Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire unicellulaire qui se développe à l’intérieur d’une cellule hôte. Chez les parasites Apicomplexa, peu de chose sont connues sur la N-glycosylation. Nous avons mis en évidence la présence de N-glycannes parasitaires totaux et démontré que ces N-glycannes sont de type riche en mannose. En utilisant une lectine, nous avons purifié de nombreuses N-glycoprotéines parasitaires intervenant majoritairement dans les mécanismes de motilité, d’invasion et de trafic intracellulaire. Nous avons démontré qu’un traitement par une drogue inhibant la synthèse des N-glycannes perturbe plusieurs processus biologiques. Nous avons étudié les fonctions biologiques des N-glycannes de TgGAP50 qui appartient au glidéosome, un moteur impliqué dans la motilité du parasite. Nous avons déterminé que TgGAP50 porte des N-glycannes hétérogènes riches en mannoses. Nous avons montré que la N-glycosylation de TgGAP50 est impliquée dans le trafic de la protéine et dans l’interaction avec les partenaires du glidéosome. Nos travaux démontrent que T. gondii est capable de synthétiser des N-glycoprotéines et que les N-glycannes sont potentiellement impliqués dans le trafic des protéines et dans les interactions moléculaires importantes pour la motilité et l’invasion des cellules hôtes par le parasite. / The apicomplexan parasite Toxoplasma gondii penetrates virtually any kind of mammalian cell using proteins released from late secretory organelles and a unique form of gliding motility. How T. gondii glycosylated proteins mediate host-parasite interactions remains elusive. Here, we report comprehensive proteomics and glycomics analyses showing that several key components required for interactions between T. gondii and host cells are N-glycosylated. Detailed structural characterization confirmed that N-glycans from T. gondii total protein extracts consist of oligomannosidic and paucimannosidic sugars, which are rarely present on mature eukaryotic glycoproteins. In situ fluorescence using concanavalin A and Pisum sativum agglutinin predominantly stained the entire parasite body. Visualization of Toxoplasma glycoproteins purified by affinity chromatography identified components involved in gliding motility, moving junction, and other additional functions. Importantly, tunicamycin-treated parasites were considerably reduced in motility, host cell invasion, and growth. In addition, we show that all three potential N-glycosylated sites of GAP50 are occupied by unusual N-glycan structures with terminal glucoses. Using site-directed mutagenesis, we demonstrate that N-glycosylation is a prerequisite for GAP50 transport into the inner membrane complex. Assembly of key partners into gliding complex by unglycosylated GAP50 and parasite motility are severely impaired. Collectively, these results provide the first molecular description of T. gondii N-glycosylation functions that are vital for parasite motility and host cell entry.

Toxoplasma gondii, l'agent de la toxoplasmose, représente un modèle appartenant aux parasites Apicomplexa, phylum dans lequel on retrouve Plasmodium falciparum, l'agent causal du paludisme, et de nombreux agents opportunistes dangereux. Les parasites de ce phylum possèdent la même organisation avec des organites situés à l'apex, spécialisés dans l'interaction hôte-pathogène et qui sont cruciaux pour permettre l'infection de l'hôte: les rhoptries et micronèmes. Les protéines contenues dans ces organites sécrétoires sont acheminées via le système de type endolysosomal. Toutefois, les récepteurs qui jouent un rôle clé dans le tri des protéines et la biogenèse des organites apicaux restaient à identifier. La sortiline est un récepteur transmembranaire de type I, plus connu chez l'Homme dans le tri, le transport des protéines et ses rôles dans la maladie de Parkinson, d'Alzheimer ou du diabète ont largement été décrits. Nous avons déterminé que l'homologue de la sortiline chez Toxoplasma TgSORTLR pour «Toxoplasma gondii Sortiline Like Receptor» est localisé au niveau de l'appareil de Golgi et du réseau post-Golgien. TgSORTLR se lie spécifiquement aux protéines de rhoptries et de micronèmes à l’aide du domaine N-terminus, probablement au niveau de l'appareil de Golgi. Nous avons montré que le domaine C-terminus est déterminant pour la localisation de TgSORTLR et que l'expression d'une version tronquée de la protéine dépourvue du domaine C-terminus induit la complète délocalisation des protéines de rhoptries et de micronèmes. Nous avons également identifié les protéines cytosoliques qui interagissent avec le domaine C-terminus de TgSORTLR et démontré que ces protéines cytoplasmiques sont pour la plupart connues pour leurs rôles importants dans le transport antérograde ou rétrograde des vésicules du trafic intracellulaire. L’absence de TgSORTLR obtenue grâce à une stratégie de «knock-out » conditionnel entraîne non seulement une totale délocalisation des protéines de rhoptries et de micronèmes mais aussi à une disparition des organites apicaux, ce qui conduit à la forte atténuation de la virulence du parasite chez la souris et surtout à l'absence complète de symptômes toxoplasmiques. Des expériences de complémentations réalisées dans la souche dépourvue de TgSORTLR ont montré que l’extrémité N-terminus (acides aminés 39 à 202) de TgSORTLR est également nécessaire pour sa localisation correcte et pour ses fonctions de récepteur intracellulaire chez T. gondii. Enfin, nous avons caractérisé, par des techniques de « knock in » ou remplacement du gène endogène par une copie étiqueté avec l’épitope HA, puis montré que des protéines homologues de μ1-adaptine, Sec23, Vps9, Vps26 et Vps35 de T. gondii co-localisent et se fixent spécifiquement à TgSORTLR. Ces résultats récents confirment que l'extrémité C- terminus et cytoplasmique du récepteur TgSORTLR se comporte d'une manière similaire aux sortilines des cellules de mammifère. L’étude de ces partenaires de TgSORTLR nous permet de mieux comprendre le trafic de TgSORTLR, de reconstituer en partie le système endolysosomal et son rôle dans le transport et la biogenèse des organites vitaux de T. gondii. / Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis belongs to the phylum named Apicomplexa that also contains Plasmodium falciparum, the causative agent of malaria and others parasites such as Cryptosporidium or Eimeria. Apicomplexan parasites are uniquely characterized by specific organelles, rhoptries and micronemes, which are located at the apical end of the parasite. These organelles are involved in the control of host-pathogen interactions. The proteins in these secretory organelles are trafficked through the endolysosomal system. However, the receptors that play key roles in protein sorting and biogenesis of these apical organelles remain to be identified. Sortilin is a type I transmembrane receptor known in humans for protein sorting and trafficking. Here, we report that the homologue of sortilin in T. gondii designated TgSORTLR for “Toxoplasma gondii SORTilin Like Receptor” is localized to Golgi and post-Golgi compartments and transports proteins into rhoptries and micronemes via their specific interactions with its luminal domain. We demonstrate that the C-terminus of TgSORTLR is also important for its subcellular localization through binding to cytosolic components of vesicular trafficking proteins known to be involved in anterograde and retrograde transports. The depletion of TgSORTLR using conditional knock-out strategy causes a complete rmis-localization of proteins of both rhoptries and micronemes, leading to the loss of these apical organelles. These mutants display a strong attenuation of the parasite virulence in mice with the absence of acute toxoplasmosis symptoms. Complementation of the strain lacking TgSORTLR showed that N-terminal region between 39-202 amino acids indicated that the N-terminus, similarly to the C-terminus is essential for its correct localization. We conclude that the full-length TgSORTLR protein is required for its biological functions as intracellular sorting receptor in T. gondii.

In the past fifteen years, ubiquitin has emerged as a central regulator of membrane protein trafficking. In this context, covalent attachment of this small protein to lysine residues of cargo proteins, a reversible modification termed ubiquitylation, provides a signal for their targeting to the vacuolar/lysosomal lumen where they are degraded, both in yeast and higher eukaryotes. Ubiquitylation is also used as a means of controlling the function of specific proteins in several trafficking machineries. The role of lipids - and in particular of membrane domains named lipid rafts - in controlling the intracellular trafficking of membrane proteins has also been the subject of intense investigation in recent years. One of the membrane proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae whose intracellular trafficking has been extensively studied is the general amino acid permease Gap1. Yet some aspects of the function of ubiquitin in the nitrogen-dependent control of this protein remain controversial. Moreover, the potential role of lipid rafts in regulating the functional properties and traffic of the Gap1 permease had not been investigated before this thesis work. The first part of our work readdresses the role of Gap1 ubiquitylation, and more precisely of the modification of the permease with polyubiquitin chains linked through the lysine 63 of ubiquitin, in controlling the fate of this protein in the secretory pathway. Our observations indicate that nitrogen-induced ubiquitylation of newly synthesised Gap1 occurs in the trans-Golgi complex. However, contrary to the generally accepted view, this modification is not necessary for the permease to exit this compartment en route to the endosome but only for its subsequent targeting to the vacuolar lumen via the multivesicular body (MVB) pathway. Our results also provide evidence that K63-linked polyubiquitylation is important mostly at the late endosomal level, for proper sorting of Gap1 into the MVB pathway, whether the permease comes from the cell surface by endocytosis or directly from the secretory pathway. In the second part of this work, we present a set of data providing novel insights into the controversial question of the exact nature of lipid rafts in yeast. We first showed that the Gap1 permease is associated with detergent-resistant membranes (DRMs) - the proposed biochemical equivalent of lipid rafts - when it is located at the cell surface. Our data further suggest that this may be true for most if not all yeast plasma membrane proteins. Moreover, we found that Gap1 production must be coupled to de novo synthesis of sphingolipids (SLs), major constituents of rafts, in order for the newly synthesised permease to be correctly folded, active, associated with DRMs, and stable at the cell surface. We propose a model where Gap1 would associate with newly synthesised SLs during its biogenesis and/or secretion, this association shaping the permease into its native conformation and ensuring its incorporation and stabilisation in specific lipid domains at the plasma membrane. Failure of Gap1 to acquire this lipidic microenvironment in turns leads to its ubiquitin-dependent degradation by a quality-control mechanism. This model might be valid for many other plasma membrane proteins and might account for their lateral distribution between distinct membrane domains.

De part leurs propriétés physiques et chimiques, les nanoparticules de silice mésoporeuses (MSNs) sont de bonnes candidates pour la délivrance de principes actifs. Cependant, leurs toxicités et leurs devenirs intracellulaires sont largement méconnus. Au cours de ces travaux, nous avons étudié la cytotoxicité et l’endocytose de MSNs. Nous avons montré que les MSNs peuvent être endocytées par une variété de lignées cellulaires et par des astrocytes de rat en culture sans signe apparent de cytotoxicité importante. Ces nanoparticules ne présentent pas une toxicité observable in vivo chez des souris. Après avoir montré que l’endocytose des MSNs s’effectue par la voie des puits de clathrines, nous avons procédé à la délivrance intracellulaire d’une protéine. Nous avons montré un échappement des lysosomes de cette protéine grâce aux MSNs. En couplant l’acide folique aux MSNs, les cellules tumorales ont été ciblées. Lors de ces études, nous avons également montré que l’un des tests les plus utilisés en toxicologie surestime la cytotoxicité des MSNs. Cette surestimation est due à une modification du trafic intracellulaire. Nos travaux ont montré que les MSNs sont endocytés sans nuire à la viabilité cellulaire, ce qui nous a permis de réaliser les premiers essais de délivrances de principes actifs avec nos nanoparticules. / Due to their physical and chemical properties, the mesoporous silica nanoparticles (MSNs) are good candidates for drug delivery applications. However, their toxicity and their intracellular trafficking remain unclear. During these works, we studied the cytotoxicity and the endocytosis of MSNs. We showed that the MSNs can be internalised by a variety of cell lines and rat astrocytes in culture without visible sign of important cytotoxicity. These nanoparticles did not present an observable in vivo toxicity in mice. Then we showed that the endocytosis of the MSNs was made by the clathrines coated pits and we proceeded to the intracellular delivery of a protein. We showed an escape of the lysosomes of this protein due to MSNs. Such an internalised protein escaped from lysosomes under the effect of MSNs. After linking folic acid to MSNs, we are able to target tumoral cells with these nanoparticles. During the preceding studies we observed that one of the most used tests in toxicology overestimated the cytotoxicity of MSNs because the latter nanoparticles modified intracellular traffic. Our works showed that the MSNs are internalized without damaging the cellular viability and we made the first experiments of drug delivery using our nanoparticles.

Les protéines RGS (Regulator of G-protein Signaling) sont des inhibiteurs des voies de signalisation des protéines G. RGS4 atténue l’activité de protéines G dans plusieurs tissus tel que la diminution de son activité peut accroître la sévérité de la bradycardie, cardiomyopathies liées au diabète, l’invasion de cellule cancéreuse du sein, résistance à l’insuline et intolérance au glucose. RGS4 a été localisé à la membrane plasmique ainsi que dans des compartiments intracellulaires, cependant, son mode de trafique intracellulaire reste méconnu. En utilisant des outils de microscopie confocale sur cellules vivantes et méthode de détection d’activité des voies de signalisation conditionnée par les protéines G, nous avons caractérisé l’importance de deux sites de palmitoylation, ces deux sites : Cys2 et Cys12 montrent des intérêts complémentaires dans le trafic de RGS4 vers la membrane cellulaire. Dans un axe linéaire, nous avons identifié DHHC3 et 7, deux enzymes de palmitoylation participant au trafique intracellulaire de RGS4 et donc à la maximalisation de son activité inhibitrice des voies de signalisation contrôlées par Galphaq. Enfin des marqueurs de membranes endosomales, les protéines rab ont permis de caractériser les voies de trafic intracellulaire empruntée par RGS4, par exemple RGS4 est internalisé de la membrane plasmique par Rab5 et recyclé à la membrane cellulaire par Rab11. L’activation ou inhibition de Rab5 et 11 ont permis d’observer des changements d’activité de RGS4. Ces travaux confèrent une base de données pour des études ultérieures visant à développer des stratégies thérapeutiques à accroître les fonctionnalités de RGS4. / RGS proteins (Regulator of G-protein Signaling) are potent inhibitors of heterotrimeric G-protein signaling. RGS4 attenuates G-protein activity in several tissues such that loss of its function may lead to bradycardia, diabetic cardiomyopathy, breast cancer cell invasion, insulin resistance and glucose intolerance. RGS4 has been localized to both plasma membrane and intracellular pools, however, the nature of its intracellular trafficking remains to be elucidated. G-protein inhibition requires the presence of RGS4 at the plasma membrane. In this work, we characterized the complementary roles of two putative palmitoylation sites on RGS4 to target intracellular compartments and plasma membrane. We identified palmitoylation on Cys2 and 12 respectively important for RGS4 endosomal targeting and plasma membrane localization, when mutations were introduced to the palmitoylation sites, RGS4 capability of inhibiting Gq-mediated signaling was impaired. As a continuum we identified two palmitoylating enzymes, DHHC3 and 7 as modulator of RGS4 localization and function. Knock downs of DHHC3 and 7 impaired RGS4 endosomal and plasma membrane targeting and capability of inhibiting M1-muscarinic receptor signaling. Finally we used live cell confocal microscopy to define RGS4 intracellular trafficking routes. Specifically Rab5 mediated RGS4 trafficking from the plasma membrane to intracellular compartments while Rab11 mediated RGS4 trafficking to the plasma membrane. Activation and inhibition of Rab5 and 11 routes impaired RGS4 capability of inhibiting M1-muscarinic receptor signaling pathway. These novel findings provide a strong rationale for future studies aimed at developing new strategies to increase the function of RGS4.

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La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative progressive et irréversible. Une étape précoce de la MA est la relâche neuronale excessive du peptide amyloïde-[bêta] (A[bêta]), qui s'accumule dans le cerveau, s'assemble et se dépose sous forme de plaques A[bêta] insolubles et neurotoxiques. L'A[bêta] est produit suite au clivage amyloïdogénique de la protéine APP, effectué par les sécrétases [bêta] et [gamma] au niveau des endosomes. Il est bien connu que le trafic intracellulaire de l'APP affecte son clivage. L'étude du trafic intracellulaire de cette protéine est donc cruciale pour comprendre ce qui régit la production d'A[bêta]. Certains membres de la famille des récepteurs de lipoprotéines de faibles densités (LDLR), dont SorLA/LR11, interagissent avec l'APP et modulent son clivage en régulant son trafic et/ou en s'associant avec les sécrétases. LRP10, un nouveau membre peu connu des LDLR, trafique entre le Golgi et les endosomes, tout comme SorLA/LR11. Conséquemment, nous avons émis l'hypothèse selon laquelle LRP10 serait un nouveau récepteur de la protéine APP, impliqué dans la régulation du trafic et du clivage de cette dernière ainsi que dans la relâche d'A[bêta]. Nos résultats démontrent que LRP10 et la protéine APP colocalisent au TGN (trans-Golgi network ) et interagissent de façon directe.La surexpression stable de LRP10 dans les cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y, provoque une accumulation de la forme mature de l'APP, ainsi qu'une diminution de son clivage et de la production d'A[bêta].La déplétion de LRP10, par la technique d'ARN interférant, provoque l'augmentation de la production d'A[bêta]. De plus, l'expression d'un mutant de LRP10, redistribué aux endosomes précoces, induit la redistribution intracellulaire de l'APP au niveau de ces mêmes endosomes dans les cellules HeLa et SH-SY5Y, tel qu'observé en microscopie confocale.La surexpression stable du mutant de LRP10 dans les SH-SY5Y a aussi démontré une augmentation du clivage amyloïdogénique de l'APP normalement effectué aux endosomes et donc une augmentation de la production d'A[bêta]. Enfin, la comparaison des niveaux d'expression protéique de LRP10 retrouvés dans le cortex frontal et l'hippocampe de cerveaux de patients âgés sains ou atteints de la MA, révèle que l'expression de LRP10 est réduit dans le cerveau des patients atteints de la MA. En conclusion, LRP10 est un nouveau récepteur de l'APP participant à son triage entre le TGN et les endosomes, protégeant ainsi l'APP du clivage amyloïdogénique et de l'accumulation d'A[bêta]. Ainsi, la réduction de l'expression de LRP10 dans le cerveau pourrait augmenter la production de l'A[bêta] et représenter un facteur de risque dans la MA.

flasque, est produite par des bactéries anaérobies du genre Clostridium. Les BoNTs, classifiées en 7 types (A à G), forment divers complexes avec des protéines non toxiques, dont le composant non toxique non hémagglutinant (NTNH) et les hémagglutinines (HAs). Les gènes sont organisés, au sein du locus botulique, selon deux opérons divergents, ntnhbont/ A et ha34-ha17-ha70 pour le type A, dont l'expression est positivement régulée par le facteur sigma alternatif BotR. Un pic d'expression synchrone de tous les gènes du locus de type A est mesuré par RT-PCR en temps réel lors de la transition entre les phases exponentielle et stationnaire de croissance, en parallèle avec l'augmentation du titre en toxine du surnageant de culture. Dans un modèle d'épithélium intestinal, BoNT/A purifiée est transcytosée après liaison via le domaine Hc/A à des récepteurs apicaux comprenant des gangliosides et des protéines potentiellement apparentées à SV2. L'intensité de liaison et l'efficacité de transport de la toxine sont supérieures dans les cellules intestinales de type crypte plutôt qu'entérocyte. Injectés dans la lumière d'une anse iléale ligaturée, BoNT/A inhibe les contractions des muscles lisses et le domaine Hc/A fluorescent progresse de la muqueuse, via certaines cellules des cryptes, vers la sous-muqueuse et la musculeuse où il cible certaines terminaisons nerveuses, majoritairement cholinergiques. Hc/A entre par des voies distinctes dans les cellules neuronales (voie clathrine dépendante de la dynamine) et les cellules intestinales (voie non-clathrine, dépendante de Cdc42 et de la dynamine).

A travers l'évolution, les agents pathogènes ont développé des stratégies leur permettant de survivre au sein de leur hôte en interférant avec la biogénèse des phagolysosomes. Comme C. burnetii vit dans un phagosome acide incapable de fusionner avec les lysosomes et que sa virulence est associée à l'expression de son LPS, nous avons étudié le rôle du LPS de C. burnetii dans le détournement de la conversion phagosomale. En effet, nous avons montré que C. burnetii virulent ainsi que son LPS se localisent dans des compartiments Lamp-1+ qui n'acquièrent pas la CathepsineD et Rab7 n'est pas recruté à leur surface. Contrairement au LPS du variant avirulent de C. burnetii, qui est localisé dans les lysosomes, le LPS de C. burnetii virulent (vLPS) n'induit pas l'activation de la MAPKinase p38, empêche le recrutement de Rab7 à la surface des compartiments en déstabilisant le complexe HOPS. Finalement, nous avons démontré que la bactérie virulente exprimant le vLPS détourne la conversion phagosomale pour survivre et pour se multiplier dans les macrophages en évitant l'activation de l'axe MAPK-p38/Vps41-HOPS. Nous avons également étudié les mécanismes permettant à Tropheryma whipplei, l'agent de la maladie de Whipple, de se répliquer dans les macrophages puisque les macrophages sont la cible in vivo de cette bactérie. Nous avons montré que T. whipplei bloque la conversion de son phagosome. / Through evolution, pathogens have developed strategies to survive within their host by interfering with the biogenesis of phagolysosomes. As it is known that C. burnetii lives in acidic phagosome which is unable to fuse with the lysosomes and that its virulence is associated with the expression of LPS, we studied the role of C. burnetii LPS in hijacking of phagosomal conversion. Indeed, we showed that the virulent C. burnetii and its LPS are located in Lamp-1+ compartments which do not acquire CathepsineD and Rab7 is not recruited to their surface. Contrary to LPS of avirulent C. burnetii, which is located in the lysosomes, the LPS of virulent C. burnetii (vLPS) does not induce activation of the p38 MAPKinase and it prevents the recruitment of Rab7 to the surface of compartments by destabilizing the HOPS complex. Finally, we demonstrated that virulent bacteria expressing virulent LPS hijack phagosomal conversion to survive and multiply in macrophages by preventing activation of p38-MAPK/Vps41HOPS axis. We also studied the mechanisms by which Tropheryma whipplei, the agent of Whipple's disease, replicates in macrophages, which are its target in vivo. We have shown that T. whipplei blocks the conversion of its phagosome. Indeed, after purification of phagosomes containing-T. whipplei, we observed by Western blot and confocal microscopy that T. whipplei survives in an immature phagosome with characteristics of both early and late phagosomes (presence of Rab5 and Rab7) making it unable to fuse with lysosomes. As the IL-16 is known to induce replication of T. whipplei, we studied the effect of this cytokine on the phagosome biogenesis of T. whipplei.

Les étapes précoces du cycle réplicatif du VIH-1 sont assistées par des cofacteurs cellulaires dont la nature et la fonction restent mal connues. Nos travaux ont caractérisé la contribution de la protéine kinase dépendante de l'AMP cyclique (PKA), dans la cellule cible ou incorporée dans la particule virale VIH-1, dans les étapes post-entrée du cycle réplicatif. Les virus dépourvus d'activité PKA se caractérisent par un défaut de la synthèse de l'ADN proviral. En absence de Nef, la perte d'activité PKA associée aux particules VIH-1 induit une baisse plus modérée du pouvoir infectieux. En outre, le contournement des voies d'entrée classiques, par l'utilisation de particules pseudotypées, rend l'infectiosité indépendante de l'activité PKA. L'action de PKA s'exercerait donc au sein de la particule VIH-1 assemblée et impliquerait à la fois la protéine Nef et les voies de transport des complexes de transcription inverse au cours des étapes post-entrée. De plus, l'inhibition de l'activité PKA dans les cellules cibles entraîne également un défaut de synthèse de l'ADN proviral. Nos résultats indiquent que PKA agit comme un cofacteur de la transcription inverse. / The nature and function of cellular factors involved in post-entry steps of the HIV-1 life cycle are still poorly understood. We highlighted the role of cAMP-dependent protein kinase (PKA) in the early step of viral cycle, either as a host cellular protein in infected cells or as an incorporated protein into HIV-1 particles. PKA-deficient viruses failed to synthesize proviral DNA. In the absence of Nef, the loss of PKA activity associated to HIV-1 particles induces a minor diminution of infectiousness. Accordingly, VSV-G pseudotyped viruses, that use alternate entry pathway, exhibit full infectivity regardless of PKA deficiency. PKA action could therefore take place in the assembled HIV-1 particles, implying Nef protein and intracellular pathways of reverse transcription complexes. Moreover, the inhibition of PKA activity in target cells engenders a defective proviral DNA synthesis. Taken together, our data suggest that PKA may act as a cofactor required for HIV-1 reverse transcription.