopique nécessite un étalonnage et une validation statistique avant de pouvoir passer à l’application pharmacologique. Celle-ci consiste à mesurer l’affinité du JMV4854 pour le récepteur V1A par des expériences thermodynamiques de mesure de constantes de dissociation (Kd) afin de déterminer par la suite des constantes de dissociation de molécules non marquées via des expériences de compétition. Un second modèle de récepteur, le CCKB-R (cholecystokinine B receptor), a ensuite été étudié pour valider la méthodologie de quantification. Devant le regain d’intérêt des laboratoires pharmaceutiques pour les expériences cinétiques de mesure de constantes de dissociation, il serait intéressant d’y appliquer cette méthodologie. Celle-ci présente un potentiel intéressant en tant qu’alternative aux méthodologies actuellement incontournables que sont la radioactivité et la fluorescence. Un second d’axe d’étude a été initié avec un marquage conçu pour diriger la fragmentation de peptides pour des mesures en spectrométrie de masse en tandem par ionisation Electrospray (ESI-MS/MS). Des modifications par introduction en position N-terminale des peptides d’une charge fixe ont été envisagées. Des études préliminaires (synthèse d’ions préformés par incorporation d’une entité pyridinium) ont montré un comportement prometteur en fragmentation ouvrant de nouvelles perspectives de quantification. / The SID methodology, for Stable Isotope Dilution, is a widely applied methodology for peptides and proteins analysis in mass spectrometry, usually associated with atmospheric pressure ionisation techniques. This thesis is consequently devoted to the application of SID methodology in matrix assisted laser desorption/ionisation (MALDI) mass spectrometry to quantify receptor/ligand interaction in pharmacology. Indeed, a great number of pathologies involve membrane receptors like G protein coupled receptors (GPCR) in interaction with several ligands, frequently peptides. Particularly, the V1A receptor, is related to vasoconstriction activity of the peptide hormone AVP (arginine vasopressine) and contraction of muscular cells as well as many social behaviors. This receptor was chosen as model, requiring the chemical labelling of the ligand Homo-HO-LVA (Hydroxy Linear Vasopressin Antagonist), selected for its high affinity towards the V1A receptor in order to introduce the entity on which relies the quantification in SID/MALDI. This methodology is applied through the covalent binding of HCCA (4-hydroxy-α-cyanocinnamic acid) matrix, usually encountered in peptide analysis, to obtain the modified peptide (JMV4854) through N-terminal acylation. The objective is to take advantage of the use of both HCCA tagging and HCCE (4-hydroxy-α-cinnamic methyl ester) matrix for the specific and sensitive detection of compounds down to picomolar concentrations. Importantly, quantification with SID requires a calibration protocol and a statistical validation before pharmacological assays. This consists in the measurement of JMV4854 affinity towards V1A-R through thermodynamic experiments in order to quantify the dissociation constant (Kd) and determine afterwards constants for untagged molecules by competitive binding assays. Furthermore, a second receptor model, CCKB-R (cholecystokinine B receptor), was then studied to validate the quantification methodology. Facing the renewed interest in pharmaceutic industry of kinetic experiments for dissociation constant measurement, it would be interesting to apply this new methodology to drug discovery, representing a relevant alternative to current “gold-standard” methodologies such as radioactivity and fluorescence. A second field of research has been initiated with a covalent labelling designed to enhance peptide fragmentation for electrospray-based (ESI-MS/MS) tandem mass spectrometry measurements. Preliminary studies with the synthesis of pre-formed ions like N-terminal substitution with pyridinium entities gave very promising results opening the way of other quantification strategies.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs), constituent la plus grande famille de protéines membranaires dans le génome humain. Les RCPGs sont des protéines de signalisation, qui exercent leur action à la surface des cellules, en réponse à une grande variété de stimuli extérieurs. Ils jouent un rôle primordial dans de nombreuses fonctions physiologiques et sont donc impliqués dans une multitude de pathologies comme les maladies cardiovasculaires, métaboliques, neurodégénératives, psychiatriques et oncologiques. L'attribution du prix Nobel de chimie 2012 aux professeurs Robert Lefkowitz et Brian Kobilka pour leurs travaux et avancées spectaculaires dans le champ de recherches des RCPGs, souligne encore leur importance. Les RCPGs constituent également la plus importante cible thérapeutique, avec 30% des médicaments actuellement disponibles sur le marché qui exercent leur action via un RCPG. Cependant, la découverte de nouveaux ligands reste un chalenge. Le but est de développer des approches basées sur la RMN à l’état liquide, qui auront un impact positif sur la recherche de ligand de RCPGs, grâce à l’étude et la caractérisation de récepteur pleine taille, solubilisés en micelles de détergents ou enchâssés en bicouches lipidiques natives / G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest class of membrane proteins in the human genome. GPCRs act as cell surface signalling proteins and respond to a variety of external signals. They play a pivotal role in many physiological functions and are therefore associated with a multitude of diseases, including cardiovascular, metabolic, neurodegenerative, psychiatric, and oncologic diseases. The 2012 noble Prize in Chemistry was awarded jointly to Robert J. Lefkowitz and Brian K. Kobilka for studies of GPCRs, highlighting the importance of this protein superfamily. GPCRs constitute also the most important family of drug targets in the human body, with 30% of current drugs acting on GPCRs. However, drug discovery targeting GPCRs remains difficult, owing to the restricted structural information on GPCRs related to the instability of these proteins when isolated from their cell membrane environments. There is also a lack of knowledge for the structural and functional consequences of the interactions of small-molecule compounds with GPCR. The aim is to develop methods to study and characterize a full GPCR solubilized in detergents or in native lipid bilayers, both in its free form and in small molecule bound forms, using liquid-state NMR experiments. The aim is to develop NMR-based approaches that will strongly impact the structure-based drug discovery process for the GPCR family