京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第25025号 / 生博第516号 / 新制||生||69(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 鈴木 淳, 教授 中野 雄司, 教授 野田 岳志 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

GPCRs form the largest family of membrane proteins in human genome and mediate signal transmission in a wide panel of essential physiological processes, and they are thus a major source of pharmaceutical targets. Investigating GPCR interactions with their cognate ligands and their membrane environment is crucial to understand their function at a molecular level. While major breakthroughs in the determination of high resolution structures of GPCRs in inactive and active states have shed a new light on the structural basis of GPCR activation process, complementary approaches are needed to investigate its dynamic aspects in the context of a native lipid environment. Our research work falls within this scope and hinges on two main issues: on the one hand, understand which structural features of the agonist underlie the activation of S1P receptors; on the other hand determine if membrane lipids modulate the structure and the function of the vasopressin V2 receptor (V2R). First, we investigated the functional response of S1P1, S1P2, S1P4 and S1P5 receptors expressed in mammalian cells to a series of synthetic derivatives of the native ligand sphingosine-1-phosphate, of variable alkyl chain length. Our data demonstrated that the hydrophobic tail of the ligand is crucial to induce activation in S1P receptors family, and revealed subtype-specificities regarding the influence of the alkyl chain length. Our experimental results combined with molecular dynamics simulation lead us to propose an activation mechanism for S1P receptors family. In the second part of our work, we reconstituted purified V2R into systems of controlled lipid composition, mimicking the membrane bilayer. Structural and functional characterization of the receptor in different lipid environments, using infrared and fluorescence spectroscopy approaches, revealed that the lipid composition affects V2R conformation and its interaction with a specific ligand. Taken together, our research work contributes to a better understanding of GPCRs activation mechanism and its regulation by lipid environment. / Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) forment la plus grande famille de protéines membranaires du génome humain et contribuent à une kyrielle de processus physiologiques essentiels, qui leur confèrent un intérêt pharmacologique majeur. Étudier l'interaction de ces protéines avec leurs ligands et leur environnement membranaire est primordial pour appréhender leur fonctionnement à l’échelle moléculaire. Bien que de remarquables avancées dans la détermination de structures à haute résolution de GPCRs à l'état inactif et actif aient permis de comprendre certaines bases structurales du fonctionnement des récepteurs, des approches complémentaires donnant un aperçu des aspects dynamiques et dans un environnement natif sont nécessaires pour cerner pleinement leur mécanisme d'activation. Notre travail de thèse s'inscrit dans cette problématique et s'articule autour de deux sujets: d'une part, comprendre quelles caractéristiques structurales du ligand sous-tendent l'activation de la famille des récepteurs au sphingosine-1-phosphate (S1P); d'autre part, déterminer si les lipides de la membrane plasmique modulent la structure et la fonction du récepteur à la vasopressine V2. Pour répondre à notre première question, nous avons étudié la réponse fonctionnelle en système cellulaire des récepteurs S1P1, S1P2, S1P4 et S1P5 à des composés synthétiques dérivés du S1P, portant des chaînes alkyles de longueur variable. Nos données mettent en évidence que la longueur de la chaîne hydrocarbonée du ligand est un paramètre crucial dans sa capacité d'induire l'activation du récepteur et ce pour l'ensemble des sous-types étudiés. De plus, nos résultats suggèrent que le comportement vis-à-vis de la longueur de chaîne dépend du sous-type de récepteur considéré. Nos résultats expérimentaux, combinés à une approche de modélisation dynamique, ont abouti à proposer un mécanisme d'activation pour la famille des récepteurs au S1P. Dans le second volet de notre travail, nous avons reconstitué le récepteur V2 purifié dans des systèmes de composition lipidique contrôlée, mimant la bicouche membranaire. Nous avons procédé à la caractérisation structurale et fonctionnelle du récepteur inséré dans différentes types de lipides, par des méthodes spectroscopiques infrarouge et de fluorescence. Les données obtenues suggèrent que la composition lipidique affecte la conformation et la fonction du récepteur. L'ensemble de nos travaux contribue ainsi à une meilleure compréhension du mécanisme d'activation des GPCRs et de leur régulation par l'environnement lipidique. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Résumé : La signalisation biaisée représente la capacité des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) d'engager des voies de signalisation distinctes avec des efficacités variables selon le ligand utilisé ou la mutation dans le récepteur. Un meilleur contrôle des voies activées ou inhibées par des médicaments pourrait permettre de réduire leurs effets indésirables. Malheureusement, les mécanismes structuraux impliqués dans la transmission du signal à travers la membrane plasmique par l'entremise des RCPG sont peu connus, ce qui limite le développement rationnel de nouvelles molécules ciblant des voies de signalisation particulières. Le récepteur de type 1 à l'angiotensine II (AT[indice inférieur 1]), un RCPG de classe A prototypique, peut activer différents effecteurs suite à sa stimulation par le ligand endogène angiotensine II (AngII), incluant la protéine G[indice inférieur q/11] et les β-arrestines. Il est suggéré que l'activation de ces deux voies de signalisation peut être associée à des conformations différentes du récepteur AT[indice inférieur 1]. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons utilisé des simulations de dynamique moléculaire afin d'explorer les interactions et les mouvements qui définissent le paysage conformationnel du récepteur AT[indice inférieur 1]. De plus, nous avons vérifié comment était modifié le paysage conformationnel par des mutations (N111G, N111W et D74N) et des ligands (AngII et [Sar[indice supérieur 1], Ile[indice supérieur 8]]AngII) ayant des profils signalétiques différents pour la voie de la protéine G[indice inférieur q/11] et la voie des β-arrestines. Les résultats obtenus nous éclairent sur le rôle d'un réseau de ponts hydrogène entre des résidus polaires conservés au coeur du récepteur dont font partie les résidus N111[indice supérieur 3.35] et D74[indice supérieur 2.50]. Les résultats révèlent la présence d'un groupe de résidus hydrophobes juste au-dessus du réseau de ponts hydrogène et adjacent à la pochette de liaison du récepteur qui semble important pour la stabilisation de l'état inactif du récepteur ainsi que pour son activation par un ligand. Dans l'ensemble, les résultats suggèrent que l'activation de la voie de la protéine G[indice inférieur q/11] est associée avec une transition conformationnelle spécifique stabilisée par l'agoniste alors que l'activation de la voie des β-arrestines est associée à une stabilisation de l'état de repos du récepteur. / Abstract: Biased signaling represents the ability of G protein-coupled receptors to engage distinct pathways with various efficacies depending on the ligand used or on mutations in the receptor. Having better control over the signaling pathways activated or inhibited by drugs could lead to fewer undesirable effects. Unfortunately, the structural mechanisms involved in the transmission of signal across the cell membrane through the receptors are poorly understood, which limits the rational development of new molecules targetting specific signaling pathways. The angiotensin-II type 1 (AT[subscript 1]) receptor, a prototypical class A G protein-coupled receptor, can activate various effectors upon stimulation with the endogenous ligand angiotensin-II (AngII), including the G[subscript q/11] protein and β-arrestins. It is believed that the activation of those two pathways can be associated with distinct conformations of the AT[subscript 1] receptor. To verify this hypothesis, microseconds of molecular dynamics simulations were computed to explore interactions and movements that define the conformational landscape of the AT[subscript 1] receptor. We have also verified how this conformational landscape is modified by mutations (N111G, N111W, D74N) and ligands (AngII, [Sar[superscript 1]Ile[superscript 8]]AngII) that have different signaling properties on the G[subscript q/11] pathway and the β-arrestin pathway. The results provide a better understanding of the role of a hydrogen bond network formed of conserved polar residues in the receptor core which include residues N111[superscript 3.35] and D74[superscript 2.50]. The results also reveal the existence of a cluster of hydrophobic residues located right above the hydrogen bonds network and adjacent to the binding pocket that appears important for the stabilization of the ground state of the receptor as well as its ligand-induced activation. As a whole, the results suggest that activation of the G[supbscript q/11] pathway is associated with a specific conformational transition stabilized by the agonist, whereas the activation of the β-arrestin pathway is linked to the stabilization of the ground state of the receptor.

The major allergen Der p 1 of the house dust mite Dermatophagoides pteronyssinus is a papain-like cysteine protease (CA1) associated to the development of allergic diseases such as asthma, rhinitis or atopic dermatitis. This allergen is expressed as an inactive precursor, called proDer p 1, formed by a 25 kDa catalytic domain downstream to an 10 kDa N-terminal propeptide, which blocks the active site cleft. The propeptide of Der p 1 exhibits a specific fold, which makes it unique in the CA1 propeptide family as it is characterised by the presence of four alpha helices and the absence of ERFNIN motif. In this study, we investigated the activation steps involved in the maturation of recombinant proDer p 1 expressed in Pichia pastoris under acidic conditions and we studied the influence of acidic pH on the structure of both propeptide and catalytic domain. Therefore, we characterized the interaction between the propeptide and mature Der p 1 at different pH values in terms of activity inhibition, structural stability and proteolytic susceptibility. According to our results, the auto-activation of proDer p 1 is a multistep mechanism, characterized by at least two intermediates (ATFE- and SNGG-) corresponding to the loss of the first and second propeptide alpha helices, respectively. The propeptide strongly inhibits unglycosylated and glycosylated recombinant Der p 1 (KD= 7 nM) at neutral pH. This inhibition is pH dependent, decreasing from pH 7 to pH 4 and can be related to structural changes of the propeptide initiated by the protonation of the aspartate residue of Lys17-Asp51-Tyr19 structural triad presents within the propeptide N-terminal domain. This protonation triggers conformational changes of the first propeptide alpha helix leading to an increase of the propeptide flexibility, an increase of its proteolytic sensitivity and the formation of a molten globule state. In addition, we compare mature protease, zymogen and propeptide pH unfolding and stability and highlights that the presence of the propeptide does not influence the catalytic domain pH unfolding and stability as the propeptide displays a weaker pH stability than the protease domain. These results confirmed that the propeptide unfolding is the key event of the activation process. Finally, we unravel the intermolecular contribution of mature Der p 1 in the activation process and highlights that activation of the precursor can be achieved, under acidic conditions, by intermolecular process but initial auto-activation most probably occurs through an intramolecular process or by the proteolysis by the catalytic domain of another zymogen in which the propeptide is unfolded. According to our results, we proposed that activation of the zymogen at pH 4 reflects a compromise between activity preservation and propeptide unfolding and that the location of the activation sites on the propeptide structure is a compromise between sequence recognition specificity and proteolytic susceptibility of the corresponding area.