Résumé : La signalisation biaisée représente la capacité des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) d'engager des voies de signalisation distinctes avec des efficacités variables selon le ligand utilisé ou la mutation dans le récepteur. Un meilleur contrôle des voies activées ou inhibées par des médicaments pourrait permettre de réduire leurs effets indésirables. Malheureusement, les mécanismes structuraux impliqués dans la transmission du signal à travers la membrane plasmique par l'entremise des RCPG sont peu connus, ce qui limite le développement rationnel de nouvelles molécules ciblant des voies de signalisation particulières. Le récepteur de type 1 à l'angiotensine II (AT[indice inférieur 1]), un RCPG de classe A prototypique, peut activer différents effecteurs suite à sa stimulation par le ligand endogène angiotensine II (AngII), incluant la protéine G[indice inférieur q/11] et les β-arrestines. Il est suggéré que l'activation de ces deux voies de signalisation peut être associée à des conformations différentes du récepteur AT[indice inférieur 1]. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons utilisé des simulations de dynamique moléculaire afin d'explorer les interactions et les mouvements qui définissent le paysage conformationnel du récepteur AT[indice inférieur 1]. De plus, nous avons vérifié comment était modifié le paysage conformationnel par des mutations (N111G, N111W et D74N) et des ligands (AngII et [Sar[indice supérieur 1], Ile[indice supérieur 8]]AngII) ayant des profils signalétiques différents pour la voie de la protéine G[indice inférieur q/11] et la voie des β-arrestines. Les résultats obtenus nous éclairent sur le rôle d'un réseau de ponts hydrogène entre des résidus polaires conservés au coeur du récepteur dont font partie les résidus N111[indice supérieur 3.35] et D74[indice supérieur 2.50]. Les résultats révèlent la présence d'un groupe de résidus hydrophobes juste au-dessus du réseau de ponts hydrogène et adjacent à la pochette de liaison du récepteur qui semble important pour la stabilisation de l'état inactif du récepteur ainsi que pour son activation par un ligand. Dans l'ensemble, les résultats suggèrent que l'activation de la voie de la protéine G[indice inférieur q/11] est associée avec une transition conformationnelle spécifique stabilisée par l'agoniste alors que l'activation de la voie des β-arrestines est associée à une stabilisation de l'état de repos du récepteur. / Abstract: Biased signaling represents the ability of G protein-coupled receptors to engage distinct pathways with various efficacies depending on the ligand used or on mutations in the receptor. Having better control over the signaling pathways activated or inhibited by drugs could lead to fewer undesirable effects. Unfortunately, the structural mechanisms involved in the transmission of signal across the cell membrane through the receptors are poorly understood, which limits the rational development of new molecules targetting specific signaling pathways. The angiotensin-II type 1 (AT[subscript 1]) receptor, a prototypical class A G protein-coupled receptor, can activate various effectors upon stimulation with the endogenous ligand angiotensin-II (AngII), including the G[subscript q/11] protein and β-arrestins. It is believed that the activation of those two pathways can be associated with distinct conformations of the AT[subscript 1] receptor. To verify this hypothesis, microseconds of molecular dynamics simulations were computed to explore interactions and movements that define the conformational landscape of the AT[subscript 1] receptor. We have also verified how this conformational landscape is modified by mutations (N111G, N111W, D74N) and ligands (AngII, [Sar[superscript 1]Ile[superscript 8]]AngII) that have different signaling properties on the G[subscript q/11] pathway and the β-arrestin pathway. The results provide a better understanding of the role of a hydrogen bond network formed of conserved polar residues in the receptor core which include residues N111[superscript 3.35] and D74[superscript 2.50]. The results also reveal the existence of a cluster of hydrophobic residues located right above the hydrogen bonds network and adjacent to the binding pocket that appears important for the stabilization of the ground state of the receptor as well as its ligand-induced activation. As a whole, the results suggest that activation of the G[supbscript q/11] pathway is associated with a specific conformational transition stabilized by the agonist, whereas the activation of the β-arrestin pathway is linked to the stabilization of the ground state of the receptor.

À partir des ovocytes de la palourde Spisula solidissima, un ADNc codant un récepteur nommé Spi-OAR a été cloné et séquencé. Une analyse de la séquence en acides aminés a indiqué que ce nouveau récepteur possède une forte similarité avec les récepteurs β-adrénergiques et les récepteurs à octopamine. En effet, il est étroitement lié à la classe des récepteurs à octopamine « β-adrénergique-like » couplés à une protéine Gs. L’ADNc de Spi-OAR a été introduit dans un vecteur d'expression (pCEP4) et un épitope reconnaissable par un anticorps commercial a été ajouté au segment N-terminal. Cette construction a été transfectée dans des cellules hôtes (HEK 293) et des études d’immunofluorescence ont montré une expression efficace du récepteur au niveau membranaire. Également, des mesures d'AMPc pour les cellules exprimant Spi-OAR ont révélé une augmentation de ce messager secondaire lors de l'ajout de l'octopamine, et dans une moindre mesure, la tyramine, tandis que la dopamine, la sérotonine et l'histamine n’ont engendré aucun effet. Une légère activité constitutive de ce récepteur dans les cellules hôtes a été observée. De plus, une analyse RT-PCR avec des oligonucléotides spécifiques a révélé l'ARNm de Spi-OAR non seulement dans les ovocytes, mais aussi dans les gonades, le cœur, les muscles adducteurs, les branchies et les ganglions suggérant que ce récepteur soit exprimé de façon ubiquitaire dans divers tissus et dans différents stades embryonnaires chez la palourde. En outre, des études avec des ovocytes isolés n'ont montré aucun effet de l’octopamine sur la réactivation méiotique. Des études éventuelles pourront finalement confirmer le rôle fonctionnel de Spi-OAR. / A cDNA encoding for an octopamine receptor named Spi-OAR was cloned and sequenced from the surf clam Spisula solidissima oocytes. An analysis of its predicted amino acid sequence showed a high degree of similarity with β-adrenergic and octopamine receptors. This receptor qualifies as a novel receptor closely related to the proposed class of insect octopamine « β-adrenergic–like » receptors coupled to Gs protein. This cDNA was introduced into an expression vector (pCEP4), with an added N-terminal FLAG tag sequence, and transfected in host cells (HEK 293). Immunofluorescence studies showed expression of the receptor with a proper localization to the plasma membrane. Measurements of cAMP in transfected cells revealed that addition of octopamine, and to a lower extent, tyramine induced a rise in cAMP while dopamine, serotonine and histamine had no effect. Overexpression of Spi-OAR in mammalian cells induced slight constitutive increase of cAMP. An RT-PCR analysis with specific oligonucleotides revealed the presence of the receptor mRNA not only in oocytes but also in whole gonads, heart, adductor muscle, gills and ganglia suggesting that this receptor is likely ubiquitously expressed. Expression of Spi-OAR was also detected at different embryonic stages. Despite the demonstrated expression of Spi-OAR in oocytes, octopamine had no effect on meiotic reinitiation. Further studies will examine the function of Spi-OAR.

Le récepteur de chimiokine CXCR3 est un récepteur couplé à la protéine G (RCPG) exprimé, entre autre, sur les cellules T activées lors d’une réponse immune. CXCR3 est activé par trois ligands inductibles par l’interféron-γ (CXCL9, 10, 11) et, plus récemment, il a été découvert que CXCL4 liait CXCR3. Nous savons que CXCR3 joue un rôle dans la chimiotaxie des leucocytes, mais peu d’attention a été portée sur la signalisation biaisée induite par ces quatre ligands. Alors que l’homodimérisation entre récepteurs de chimiokine est un concept grandement observé, l’hétéromérisation entre deux récepteurs reste un domaine de recherche active. La signalisation biaisée et l’hétéromérisation ont été testées grâce à la technique de bioluminescene resonance energy transfer (BRET) dans des cellules HEK293E. Nous présentons une caractérisation pharmacologique des quatre ligands de CXCR3 et démontrons l’hétéromérisation de CXCR3 avec CXCR4 et avec CXCR7. Nos résultats suggèrent que les ligands de CXCR3 n’agissent pas de manière redondante. / The chemokine receptor CXCR3 is a G-protein-coupled receptor (GPCR) rapidly induced on naïve T cells upon activation. CXCR3 is activated by three interferon-γ inducible ligands (CXCL9, 10, 11) and, more recently, CXCL4 has been discovered as a functional ligand for CXCR3. It is known that CXCR3 acts as a chemotactic receptor, but limited attention has been directed to the biased signaling induced by all four ligands. Chemokine receptor homodimerization is now a widely accepted concept, but the extent to which heterodimerization is prevalent remain matter of active research. In this work, biased signalling and heterodimerization were assessed with bioluminescence resonance energy transfer (BRET) in HEK293E cells. We present pharmacological characterization of all four ligands of CXCR3 and heterodimerization of CXCR3 with CXCR4 or CXCR7. Our results suggest that CXCR3 ligands are not redundant and that CXCR3 heterodimerizes with CXCR4 and with CXCR7.

Les chimiokines sont des petites protéines secrétées dont la fonction principale est la stimulation de la migration de cellules immunitaires vers différents organes et tissus. Elles sont souvent impliquées lors des maladies inflammatoires, auto-immunes et des cancers. Ainsi, les chimiokines et leurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont la cible pharmacologique de plusieurs molécules, actuellement testées en essais cliniques. Nous avons pris comme modèle, lors de notre étude, le récepteur atypique CXCR7. Ce récepteur est dit atypique, car il ne signalise pas via la voie classique des protéines G, mais plutôt via la voie de la β-arrestine. CXCR7 est impliqué dans de nombreux cancers, favorise la progression métastatique et est un co-récepteur pour le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Cependant, aucune donnée sur son mode de liaison avec ses ligands CXCL11/ITAC et CXCL12/SDF-1 n’existe à date. Nous pensons que cette information est essentielle pour le développement efficace d’agonistes et d’antagonistes, et nous nous sommes intéressés à identifier les résidus essentiels à la liaison des deux ligands de CXCR7 et à son activation par ces derniers. Pour cela, nous avons créé une série de mutants par substitution ou délétion d’acides aminés de la partie N-terminale, des boucles extracellulaires et des domaines transmembranaires du récepteur. Nous avons testé leur marquage en surface cellulaire par cytométrie en flux, leur liaison des deux ligands par expériences de radio-liaison, et leur capacité à recruter la β-arrestine en réponse aux ligands par essais BRET. Les résultats obtenus ont permis d’identifier des résidus importants à l’interaction des systèmes CXCR7/SDF-1 et CXCR7-ITAC et suggèrent des modes de liaison à CXCR7 différents entre ITAC et SDF-1. Tout comme la liaison d’ITAC à son autre récepteur CXCR3, sa liaison à CXCR7 suivrait le mode conventionnel de liaison en deux étapes des récepteurs de chimiokines. Cependant, la liaison de SDF-1 à CXCR7 suivrait un autre mode de liaison, contrairement à sa liaison à son autre récepteur, CXCR4. / Chemokines are small secreted proteins whose major function is to stimulate the migration of immune cells to different organs and tissues. They are often involved in inflammatory and auto-immune diseases as well as cancers. Thus, chemokines and their G proteins Coupled Receptors (GPCR) are the pharmacological target of multiples molecules, currently tested in clinical trials. The model of our study is the atypical receptor CXCR7. This receptor is called atypical because it doesn’t signalize through the classical G protein pathway but rather signalizes through the β-arrestin pathway. CXCR7 is involved in many cancers, promotes metastatic progression and is a co-receptor for human immunodeficiency virus (HIV). However, there are, to date, no data concerning its binding mode to its ligands CXCL11/ITAC and CXCL12/SDF-1. We think that this information is crucial for the efficient development of agonists and antagonists and thus decided to identify the residus that are important for the binding of the two ligands of CXCR7 to the receptor and its subsequent activation. For that, we created a set of mutants by substitution or deletion of amino acids of the N-terminus, extracellular loops and transmembrane domains of the receptor. We then tested their surface expression by antibody staining and flow cytometry, their binding of the two ligands by binding assays and their capability to recruit β-arrestin in response to the ligands by BRET assays. The results obtained allowed us to identify important residues for the interaction of the systems CXCR7/SDF-1 and CXCR7/ITAC. They also suggest different binding modes of the chemokines ITAC and SDF-1 to CXCR7. Just like the binding of ITAC to its other receptor CXCR3, the binding mode of ITAC to CXCR7 follows the conventional two steps binding model of chemokine receptors. However, the binding of SDF-1 to CXCR7 follows another binding mode than the classical two step model, unlike its binding to its other receptor CXCR4.

Les opiacés demeurent des molécules incontournables dans le traitement des douleurs moyennes à sévères. Si leur efficacité dans le traitement de la douleur aiguë est incontestable, leur utilisation chronique est responsable de nombreux effets indésirables comprenant une hypersensibilité à la douleur et une tolérance à leurs effets analgésiques. Une partie de ces effets secondaires résulteraient de l’activation de systèmes anti-opioïdes endogènes, comme les neuropeptides RF-amide, dont des études précédentes suggèrent une complémentarité de fonctionnement dans la modulation de la douleur. Le premier axe de travail de cette thèse fut de développer les outils moléculaires afin d’étudier la possibilité d’interactions fonctionnelles et d’hétérodimérisation de ces récepteurs, en particulier GPR103 et NPFF1R. Nous avons ainsi pu générer et caractériser des lignées cellulaires exprimant les différents récepteurs à peptide RF-amide avec un fluorophore fusionné à leur extrémité amino-terminale. En parallèle, nous avons pu développer au cours d’une collaboration fructueuse avec deux équipes de chimistes un ligand à dualité d’action, agoniste opioïdergique et antagoniste des récepteurs NPFF1R et NPFF2R. Chez la souris, nous avons montré que l’administration sous-cutanée de ce composé produit une analgésie longue durée, qui n’est pas atténuée par le développement de tolérance analgésique ou d’hyperalgésie après une semaine d’administration quotidienne. Le syndrome de sevrage, précipité par la naltrexone est plus faible après l’administration chronique de ce composé qu’avec l’agoniste opioïdergique de référence. De plus, grâce à ses caractéristiques d’agoniste biaisé sur le récepteur MOR, cette molécule induit une plus faible dépression respiratoire chez la souris. / Opioid analgesics continue to be the cornerstones for treating moderate to severe pain. However, upon chronic administration, their efficiency is limited because of prominent side effects, such as tolerance and dependence. One hypothesis for the occurrence of these side effects is that the chronic stimulation of the opioid system may trigger its endogenous counterparts, anti-opioid systems, producing hyperalgesia and analgesic tolerance. Previous data from our lab and others suggest that RF-amide peptide receptors can modulate pain signalling through cross-interactions. We developed cell lines expressing fluorescent RF-amide receptors for the study of functional crosstalk and heterodimerization between RF-amide peptide receptors, i.e. GPR103 and NPFF1R. Through a productive collaboration with two teams of chemists, we identified and characterized multitarget peptidomimetic compounds that combined G protein-biased agonism and NPFFR antagonism. In accordance with in vitro results, we observed that acute subcutaneous administration of this compound produced long-lasting antinociceptive effects with less respiratory depression in mice. No hypersensitivity nor analgesic tolerance developed after chronic administration. Altogether, this molecule showed potent antinociceptive effect with limited side effects upon acute and chronic administration.

Ces travaux de thèse concernent le développement d'une biopuce à membranes permettant de réincorporer de manière fonctionnelle une protéine transmembranaire de la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), CXCR4, dans une bicouche lipidique attachée et espacée sur un substrat d'or par pilotis peptidiques (pep-tBLM), sous un format miniaturisé et parallélisé. Le peptide pilotis utilisé, P19-4H, possède une cystéine en position N-terminale pour son greffage covalent sur la surface d'or et quatre résidus Histidine en position C-terminale pour l'attachement par chélation, en présence de Nickel, de protéoliposomes réintégrant CXCR4. La synthèse de cette protéine s'effectue par expression acellulaire sous forme de protéoliposomes, dans une composition lipidique adaptée et en présence d'un lipide chélatant, le DOGS-NTA, à 2% de la quantité molaire totale des lipides. Le peptide AH, un peptide fusogène, est utilisé dans une dernière étape pour fusionner les protéoliposomes attachés. La caractérisation approfondie des protéoliposomes et l'optimisation des conditions expérimentales ont permis d'aboutir à l'attachement robuste des protéoliposomes avec une densité lipidique suffisante pour leur fusion par le peptide AH et la formation d'une pep-tBLM réintégrant CXCR4. Des études de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ont montré que la pep-tBLM réinsérant CXCR4 était fluide, homogène et continue, avec un coefficient de diffusion de 2.10-7 cm2/s. Des études d'interaction entre CXCR4 et un ligand antagoniste, le T22, ont révélé que la protéine s'insère dans la pep-tBLM de manière fonctionnelle et orientée. Le processus de formation de la pep-tBLM a été miniaturisé par microstructuration du support consistant à recouvrir la surface d'or de polystyrène puis à former des micropuits exposant la surface d'or en leur fond. Le peptide P19-4H a été déposé de manière contrôlée dans les micropuits à l'aide d'un robot de dépôt pour former des plots de pep-tBLM intégrant CXCR4. La fonctionnalité de CXCR4 réinsérée dans ces plots de membranes a été attestée par des études d'interaction avec son ligand T22. L'ensemble des étapes de formation, d'optimisation et de miniaturisation des pep-tBLM a été suivi, visualisé et caractérisé en temps réel et sans marquage par la technique d'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi). La technologie « TransMembraChip » développée au cours de cette thèse représente une méthode de choix pour la réincorporation et l'étude fonctionnelle de protéines transmembranaires dans une composition lipidique adaptée. Les protéines transmembranaires, en particulier les RCPG, représentent des cibles thérapeutiques intéressantes. Ainsi, dans le cadre de la recherche de candidats médicaments pour le traitement de pathologies impliquant des protéines transmembranaires, cette nouvelle génération de biopuce à membranes constitue un outil prometteur adapté au criblage de ligands agonistes ou antagonistes de ces protéines / This thesis presents the development of a membrane biochip allowing to functionally reincorporate a transmembrane protein of the G-protein coupled receptor (GPCR) family, CXCR4, in a peptide-tethered bilayer lipid membrane (pep-tBLM), in a miniaturized and parallelized format. The peptide tether used, P19-4H, possesses a cysteine in its N-terminal extremity for covalent grafting onto the gold surface and four Histidine residues in its C-terminal extremity for attachment of proteoliposomes integrating CXCR4 by metal-chelate interaction in the presence of nickel. The synthesis of CXCR4 was carried out by cell-free expression in the form of proteoliposomes, in a suitable lipid composition and in the presence of a chelating lipid, DOGS-NTA, at 2% molar ratio. The AH peptide, a fusogenic peptide, was employed in a last step to fuse the attached proteoliposomes. The thorough characterization of proteoliposomes and the optimization of experimental conditions led to the robust attachment of proteoliposomes with sufficient lipid density to perform their fusion by the AH peptide and the formation of a pep-tBLM integrating CXCR4. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) studies have shown that the pep-tBLM reinserting CXCR4 was fluid, homogeneous and continuous, with a diffusion coefficient of 2 x 10-7 cm2/s. Ligand binding studies between CXCR4 and T22, an antagonist, revealed that the protein was functional and well-oriented in the peptBLM. The formation process of the pep-tBLM was miniaturized by support microstructuration, consisting in covering the gold surface with polystyrene and then, forming microwells exposing the gold surface at their bottom. The P19-4H peptide was spotted in a controlled manner into the microwells to form microspots of pep-tBLM incorporating CXCR4. The functionality of CXCR4 reinserted into these membrane microspots was confirmed by T22 ligand binding studies. All the steps of formation, optimization and miniaturization of the pep-tBLM were monitored, visualized and characterized by surface plasmon resonance imaging (SPRi), a real time and label-free technique for the detection of interactions. The "TransMembraChip" technology developed in this work represents a method of choice for the reincorporation and functional study of transmembrane proteins in a suitable lipid composition. Transmembrane proteins, particularly GPCRs, form interesting therapeutic targets. Thus, in the context of pharmaceutical research of drug candidates for the treatment of pathologies involving transmembrane proteins, this new generation of membrane biochip is a promising tool for screening agonist or antagonist ligands of these proteins

Le développement d'outils performants de criblage de nouvelles molécules capables d'induire une réponse cellulaire identique à celle d'un ligand (agoniste/ antagoniste, etc...), est un enjeu important pour la recherche pharmaceutique. Les principales cibles utilisées aujourd'hui sont les récepteurs trans-membranaires couplés aux protéines G (RCPG), dont l'activation déclenche une cascade de réactions intracellulaires (signalisation) régulant des fonctions essentielles de la cellule. L'objectif de ce travail de thèse est la détection de l'initiation de la signalisation cellulaire par spectrométrie de fluorescence pour le récepteur d opioïde murin (mDOR) qui induit un changement conformationnel responsable d'un épaississement de sa partie transmembranaire lors de la signalisation, au niveau de la membrane plasmique de cellules eucaryotes in vivo. Ce changement est supposé générer des modifications de phase lipidique de la membrane plasmique lors de cette interaction RCPG/agoniste, avec des redistributions locales de certains lipides comme le cholestérol, conduisant à la génération d'une phase liquide-ordonnée (lo). Pour cela deux nouvelles sondes fluorescentes membranaires de la famille des Pyrènecholestérol ont été synthétisées, le 3b-hydroxy-pregn-5-ène-21-(1-méthylpyrényl)-20-one 1 et le 3b- hydroxy-pregn-5-ène-21-(1-méthylpyrényl)-20-méthylidène 2. Dans un premier temps la comparaison du comportement de ces sondes vis-à-vis du cholestérol a été analysée dans différentes membranes modèles phospholipidiques. Les données de microcalorimétrie et de RMN-2H indiquent que ces composés induisent des perturbations des lipides comparables à celle du cholestérol. Les données d'absorption, combinées à la propriété hypochromique du chromophore pyrène, ont permis de mettre en évidence un comportement autoassociatif de ces sondes. Nous extrapolons ce résultat à celui du cholestérol car des simulations en dynamique moléculaire déduisaient cette même associativité. Nous retrouvons qu'elle augmente avec le degré d'insaturation des chaînes acyles et qu'elle diminue quand la quantité de cholestérol croît (plus grande miscibilité des sondes dans les membranes enrichies en cholestérol). Dans un deuxième temps la sensibilité du spectre d'émission de fluorescence à la polarité de l'environnement a été vérifiée et mise à profit dans des membranes modèles pour discriminer les membranes en phase ld de celles en phase lo (où la polarité du coeur de la membrane est plus faible). Enfin, l'incorporation de la sonde 2 dans la membrane plasmique de cellules vivantes CHO qui sur-expriment mDOR, a permit le suivi dans le temps, par spectrofluorimétrie et microspectrofluorimétrie, de la perturbation de phase induite par un agoniste de ce récepteur. Les bases d'un criblage sélectif sont donc posées.

La question se pose de l'existence de domaines membranaires permettant de regrouper les différentes protéines nécessaires à la transmission du signal par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Nous avons donc analysé l'organisation dynamique du récepteur mu opioïde humain (hMOR) en relation avec ses paramètres pharmacologiques et les contraintes de son environnement. Après avoir vérifié la fonctionnalité de T7-EGFP-hMOR dans les SH-SY5Y, sa dynamique latérale a été étudiée par retour de fluorescence après photoblanchiment à rayon variable (FRAPrv) et par suivi de particule unique (SPT). A 22°C ces analyses ont révélé une double compartimentation des récepteurs : dans des domaines perméables de près de 1 µm de rayon et dans des domaines de rayon inférieur à 200 nm. De plus, près d'un tiers des récepteurs présente une diffusion dirigée. Les effets de la variation de température, de la déstabilisation du cytosquelette d'actine et du blocage de l'interaction protéine G/récepteur ont été observés afin de mieux comprendre l'origine de ces domaines. Bien que tous les paramètres qui y participent ne soient pas encore déterminés, les résultats indiquent que les protéines G ainsi que le cytosquelette influencent l'organisation membranaire de hMOR. La fixation d'antagonistes ne modifie pas la diffusion du récepteur. Au contraire celle des agonistes entraînent une diminution de la taille des domaines et un ralentissement des récepteurs en lien avec la transmission du signal et l'internalisation. Nos résultats soulignent l'importance de plusieurs paramètres sur l'organisation dynamique de hMOR et confortent l'intérêt de l'utilisation conjointe du FRAP et du SPT.

À partir des ovocytes de la palourde Spisula solidissima, un ADNc codant un récepteur nommé Spi-OAR a été cloné et séquencé. Une analyse de la séquence en acides aminés a indiqué que ce nouveau récepteur possède une forte similarité avec les récepteurs β-adrénergiques et les récepteurs à octopamine. En effet, il est étroitement lié à la classe des récepteurs à octopamine « β-adrénergique-like » couplés à une protéine Gs. L’ADNc de Spi-OAR a été introduit dans un vecteur d'expression (pCEP4) et un épitope reconnaissable par un anticorps commercial a été ajouté au segment N-terminal. Cette construction a été transfectée dans des cellules hôtes (HEK 293) et des études d’immunofluorescence ont montré une expression efficace du récepteur au niveau membranaire. Également, des mesures d'AMPc pour les cellules exprimant Spi-OAR ont révélé une augmentation de ce messager secondaire lors de l'ajout de l'octopamine, et dans une moindre mesure, la tyramine, tandis que la dopamine, la sérotonine et l'histamine n’ont engendré aucun effet. Une légère activité constitutive de ce récepteur dans les cellules hôtes a été observée. De plus, une analyse RT-PCR avec des oligonucléotides spécifiques a révélé l'ARNm de Spi-OAR non seulement dans les ovocytes, mais aussi dans les gonades, le cœur, les muscles adducteurs, les branchies et les ganglions suggérant que ce récepteur soit exprimé de façon ubiquitaire dans divers tissus et dans différents stades embryonnaires chez la palourde. En outre, des études avec des ovocytes isolés n'ont montré aucun effet de l’octopamine sur la réactivation méiotique. Des études éventuelles pourront finalement confirmer le rôle fonctionnel de Spi-OAR. / A cDNA encoding for an octopamine receptor named Spi-OAR was cloned and sequenced from the surf clam Spisula solidissima oocytes. An analysis of its predicted amino acid sequence showed a high degree of similarity with β-adrenergic and octopamine receptors. This receptor qualifies as a novel receptor closely related to the proposed class of insect octopamine « β-adrenergic–like » receptors coupled to Gs protein. This cDNA was introduced into an expression vector (pCEP4), with an added N-terminal FLAG tag sequence, and transfected in host cells (HEK 293). Immunofluorescence studies showed expression of the receptor with a proper localization to the plasma membrane. Measurements of cAMP in transfected cells revealed that addition of octopamine, and to a lower extent, tyramine induced a rise in cAMP while dopamine, serotonine and histamine had no effect. Overexpression of Spi-OAR in mammalian cells induced slight constitutive increase of cAMP. An RT-PCR analysis with specific oligonucleotides revealed the presence of the receptor mRNA not only in oocytes but also in whole gonads, heart, adductor muscle, gills and ganglia suggesting that this receptor is likely ubiquitously expressed. Expression of Spi-OAR was also detected at different embryonic stages. Despite the demonstrated expression of Spi-OAR in oocytes, octopamine had no effect on meiotic reinitiation. Further studies will examine the function of Spi-OAR.

Les RCPG sont exprimés dans tous types de tissus et sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques et ont pour rôle de capter un vaste panel de stimuli extracellulaires qu'ils transmettent à l'intérieur de la cellule. Récemment, le laboratoire a identifié une nouvelle famille de dix protéines, les GASP, qui interagissent avec les RCPG et moduleraient leur trafic intracellulaire. Alors que GASP-1 est le membre de cette famille le mieux caractérisé et que son interaction avec de nombreux RCPG soit documentée, peu d'informations sont disponibles sur les modalités d'interaction de cette protéineavec les RCPG au niveau moléculaire. La première partie de ce projet de thèse a consisté à étudier les modalités d'interaction entre les GASPs et les RCPG au niveau moléculaire. Nous avons ainsi pu montrer à l'aide de techniques biochimiques et biophysiques, l'importance d'un motif répété et conservé de 15 acides aminés pour l'interaction de GASP-1 avec divers RCPG. Par la suite, les résultats obtenus ont été exploités pour mettre en place un essai de criblage qui nous a permis d'identifier des petites molécules capables de perturber l'interaction entre GASP-1 et le récepteur beta-2 adrénergique. Enfin, l'absence de données structurales sur les protéines de la famille GASP nous a ensuite poussé à la réalisation d'études structurales de ces protéines à la fois par cristallographie et par RMN. Bien que les résultats obtenus ne nous aient pas encore permis d'obtenir la structure de ces protéines, des expériences préliminaires de RMN ont permis deconfirmer l'implication des acides aminés tryptophanes présents au sein des motifs GASP dans l'interaction avec les RCPG.