L'autophagie est un processus permettant la dégradation de constituants cytosoliques dans un compartiment lytique, par leur séquestration au sein d'une vésicule à double membrane : l'autophagosome. L'autophagie est, avec la voie ubiquitine-protéasome, l'une des deux grandes voies de dégradation présente de manière fortement conservée chez les cellules eucaryotes. Présente à un niveau basal, elle peut être stimulée afin de permettre la remobilisation de ressources cellulaires, ou d'assurer des fonctions cytoprotectrices et de détoxification. La formation d'autophagosomes traduit alors la capacité du système endomembranaire à s'adapter aux besoins cellulaires. Cependant, la mécanique membranaire et moléculaire de ce phénomène reste mal comprise. L'objectif de ce travail de thèse était de mieux comprendre la formation de ce compartiment dans la cellule végétale. Pour cela, nous avons tout d'abord mis au point les conditions propices à l'étude de l'autophagie dans la racine d’Arabidopsis thaliana, puis nous avons entrepris l'identification de marqueurs des étapes de formation de l'autophagosome. L'étude par imagerie en temps réel et 3D de la protéine ATG5, impliquée dans l’expansion membranaire, nous a permis de mettre en évidence son recrutement transitoire sur un domaine particulier de l'autophagosome en formation, son ouverture. De plus, l'étude de différents acteurs du système endomembranaire, nous a permis de mettre en évidence et de caractériser l'implication du réticulum endoplasmique et de ATG9, pour aboutir à un modèle de la formation de l'autophagosome chez les plantes. / Autophagy is a catabolic process targeting cytosolic compounds to the lytic compartment after sequestration within a double membrane bound vesicle: the autophagosome. Along with the ubiquitin-proteasome pathway, autophagy is one of the main catabolic processes conserved among eukaryotic cells. Present at a basal level, it can be stimulated to allow: remobilization of cell resources, cytoprotective functions, and detoxification. Autophagosome formation demonstrates the capacity of the endomembrane system to adapt dynamically to the cell's environment. However, the membrane and molecular processes involved are still poorly understood. This work aimed to advance understanding of autophagosome formation in plant cells. First of all, we set up suitable conditions for the study of autophagy in the Arabidopsis root, then we identified markers of the autophagosome formation steps. Live and 3D imaging of the ATG5 protein, involved in membrane expansion, demonstrated its transient recruitment to a specific domain of the forming autophagosome, its aperture. Furthermore, studying different actors of the endomembrane system has allowed us to implicate the endoplasmic reticulum and ATG9, and to establish a model for autophagosome formation in plants.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

A l’ère de l’objectif cible « 90-90-90 » de l’ONUSIDA de réduction de la pandémie liée à HIV, il est important d’évaluer régulièrement la cascade de prise en charge des personnes vivant avec le virus HIV afin d’en vérifier l’avancement et d’identifier d’éventuels obstacles à sa réalisation. Pour cela nous avons étudié tout d’abord efficacité du traitement antirétroviral (TAR) dans le sang de personnes nouvellement dépistées séropositives à Bamako (Mali). Dans un deuxième travail nous avons évalué la faisabilité des tests de charge virale et de résistance génotypique aux antirétroviraux à partir de sang total séché sur un support de type buvard (DBS). La troisième partie de nos travaux était consacrée à des aspects plus physiopathologiques avec l’évaluation du traitement sur les réservoirs salivaires et génitaux (patients de Bamako) et sur le microbiote vaginal, ainsi que l’étude du profil de résistance des souches archivées dans l’ADN cellulaire de biopsies rectales. Nous avons tout d’abord observé un taux important de perdus de vue à un an dans la cohorte de Bamako (environ 45%). Nous avons également constaté un taux élevé de résistance primaire aux ARV à Bamako et au Tchad (>15%). De manière rassurante, le succès virologique au bout de 1 an chez les personnes traitées était d’environ 90% ce qui correspond à l’objectif de l’ONUSIDA (3ème 90) et un faible niveau de mutations acquises a été observé chez ces personnes adhérentes au traitement. Nous avons démontré l’efficacité du TAR sur le compartiment salivaire et constaté une compartimentation du virus au niveau cervico-vaginal chez certaines femmes traitées (27%) présentant une excrétion virale au niveau vaginal avec une charge virale plasmatique indétectable et/ou des séquences génétiques différentes sur le gène pol entre le virus isolé dans la muqueuse et celui provenant du sang. De plus, une dysbiose était observée avant la mise sous traitement, avec normalisation de la flore sous TAR efficace. En ce qui concerne le travail sur les biopsies rectales, des profils similaires ont été observés entre la souche plasmatique majoritaire au moment de la mise sous TAR et celle archivée dans le rectum 1 à 5 ans après traitement. En conclusion, nos travaux apportent des informations nouvelles sur le déroulement des différentes étapes de la prise en charge de l’infection par HIV dans les pays en développement : tout d’abord une faible adhésion au traitement ce qui peut constituer un obstacle majeur à la réalisation du plan 90/90/90 ; une forte prévalence de la résistance primaire qui plaident en faveur de l’accessibilité aux différentes classes d’antirétroviraux et de leur utilisation rationnelle, de l’utilisation généralisée en routine des tests de charge virale et du développement d’un réseau de surveillance de la résistance aux ARV dans les pays à ressources limitées ; des données d’efficacité de traitement sur les réservoirs muqueux mettant en évidence l’existence d’une dysbiose et d’une compartimentation du virus au niveau génital ce qui pose le problème du risque résiduel de transmission chez certaines personnes, même sous ARV. / Regularly assess to UNAIDS cascade 90-90-90 is important to check the progress and identify any obstacles to its implementation. For this we first studied efficacy of antiretroviral treatment (ART) in the blood of newly diagnosed HIV-positive in Bamako (Mali).In a second work we evaluated the feasibility of viral load and genotypic resistance tests from dried blood spot (DBS). The third part of our work is dedicated to pathophysiological aspects with evaluation of treatment on salivary and genital reservoirs (Bamako patients) and on the vaginal microbiota, as well as the study of the resistance profile of the strains archived in cellular DNA of rectal biopsies. We observed a high rate of lost to follow-up at one year in the Bamako cohort (45%). We also found a high rate of ART primary resistance in Bamako and Chad (> 15%). Reassuringly, the virological success after 1 year of treated follow was about 90% in these adherents. We also demonstrated the efficacy of ART in the salivary compartment and found a compartmentalization of the virus at the cervico-vaginal level in some women under ART. In addition, a dysbiosis was observed before ART, and a normal flora under effective ART. Similar profiles were observed on the main strain isolated in blood at the time of diagnosis and on the archived strain in the rectum after 1 to 5 years of ART.In conclusion, our work provides new information on the progress of the treatment stages of HIV infection in developing countries: low adherence to treatment which can constitute a major obstacle to achieve the plan 90/90/90; a high prevalence of primary resistance advocating accessibility and rational use of different classes of antiretrovirals drugs, widespread routine use of viral load tests and the development of ARVs resistance surveillance network in resource-limited countries; treatment efficacy data on mucosal reservoirs revealing the existence of genital dysbiosis and viral compartmentalization, which raises the problem of the residual risk of transmission in some people, even under ARVs.

La protéine kinase AMPc-dépendante (PKA) joue un rôle crucial dans la régulation neurohormonale de la fonction cardiaque. L’activation aiguë de la PKA est bénéfique car elle conduit à une augmentation de la contraction cardiaque en phosphorylant les acteurs clés du couplage excitation-contraction. En revanche, son activation chronique est délétère et ces effets semblent faire intervenir la régulation de protéines nucléaires pouvant conduire au remodelage hypertrophique et à l'insuffisance cardiaque. La localisation subcellulaire de la PKA, assurée par des protéines d’ancrage (AKAPs), est importante pour la rapidité et la spécificité d’action des hormones mettant en jeu la voie de l’AMPc. Les niveaux d’AMPc sont régulés par l’activité des adénylate cyclases et des phosphodiestérases (PDEs), et l’état de phosphorylation des protéines cibles de la PKA dépend de l’activité des Ser/Thr phosphatases (PPs). Dans le cœur, les PDEs les plus importantes dégradant l’AMPc sont les PDE3 et les PDE4. Les principales PPs cardiaques sont PP1, PP2A et PP2B. Dans une première partie de mon travail, j’ai mis au point, dans les cardiomyocytes de rats adultes, une mesure de l’activité de la PKA en temps réel dans les compartiments cytoplasmiques et nucléaires. J’ai utilisé pour cela des sondes de type AKAR (A-kinase activity reporters) basées sur le transfert d’énergie de fluorescence (FRET) et localisées spécifiquement dans le noyau ou dans le cytoplasme par des séquences d’adressage ou d’exclusion nucléaires. J’ai ainsi pu montrer qu’une stimulation maintenue des récepteurs β-adrénergiques active la PKA de façon plus importante dans le cytoplasme que dans le noyau, et que cette activation se développe lentement au niveau nucléaire que dans le cytoplasme. De ce fait, une stimulation brève des récepteurs β-adrénergiques active maximalement la PKA dans le cytoplasme, mais de façon marginale dans le noyau. Dans une seconde partie de l’étude, je me suis intéressée au rôle des PDE3 et PDE4 ainsi qu’à celui de PP1, PP2A et PP2B dans la régulation de l’activité PKA cytoplasmique et nucléaire, en réponse à une stimulation β-adrénergique. J’ai montré que la PDE4, mais pas la PDE3, régule l’activité de la PKA cytoplasmique et nucléaire. L’utilisation de souris invalidées pour les gènes Pde4b et Pde4d a révélé que l’isoforme PDE4B est prédominante pour la modulation de l’activité PKA cytoplasmique, alors que les deux isoformes PDE4B et PDE4D contribuent à la régulation de l’activité PKA nucléaire. Finalement, j’ai montré que la PP1 et la PP2A, mais pas la PP2B, participent à la terminaison des réponses β-adrénergiques dans le cytoplasme, alors qu’au niveau nucléaire, la PP1 semble jouer un rôle majeur. En conclusion, ce travail a mis en évidence le rôle des phosphodiestérases et des phosphatases dans l’intégration différentielle des réponses PKA à une stimulation β-adrénergique dans le cytoplasme et le noyau de cardiomyocytes adultes. / The cAMP-dependent protein kinase (PKA) exerts short term beneficial effects on cardiac function by phosphorylating several key excitation-contraction coupling (ECC) proteins. However, its chronic activation is deleterious on the long term, and this may involve regulation of nuclear effectors ultimately leading to hypertrophic remodelling and heart failure. The subcellular localization of PKA, mediated by anchoring proteins (AKAPs), is important for the speed and specificity of hormones that activate the cAMP pathway. The levels of cAMP are regulated by adenylyl cyclase and phosphodiesterases (PDEs), and PKA activity is counterbalanced by Ser/Thr phosphatases (PPs). In heart, the most important PDEs that degrade cAMP belong to the PDE3 and PDE4 famillies, whereas the major cardiac PPs are PP1, PP2A and PP2B. In a first part, I developed, in adult rat cardiomyocytes, a technique to measure PKA activity in real time specifically in the cytoplasm and the nucleus. For this I used genetically-encoded fluorescence resonance energy transfer (FRET) sensors called AKAR (A-kinase activity reporters) that can be targeted specifically to the nucleus or the cytoplasm by nuclear localization or exclusion sequences, respectively. Using this approach, I showed that maintained β-adrenergic stimulation activates PKA more efficiently and more potently in the cytoplasm than in the nucleus, and that the kinetics of PKA activation was much slower in the nucleus than in the cytoplasm. Accordingly, a short β-adrenergic stimulation maximally activated PKA in the cytoplasm but marginally activated PKA in the nucleus. In a second part, I characterized the respective contribution of PDE3, PDE4, and PP1, PP2A and PP2B families in the regulation of cytoplasmic and nuclear PKA activity in response to β-adrenergic stimulation. PDE4, but not PDE3, regulates PKA activity in the cytoplasm and in the nucleus. The use of knock out mice for Pde4b and Pde4d genes revealed that PDE4B plays a predominant role to modulate β-AR stimulation of cytoplasmic PKA, whereas in the nucleus both PDE4B and PDE4D isoforms contribute. Finally, I showed that both PP1 and PP2A, but not PP2B, participate to the termination of β-adrenergic PKA responses in the cytoplasm, whereas PP1 appears to play a major role in the nuclei. In conclusion, this work highlights the role of phosphodiesterases and phosphatases in the differential integration of PKA responses to β-adrenergic stimulation in the cytoplasm and the nucleus of adult cardiomyocytes.

Avec l'avènement de la microélectronique et des techniques de miniaturisation, de nouveaux domaines transdisciplinaires sont nés au confluent des sciences de l'ingénieur, de la matière et du vivant. La technologie a désormais investi l'échelle du nanomètre ; elle parvient à sonder, mais aussi surtout à façonner les constituants élémentaires de la matière synthétique et organique, depuis les atomes jusqu'aux complexes macromoléculaires. La nécessité d'isoler des molécules et des assemblages supramoléculaires est motivée par leur découplage du milieu environnant avec lequel ils interagissent. Des stratégies de compartimentation se sont devéloppées pour répondre aux besoins grandissants d'isolement de ces entités, en particulier à travers deux approches classiques en nanotechnologie : top-down et bottom-up. L'approche top-down consiste à "sculpter" la matière pour lui conférer des dimensions compatibles avec les objets à confiner. La lithographie et les techniques de microfabrication en général rentrent typiquement dans cette catégorie. Des stratégies microfluidiques destinées à manipuler spécifiquement des assemblages supramoléculaires ont été ainsi développées soit en vu d'applications pour la microanalyse totale, soit pour des études biophysiques fondamentales. Dans l'approche bottom-up, des molécules de natures différentes sont agencées pour former l'entité qui va confiner les objets d'intérêt. La chimie et le vivant procèdent par cette approche pour synthétiser des assemblages supramoléculaires et des organismes. Dans cette optique, la compaction de polyélectrolytes par des agents lipidiques en particules nanométriques a été étudiée. Cette stratégie permet en particulier de transférer des gènes au sein des cellules. Enfin, toujours dans le cadre d'une approche bottom-up de la compartimentation, nous présentons une méthodologie résolument bio-inspirée qui exploite les propriétés naturelles d'auto-assemblage des virus. Cette autre statégie ouvre la voie à l'encapsulation d'une large variété de molécules et de nano-objets. Elle tire avantage de l'extraordinaire précision moléculaire de l'assemblage d'un virus et vise à tirer profit de ses propriétés circulatoires dans l'organisme. C'est dans cet esprit que se clôt ce mémoire avec une présentation succinte des perspectives à long terme orientées autour de l'assemblage de systèmes viro-inspirés. Les objectifs seront d'élucider les mécanismes moléculaires sur des systèmes de complexité croissante, et en parallèle de maîtriser ces mécanismes via le développement de méthodologies d'auto-assemblage dirigé.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

L'autophagie est un processus permettant la dégradation de constituants cytosoliques dans un compartiment lytique, par leur séquestration au sein d'une vésicule à double membrane : l'autophagosome. L'autophagie est, avec la voie ubiquitine-protéasome, l'une des deux grandes voies de dégradation présente de manière fortement conservée chez les cellules eucaryotes. Présente à un niveau basal, elle peut être stimulée afin de permettre la remobilisation de ressources cellulaires, ou d'assurer des fonctions cytoprotectrices et de détoxification. La formation d'autophagosomes traduit alors la capacité du système endomembranaire à s'adapter aux besoins cellulaires. Cependant, la mécanique membranaire et moléculaire de ce phénomène reste mal comprise. L'objectif de ce travail de thèse était de mieux comprendre la formation de ce compartiment dans la cellule végétale. Pour cela, nous avons tout d'abord mis au point les conditions propices à l'étude de l'autophagie dans la racine d'Arabidopsis thaliana, puis nous avons entrepris l'identification de marqueurs des étapes de formation de l'autophagosome. L'étude par imagerie en temps réel et 3D de la protéine ATG5, impliquée dans l'expansion membranaire, nous a permis de mettre en évidence son recrutement transitoire sur un domaine particulier de l'autophagosome en formation, son ouverture. De plus, l'étude de différents acteurs du système endomembranaire, nous a permis de mettre en évidence et de caractériser l'implication du réticulum endoplasmique et de ATG9, pour aboutir à un modèle de la formation de l'autophagosome chez les plantes.

An important element of metabolic regulation of cardiac and skeletal muscle energetics is the interaction of mitochondria with cytoskeleton. Mitochondria are in charge of supplying the cells with energy, adjusting its functional activity under conditions of stress or other aspects of life. Mitochondria display a tissue-specific distribution. In adult rat cardiomyocytes, mitochondria are arranged regularly in a longitudinal lattice at the level of A band between the myofibrils and located within the limits of the sarcomeres. In interaction with cytoskeleton, sarcomeres and sarcoplasmic reticulum they form the functional complexes, the intracellular energetic units (ICEUs). The ICEUs have specialized pathways of energy transfer and metabolic feedback regulation between mitochondria and ATPases, mediated by CK and AK. The central structure of ICEUs is the mitochondrial interactosome (MI) containing ATP Synthasome, respiratory chain, mitochondrial creatine kinase and VDAC, regulated by tubulins. The main role of MI is the regulation of respiration and the intracellular energy fluxes via phosophotransfer networks. The regulation of ICEUs is associated with structural proteins. The association of mitochondria with several cytoskeletal proteins described by several groups has brought to light the importance of structure-function relationship in the metabolic regulation of adult rat cardiomyocytes. To purvey a better understanding of these findings, the present work investigated the mechanism of energy fluxes control and the role of structure-function relationship in the metabolic regulation of adult rat cardiomyocytes. To show these complex associations in adult cardiac cells several proteins were visualized by confocal microscopy: α-actinin and β-tubulin isotypes. For the first time, it was showed the existence of the specific distribution of β-tubulin isotypes in adult cardiac cells. Respiratory measurements were performed to study the role of tubulins in the regulation of oxygen consumption. These results together confirmed the crucial role of cytoskeletal proteins -i.e. tubulins, α-actinin, plectin, desmin, and others- for the normal shape of cardiac cells as well as mitochondrial arrangement and regulation. In addition, in vivo - in situ mitochondrial dynamics were studied by the transfection of GFP-α-actinin, finding that fusion phenomenon does not occur as often as it is believed in healthy adult cardiac cells. / Un élément important de la régulation du métabolisme énergétique des muscles cardiaque et squelettiques est l'interaction des mitochondries avec le cytosquelette. Les mitochondries sont responsables de l'approvisionnement des cellules en énergie, elles sont capables d'ajuster leur activité fonctionnelle en fonction des conditions de stress ou d'autres aspects de la vie. Les mitochondries ont une distribution spécifique selon les tissus. Dans les cardiomyocytes de rats adultes, les mitochondries sont disposées régulièrement dans un entrelacement longitudinal au niveau des bandes A, entre les myofibrilles et dans les limites des sarcomères. En interaction avec le cytosquelette, le sarcomère et le réticulum sarcoplasmique, elles forment des complexes fonctionnels appelés unités énergétiques intracellulaires (ICEUs). Les ICEUs ont des voies spécialisées de transfert d'énergie et de régulation des feedback métaboliques entre les mitochondries et les ATPases, médiée par la CK et l'AK. La structure centrale des ICEUs est l'interactosome mitochondrial (MI) qui confient l'ATP synthasome, la chaîne respiratoire, la créatine kinase mitochondriale et VDAC, qui pourrait être régulé par les tubulines. Le rôle principal du MI est la régulation de la respiration et des flux d'énergie intracellulaires via les réseaux de phosphotransfert. La régulation des ICEUs est liée aux protéines structurales. L'association des mitochondries avec plusieurs protéines du cytosquelette, décrite par plusieurs groupes, a mis en évidence l'importance de la relation structure-fonction dans la régulation métabolique des cardiomyocytes de rats adultes. Pour fournir une meilleure compréhension de ces résultats, le présent travail étudie le mécanisme de contrôle des flux d'énergie et le rôle des relations structure-fonction dans la régulation métabolique de cardiomyocytes de rats adultes. Pour montrer ces associations complexes dans les cellules cardiaques adultes, plusieurs protéines ont été visualisées par microscopie confocale: l'α-actinine et les isoformes des β-tubulines. Pour la première fois, l'existence d'une distribution spécifique des isoformes de β-tubuline dans les cellules cardiaques adultes a été montré. Des mesures respiratoires ont été réalisées pour étudier le rôle des tubulines dans la régulation de la consommation d'oxygène. Ces résultats ont confirmé le rôle déterminant des protéines du cytosquelette -tubulines, α-actinine, plectine, desmine, et autres- pour le maintien de la forme normale des cellules cardiaques, ainsi que de l'arrangement et de la régulation mitochondrial. En outre, la dynamique mitochondriale a été étudiée in vivo et in situ par la transfection de la GFP-α-actinine, ceci permettant la mise en évidence du fait que le phénomène de fusion ne se produit pas aussi souvent qu'on ne le croit pour des cellules cardiaques adultes en bonne santé.

Dans le cœur, l’activation aiguë de la voie AMPc/PKA via la stimulation des récepteurs β-adrénergiques (β-ARs) permet de réguler la contraction cardiaque alors que l’activation chronique de cette voie est délétère, car elle est source de survenue d’arythmies cardiaques et de remodelage hypertrophique du cœur. Au niveau des cardiomyocytes, Il existe principalement deux sous-types de récepteurs β-ARs ; β1- et β2-ARs, qui exercent des effets différents sur la fonction cardiaque.Dans une première partie de ma thèse, je me suis intéressé à l’étude du rôle des récepteurs β1- et β2-ARs dans la régulation différentielle de l’activité PKA cytoplasmique et nucléaire. J’ai ainsi pu montrer que contrairement aux récepteurs β1-ARs qui ont la capacité d’activer la PKA au niveau du cytoplasme et aux noyaux, les récepteurs β2-ARs activent la PKA uniquement au niveau du cytoplasme, et ce indépendamment de la capacité des récepteurs β2-ARs à induire une augmentation des niveaux d’AMPc dans les noyaux. En accord avec ces résultats, les récepteurs β1- mais pas β2-ARs activent le facteur pro-apoptotique régulé par la PKA, ICER.Dans une seconde partie de ma thèse, je me suis intéressé aux différents mécanismes responsables de l’incapacité des récepteurs β2-ARs à activer la PKA au niveau des noyaux. Mes résultats soulignent le rôle de la localisation des récepteurs β2-ARs au niveau des cavéoles, leurs couplage aux protéines Gi, leurs désensibilisation par la GRK2 ainsi que la dégradation de l’AMPc généré par ces récepteurs par la PDE3 et 4 dans la régulation de la signalisation PKA cytoplasmique et pointent vers la PDE4 comme un régulateur central permettant de limiter l’activation de la PKA holoenzyme responsable des réponses PKA nucléaires. Mes résultats montrent également que la mAKAP est un élément clé dans la transduction de la signalisation PKA nucléaire induite par les récepteurs β2-ARs et à un moindre degré, les récepteurs β1-ARs. Dans la dernière partie de ma thèse, j’ai étudié le remodelage de la signalisation PKA nucléaire induite par les récepteurs β1- et β2-ARs au cours de l’insuffisance cardiaque. J’ai ainsi pu montrer qu’en plus de la diminution de la signalisation PKA nucléaire induite par les récepteurs β1-ARs, il existe une signalisation PKA nucléaire de novo induite par les récepteurs β2-ARs dans les cardiomyocytes de rat adulte insuffisants.En conclusion, ce travail a mis à jour une nouvelle différence entre les récepteurs β1- et β2-ARs dans la signalisation PKA au niveau des noyaux des cardiomyocytes de rat adultes, et souligne le rôle important de la PDE4 et de la mAKAP dans la régulation de la signalisation PKA nucléaire induite par les récepteurs β2-ARs. / In the heart, acute activation of the cAMP/PKA pathway upon stimulation of β-adrenoceptors (β-ARs), plays a fundamental role in the regulation of cardiac function, whereas chronic activation of this pathway is deleterious, as it is responsible for cardiac arrhythmias and hypertrophic remodeling of the heart. In cardiac myocytes, there are mainly two subtypes of β-ARs: β1- and β2-ARs, which exert different effects on cardiac function.In the first part of my thesis, my work was focused on understanding the role of β1- and β2-ARs in the differential regulation of cytoplasmic and nuclear PKA activity. Hence, I have showed that unlike β1-ARs which have the capacity to induce the activation of PKA in the cytoplasm and the nucleus, β2-ARs induce the activation of PKA only in the cytoplasmic compartment, regardless of their ability to induce an increase in cAMP in the nuclei. Consistently, β1- but not β2-ARs were able to induce the activation of the pro-apoptotic factor regulated by PKA, ICER.The second aim of my thesis was to decipher the different mechanisms involved in the inability of β2-ARs to activate PKA in the nucleus. I concentrated my efforts on investigating the role of the localization of β2-ARs in caveolae, their coupling to Gi proteins, their desensitization by GRK2 as well as the hydrolysis of cAMP by PDE3 and 4 in the regulation of β2-AR-induced cytoplasmic PKA activity. My results point to PDE4 as a central regulator which limits the activation of the PKA holoenzyme pool involved in the nuclear PKA responses. My results also show that mAKAP is a key component of nuclear PKA signaling induced by β2-ARs and to a lesser extent by β1-ARs. In the last part of my thesis, I have studied the remodeling of nuclear PKA signaling induced by β1- and β2-ARs that occurs during heart failure. I showed that, besides a decrease in β1-AR-induced nuclear PKA signaling, there is a de novo β2-AR-induced nuclear PKA signaling in cardiomyocytes from rat with heart failure.In conclusion, this work uncovers a new difference in PKA signaling between β1- and β2-ARs at the nuclear compartment of adult rat cardiomyocytes and underlines the importance of PDE4 and mAKAP in the regulation of β2-AR-induced nuclear PKA signaling.

An important element of metabolic regulation of cardiac and skeletal muscle energetics is the interaction of mitochondria with cytoskeleton. Mitochondria are in charge of supplying the cells with energy, adjusting its functional activity under conditions of stress or other aspects of life. Mitochondria display a tissue-specific distribution. In adult rat cardiomyocytes, mitochondria are arranged regularly in a longitudinal lattice at the level of A band between the myofibrils and located within the limits of the sarcomeres. In interaction with cytoskeleton, sarcomeres and sarcoplasmic reticulum they form the functional complexes, the intracellular energetic units (ICEUs). The ICEUs have specialized pathways of energy transfer and metabolic feedback regulation between mitochondria and ATPases, mediated by CK and AK. The central structure of ICEUs is the mitochondrial interactosome (MI) containing ATP Synthasome, respiratory chain, mitochondrial creatine kinase and VDAC, regulated by tubulins. The main role of MI is the regulation of respiration and the intracellular energy fluxes via phosophotransfer networks. The regulation of ICEUs is associated with structural proteins. The association of mitochondria with several cytoskeletal proteins described by several groups has brought to light the importance of structure-function relationship in the metabolic regulation of adult rat cardiomyocytes. To purvey a better understanding of these findings, the present work investigated the mechanism of energy fluxes control and the role of structure-function relationship in the metabolic regulation of adult rat cardiomyocytes. To show these complex associations in adult cardiac cells several proteins were visualized by confocal microscopy: α-actinin and β-tubulin isotypes. For the first time, it was showed the existence of the specific distribution of β-tubulin isotypes in adult cardiac cells. Respiratory measurements were performed to study the role of tubulins in the regulation of oxygen consumption. These results together confirmed the crucial role of cytoskeletal proteins -i.e. tubulins, α-actinin, plectin, desmin, and others- for the normal shape of cardiac cells as well as mitochondrial arrangement and regulation. In addition, in vivo - in situ mitochondrial dynamics were studied by the transfection of GFP-α-actinin, finding that fusion phenomenon does not occur as often as it is believed in healthy adult cardiac cells.