Flavonoids are of great interest for their antioxidant and health-promoting activities. Ascorbate (vitamin C) has antioxidant activities but also sometimes displays pro-oxidant activities <i>in vitro</i> and reportedly <i>in vivo</i>. This research investigated to what extent flavonoids moderate oxidative stress from vitamin C <i>in vivo</i>.<p>Dietary experiments were conducted in two phases using adult male Wistar rats. First, all animals were maintained for two weeks on a control flavonoid-free diet with the dietary requirement (27 IU) of vitamin E/kg diet. In the subsequent four weeks, the animals were treated in four groups (8 rats/group), being fed the following diets: flavonoid-free control (C), ascorbate-supplemented (7.55 mmol/kg diet) (A), flavonoid-supplemented (2.67 mmol/kg diet) (F) and flavonoids (2.67 mmol/kg diet) plus ascorbate (7.55 mmol/kg diet)-supplemented (T). Measurements were done on in vivo biomarkers of oxidative stress, tissue antioxidants and on tissue in vitro susceptibility to oxidative stress.<p>In the combined feeding of ascorbate plus flavonoids, endogenous thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) increased in liver by 114%. No effects of dietary ascorbate or flavonoids were seen on endogenous TBARS in brain or heart, or on plasma thiols or erythrocyte fragility.<p><i>In vitro</i>, the susceptibility to TBARS formation of liver homogenate (incubated for 60 min at 37ºC in air) showed a significant 60% increase in ascorbate-fed animals compared to control, but no increase in animals fed ascorbate plus flavonoids, suggesting that the additional feeding of flavonoids helped to prevent the increase produced by ascorbate-feeding. Incubation of liver mitochondria with 300 µM ascorbate in vitro produced a large (2-7 fold) increase in TBARS, but there was no difference among mitochondria from the different feeding groups.<p>The ability of flavonoid-feeding in protecting against oxidative stress from ascorbate in vivo could not be demonstrated in this study, even showing pro-oxidant effects of flavonoids in combination with ascorbate in liver. However, in vitro tests in liver suggest a protective effect of flavonoid-feeding against susceptibility to oxidative stress from ascorbate. Further investigations are needed in order to resolve the differences observed in vitro and in vivo and to determine the endogenous effects of specific flavonoids under ascorbate-induced oxidative stress.

Flavonoids are of great interest for their antioxidant and health-promoting activities. Ascorbate (vitamin C) has antioxidant activities but also sometimes displays pro-oxidant activities <i>in vitro</i> and reportedly <i>in vivo</i>. This research investigated to what extent flavonoids moderate oxidative stress from vitamin C <i>in vivo</i>.<p>Dietary experiments were conducted in two phases using adult male Wistar rats. First, all animals were maintained for two weeks on a control flavonoid-free diet with the dietary requirement (27 IU) of vitamin E/kg diet. In the subsequent four weeks, the animals were treated in four groups (8 rats/group), being fed the following diets: flavonoid-free control (C), ascorbate-supplemented (7.55 mmol/kg diet) (A), flavonoid-supplemented (2.67 mmol/kg diet) (F) and flavonoids (2.67 mmol/kg diet) plus ascorbate (7.55 mmol/kg diet)-supplemented (T). Measurements were done on in vivo biomarkers of oxidative stress, tissue antioxidants and on tissue in vitro susceptibility to oxidative stress.<p>In the combined feeding of ascorbate plus flavonoids, endogenous thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) increased in liver by 114%. No effects of dietary ascorbate or flavonoids were seen on endogenous TBARS in brain or heart, or on plasma thiols or erythrocyte fragility.<p><i>In vitro</i>, the susceptibility to TBARS formation of liver homogenate (incubated for 60 min at 37ºC in air) showed a significant 60% increase in ascorbate-fed animals compared to control, but no increase in animals fed ascorbate plus flavonoids, suggesting that the additional feeding of flavonoids helped to prevent the increase produced by ascorbate-feeding. Incubation of liver mitochondria with 300 µM ascorbate in vitro produced a large (2-7 fold) increase in TBARS, but there was no difference among mitochondria from the different feeding groups.<p>The ability of flavonoid-feeding in protecting against oxidative stress from ascorbate in vivo could not be demonstrated in this study, even showing pro-oxidant effects of flavonoids in combination with ascorbate in liver. However, in vitro tests in liver suggest a protective effect of flavonoid-feeding against susceptibility to oxidative stress from ascorbate. Further investigations are needed in order to resolve the differences observed in vitro and in vivo and to determine the endogenous effects of specific flavonoids under ascorbate-induced oxidative stress.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第24179号 / 理博第4870号 / 新制||理||1697(附属図書館) / 京都大学大学院理学研究科化学専攻 / (主査)准教授 水畑 吉行, 教授 若宮 淳志, 教授 倉田 博基 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM

O uso recreacional e os efeitos deletérios de drogas lícitas e/ou ilícitas é considerado um problema de saúde pública. Dentre estas drogas destaca-se a cetamina, um anestésico empregado na veterinária e o etanol, a droga lícita mais utilizada. Além dos efeitos centrais, estudos revelam que a cetamina e o etanol possuem propriedades imunomodulatórias. No entanto, poucos estudos são realizados com a associação destas drogas; assim, o objetivo deste estudo foi o de avaliar os efeitos tóxicos, imunotóxicos, o potencial oxidativo e os possíveis efeitos neurotóxicos resultantes do consumo associado ou não das mesmas. Para isso, ratos Wistar foram tratados uma vez ao dia, por até 28 dias, com injeções intraperitoneais (15 ou 30mg/kg/PV) de cetamina (K) ou com etanol a 10% (E) via oral (gavagem ou adicionado a água de bebida), ou ainda em associação (KE). O grupo controle recebeu apenas os veículos dos tratamentos. Ao final do experimento, os animais foram submetidos à eutanásia para realização de avaliações toxicológicas, imunológicas, oxidativas e antioxidativas, e de neurotransmissores centrais. Os resultados revelaram redução no ganho de peso dos animais tratados com KE e aumento de ácido ascórbico urinário. A redução de pH e glicose urinária foi observada nos grupos E e KE. Na bioquímica, todos os grupos apresentaram aumento de HDL, porém a associação das drogas levou a um aumento do colesterol, enquanto no grupo K, observou-se diminuição dos triglicérides e da fosfatase alcalina. Ainda, somente o grupo KE apresentou alterações na função renal. Todos os grupos experimentais exibiram alterações histopatológicas hepáticas e/ou vesicais. Os grupos E e KE apresentaram alterações no número de células mieloides e linfoides concomitantes ao aumento na celularidade de medula óssea. Apenas animais do grupo KE apresentaram alteração na resposta do tipo Th2. Foi observado o aumento da peroxidação lipídica nos animais tratados com K, bem como aumento na atividade de GPx e CAT e do conteúdo de GSSG dos animais tratados com E e/ou KE nos órgãos analisados. Ao nível central, observou-se elevação dos níveis de DA e NOR no hipocampo dos animais do grupo E, e 5HT nos animais do grupo K; além de aumento de DA e 5HT no córtex pré-frontal dos animais dos grupos E e K, respectivamente. Assim, concluímos que a associação KE promove redução do ganho de peso não relacionado ao consumo de ração. O etanol, em associação ou não, promove alterações nos parâmetros urinários; a cetamina promove diminuição nos níveis de FA e as drogas quando em associação alteram o perfil lipídico e renal na dependência da dose e do tempo de administração. Efeitos pró-oxidantes entraram em equilíbrio devido à ação de antioxidantes. O etanol, em associação ou não, promove alterações em células do sistema imune, no entanto, sem promover imunomodulação sobre suas respostas. O etanol e/ou a cetamina também promovem alterações histopatológicas hepáticas, enquanto que a associação ainda promove lesões vesicais. Além disso, ambas as drogas promovem alterações no perfil neuroquímico central; porém, quando associadas não promoveram efeitos sinérgicos sobre os parâmetros avaliados. / The recreational use and the deleterious effects of licit and/or illicit drugs are considered a public health issue. Among these drugs are ketamine, used in veterinary anaesthesia, and ethanol the most commonly licit drug. Besides their central effects, studies have shown that ketamine and ethanol have immunomodulatory properties. However, few studies are conducted with the association of both drugs; thus, we aimed to evaluate the toxic and immunotoxic effects, as well the oxidative potential and the possible neurotoxic effects resulted from the consumption of these drugs associated or not. For this, Wistar rats were treated once daily for up to 28 days with intraperitoneal injections (15 or 30mg/kg/BW) of ketamine (K) or orally with 10% ethanol (E) (gavage or drinking water) or the association of both treatments (KE). Control group received only vehicles. At the end of the experimental period, the animals were euthanized for toxicological, immunotoxicological, oxidative stress and antioxidant status evaluation, and central levels of neurotransmitters. KE animals showed reduced body weight gain and increased levels of urinary ascorbic acid. Reduction of urinary pH and glucose was observed in E and KE groups. Biochemistry analysis showed an increase in HDL levels in all experimental groups; although, KE showed an increase in cholesterol levels, while K group exhibited reduction in triglycerides and alkaline phosphatase (ALP) levels. Only KE group showed renal function alterations. All experimental groups showed hepatic and/or bladder histopathology alterations. E and KE groups exhibited alterations in myeloid and lymphoid cells number with concomitant increased in bone marrow cellularity. Only animals of KE group presented changes in Th2 response. Increased in lipid peroxidation was observed in K-treated animals, as well as GPx and CAT activities and GSSG content of animals treated with E and/or KE. We observed elevation in DA and NOR in hippocampus of E group and 5HT in K group, in addition to an increase in DA and 5HT of the prefrontal cortex of E and K groups, respectively. Thus, we conclude that KE association promotes reduction in body weight gain not related to food consumption. Ethanol, in combination or not, promotes urinary alterations; ketamine reduces ALP levels and the drugs, when in combination, alter lipid and renal profile depending on dose and time of administration. Pro-oxidant effects were balanced due to the action of antioxidants. Ethanol, associated or not, promotes alterations on immune cells without immunomodulatoty responses. Ethanol and/or ketamine also promotes liver histopathological alterations, while this association promotes bladder lesions. In addition, both drugs promote changes in central neurochemical levels; however, when associated do not promoted synergistic effects in evaluated parameters.

No início da lactação as vacas podem apresentar várias doenças metabólicas e infecciosas, como a mastite, devido às abruptas mudanças fisiológicas, entre elas a supressão da reposta imune, concomitante com a queda da ingestão de matéria seca e da concentração sérica de vitamina E. Com o objetivo de estudar a influência da suplementação de vitamina E nas atividades funcionais dos neutrófilos do leite de bovinos, catorze novilhas da raça holandesa foram divididas aletoriamente em dois grupos, sendo um com sete animais não suplementados (controle) e outro com sete animais suplementados com 1000 UI/dia de vitamina E durante 30 dias antes do parto previsto e 10 dias após o mesmo. Na primeira semana após o parto foi colhido o leite dos quartos mamários CMT negativo, após estimulação da leucocitose com a infusão intramamária de solução de glicogênio de ostra a 0,1% e 0,5%, 36 e 12 horas respectivamente, antes da colheita do leite. As células foram isoladas, contadas e estimou-se a viabilidade das mesmas. Em seguida foram realizados os testes de fagocitose incubando-se zimosan opsonizado (2x108/ml) com neutrófilos (2x107/ml), contados no microscópio óptico. Suspensões na concentração de 2x108/ml de cepas de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis, Escherichia coli e Prototheca zopfii procedendes de casos de mastite clínica bovina foram incubados com neutrófilos (2x107/ml). A solução foi plaqueada antes da incubação para fagocitose, após a fagocitose, após o tratamento com antibióticos e após a lise dos neutrófilos para a determinação dos patógenos destruídos. As análises estatíscas foram feitas através da ANOVA. A porcentagem de células que englobaram três ou mais partículas de zimosan opsonizado foi de 52% no grupo não suplementado e 66% no grupo suplementado (P<0,05). Não foram detectadas diferenças estatísticas para a porcentagem de fagocitose de microrganismos opsonizados, sendo 30,2% e 28,8% para o grupo controle e suplementado, respectivamente. A destruição intracelular de patógenos foi de 99%, não diferindo entre os grupos. Em seguida, determinou-se a produção de O2- e H2O2, sendo 1,6 e 3,0 nmol de O2- e 0,83 e 0,67 &micro;M de H2O2 para o grupo controle e suplementado, respectivamente. A atividade enzimática no grupo controle e suplementado foi de 4,3 e 3,6 &micro;mol/min/mg proteína para a catalase, 43 e 49 nmol/min/mg de proteína para a glutationa redutase, 16,2 e 30 nmol/min/mg proteína para a glutaiona peroxidase, 3,85 e 6,32 U/mg proteína para a superóxido dismutase e 0,67 e 0,29 U/mg proteína para a mieloperoxidase, sendo que não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos. A suplementação com vitamina E aumentou a habilidade fagocitária dos neutrófilos somente no ensaio com zimosan e não alterou a atividade enzimática assim como a produção de espécies reativas de oxigênio. O equilíbrio entre as espécies reativas de oxigênio, importante para a destruição intracelular de patógenos, e os antioxidantes é extremamente complexo, não sendo afetado pela suplementação de um único agente antioxidante / At the early lactation, lactating cows are more exposed to metabolic and infectious diseases as mastitis, due to the physiological modifications accomplished with diminishing of dry matter ingestion, immune response depressed and the vitamin E plasmatic concentration level reduction. Therefore, to study the influence of vitamin E supplementation on the function of milk neutrophils, fourteen primigravid holstein heifers were casually allocated in two groups: one was oral supplemented with vitamin E (1000UI/day) 30 days pre parturition and 10 days post parturition, the other group did not receive vitamin E supplementation (control group). During the first week post-parturition, milk was collected from negative CMT quarter after induction of leucocytosis with a intramammary infusion of oyster glycogen infusion (0,1% e 0,5%, 36 e 12 hours respectively). The cells were isolated from milk, counted and the viability was estimated. After these trials the assays: phagocytosis with opsonized zymosan and phagocytosis with microorganisms that cause mastitis were performed. zymosan opzonized particles (2x108/mL) were incubated with neutrophils (2x107/mL) and counted on the optic microscope. The microorganisms (2x108/mL) Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis, Escherichia coli and Prototheca zopfii were incubated with neutrophils (2.107/mL) from milk. Solution were spread plated pre phagocytosis assay, after phagocytosis, post treatment with antibiotics and after break of neutrophils. The results were analysed from the statistical ANOVA. For the phagocytosis assays, 52% of neutrophils from control group phagocyted three or more zymosan particles, and in the supplemented group, 66% of the cells (P< 0,05). For the microorganisms, did not have statistical difference and the results were 30.7% and 28.2% for the control and supplemented groups. The average of the pathogens intracellular kill was 99% in the both groups. In sequence the tests for production O2- and H2O2, enzimatic activity of catalase, superoxide dismutase, glutathione redutase, glutathione peroxidase and myeloperoxidase were made. It were no detected any statiscal differences in respect to the production of O2- and H2O2. The production of O2- was 1,6 nmol and 3,0 nmol and the H2O2 production was 0,83 &micro;M and 0,67 &micro;M for the groups control and supplemented. The control and supplemented group enzymatic activity results obtained were: catalase 4.3 and 3.6 &micro;mol/min/mg protein, glutathione redutase 43 and 49 nmol/min/mg protein, glutathione peroxidase 16.2 and 30 nmol/min/mg protein, superoxide dismuthase 3.85 and 6.32 U/mg protein and myeloperoxidase 0,67 and 0,29 U/mg protein. In relation to these results it was not detected any statistical difference. Vitamin E supplementation increased zymosan phagocytosis and did not affect enzyme activities involved in the mechanisms of protection against oxigen reactive species and microorganism phagocytosis in the neutrophils. The vitamin E supplementation didn´t change the complex balance among the reactions of antioxidants and oxigen reactive species. It can be concluded that due to the complexity of the mechanisms involved the supplementation with just one isolate antioxidant did not interfered with the defence neutrophil activities

O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antioxidante de extrato de folhas de oliveira (EFO) (Olea europaea L.) por diferentes metodologias analíticas in vitro e in situ, para verificação de efeito em sistemas biológicos. O extrato foi obtido a partir de folhas secas de oliveira, previamente micronizadas, em metanol/água (80/20%) na proporção 1:20 (m/v), após remoção de compostos solúveis em n-hexano. Após liofilização, no EFO foi avaliado o poder redutor por Folin-Ciocalteau, conteúdo de flavonoides totais, teor de oleuropeina, poder de redução do íon férrico (FRAP) e atividade antioxidante sobre DPPHo, ABTSo+, ânion superóxido (O2o-), ácido hipocloroso (HOCl) e óxido nítrico (NOo). O extrato foi também avaliado quanto ao efeito protetor sobre danos oxidativos em eritrócitos humanos. O ácido ascórbico foi utilizado como referência. O experimento foi repetido seis vezes (n = 6) e os ensaios realizados em duplicata. O poder redutor do extrato e o conteúdo de flavonoides totais e oleuropeína foram 131,7 ± 9,4 mg equivalente de ácido gálico/g extrato seco (ms), 19,4 ± 1,3 mg equivalente de quercetina/g ms e 25,5 ± 5,2 mg oleuropeína/g ms, respectivamente. O ensaio de FRAP apresentou 281,8 ± 22,8 mg equivalente de trolox/g ms. O EFO foi efetivo na inibição dos radicais DPPHo e ABTSo+, dependente da concentração de extrato, com valores de IC50 de 13,8 ± 0,8 e 16,1 ± 1,2 &micro;g/mL, respectivamente. Com relação à atividade antioxidante sobre espécies reativas de importância biológica, o EFO apresentou forte capacidade de inibição de O2o- (IC50 = 52,6 ± 2,1 &micro;g/mL) e NOo (IC50 = 48,4 ± 6,8 &micro;g/mL), quando comparado ao ácido ascórbico. Porém, a inibição de HOCl não foi tão eficiente (IC50 = 714,1 ± 31,4 &micro;g/mL). O EFO inibiu a hemólise induzida em eritrócitos de maneira dependente da concentração (IC50 = 7,8 ± 1,1 &micro;g/mL), assim como a peroxidação lipídica e a formação de meta-hemoglobina, com valores de IC50 de 38,0 ± 11,7 e 186,3 ± 29,7 &micro;g/mL, respectivamente. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que extrato de folhas de oliveira possui efetiva atividade antioxidante em sistemas biológicos, pelo efeito sequestrador de determinadas espécies reativas que participam dos processos bioquímicos, e pela prevenção de danos oxidativos em eritrócitos humanos. Portanto, sua ingestão pode estar relacionada com a prevenção de estresse oxidativo in vivo, com consequentes benefícios à saúde. / The aim of this study was to evaluate the antioxidant activity of olive leaf extract (OLE) (Olea europaea L.) by different in vitro and in situ analytical methodologies for determination of its effect in biological systems. The extract was obtained from dried olive leaves, previously micronized, in methanol/water (80/20%) in ratio 1:20 (w/v), after removal of n-hexane soluble compounds. After lyophilization, OLE was analyzed for reducing power by Folin-Ciocalteau, total flavonoid content, oleuropein content, ferric reducing antioxidant power (FRAP) and antioxidant activity against DPPHo, ABTSo+, superoxide anion (O2o-), hypochlorous acid (HOCl), and nitric oxide (NOo). The extract was also analyzed against oxidative damage in human erythrocytes. Ascorbic acid was used as reference. The experiment was repeated six times (n = 6) and the assays were performed in duplicate. The reducing power and total flavonoid and oleuropein contents of extract were 131.7 ± 9.4 mg galic acid equivalent/g dry extract (dw), 19.4 ± 1.3 mg quercetin equivalent/g dw, and 25.5 ± 5.2 mg oleuropein/g dw, respectively. The FRAP assay was 281.8 ± 22.8 mg trolox equivalent/g dw. The OLE was effective in inhibition of DPPHo and ABTSo+ radicals, in a concentration dependent manner, with IC50 values of 13.8 ± 0.8 and 16.1 ± 1.2 &micro;g/mL, respectively. In relation to the antioxidant activity against reactive species of biological importance, the OLE showed high ability to inhibit O2o- (IC50 = 52.6 ± 2.1 &micro;g/mL) and NOo (IC50 = 48.4 ± 6.8 &micro;g/mL), when compared to ascorbic acid. However, inhibition of HOCl was not as efficient (IC50 = 714.1 ± 31.4 &micro;g/mL). The OLE inhibited induced erythrocyte hemolysis in a concentration dependent manner (IC50 = 7.8 ± 1.1 &micro;g/mL) as well as lipid peroxidation and the formation of methemoglobin, with IC50 values of 38.0 ± 11.7 and 186.3 ± 29.7 &micro;g/mL, respectively. The results suggest that olive leaf extract has effective antioxidant activity in biological systems, based on its scavenging effect of certain reactive species that participate in biochemical processes, and the prevention of oxidative damage in human erythrocytes. So, the intake of olive leaf extract may be related to the prevention of in vivo oxidative stress, with health benefits.

O uso recreacional e os efeitos deletérios de drogas lícitas e/ou ilícitas é considerado um problema de saúde pública. Dentre estas drogas destaca-se a cetamina, um anestésico empregado na veterinária e o etanol, a droga lícita mais utilizada. Além dos efeitos centrais, estudos revelam que a cetamina e o etanol possuem propriedades imunomodulatórias. No entanto, poucos estudos são realizados com a associação destas drogas; assim, o objetivo deste estudo foi o de avaliar os efeitos tóxicos, imunotóxicos, o potencial oxidativo e os possíveis efeitos neurotóxicos resultantes do consumo associado ou não das mesmas. Para isso, ratos Wistar foram tratados uma vez ao dia, por até 28 dias, com injeções intraperitoneais (15 ou 30mg/kg/PV) de cetamina (K) ou com etanol a 10% (E) via oral (gavagem ou adicionado a água de bebida), ou ainda em associação (KE). O grupo controle recebeu apenas os veículos dos tratamentos. Ao final do experimento, os animais foram submetidos à eutanásia para realização de avaliações toxicológicas, imunológicas, oxidativas e antioxidativas, e de neurotransmissores centrais. Os resultados revelaram redução no ganho de peso dos animais tratados com KE e aumento de ácido ascórbico urinário. A redução de pH e glicose urinária foi observada nos grupos E e KE. Na bioquímica, todos os grupos apresentaram aumento de HDL, porém a associação das drogas levou a um aumento do colesterol, enquanto no grupo K, observou-se diminuição dos triglicérides e da fosfatase alcalina. Ainda, somente o grupo KE apresentou alterações na função renal. Todos os grupos experimentais exibiram alterações histopatológicas hepáticas e/ou vesicais. Os grupos E e KE apresentaram alterações no número de células mieloides e linfoides concomitantes ao aumento na celularidade de medula óssea. Apenas animais do grupo KE apresentaram alteração na resposta do tipo Th2. Foi observado o aumento da peroxidação lipídica nos animais tratados com K, bem como aumento na atividade de GPx e CAT e do conteúdo de GSSG dos animais tratados com E e/ou KE nos órgãos analisados. Ao nível central, observou-se elevação dos níveis de DA e NOR no hipocampo dos animais do grupo E, e 5HT nos animais do grupo K; além de aumento de DA e 5HT no córtex pré-frontal dos animais dos grupos E e K, respectivamente. Assim, concluímos que a associação KE promove redução do ganho de peso não relacionado ao consumo de ração. O etanol, em associação ou não, promove alterações nos parâmetros urinários; a cetamina promove diminuição nos níveis de FA e as drogas quando em associação alteram o perfil lipídico e renal na dependência da dose e do tempo de administração. Efeitos pró-oxidantes entraram em equilíbrio devido à ação de antioxidantes. O etanol, em associação ou não, promove alterações em células do sistema imune, no entanto, sem promover imunomodulação sobre suas respostas. O etanol e/ou a cetamina também promovem alterações histopatológicas hepáticas, enquanto que a associação ainda promove lesões vesicais. Além disso, ambas as drogas promovem alterações no perfil neuroquímico central; porém, quando associadas não promoveram efeitos sinérgicos sobre os parâmetros avaliados. / The recreational use and the deleterious effects of licit and/or illicit drugs are considered a public health issue. Among these drugs are ketamine, used in veterinary anaesthesia, and ethanol the most commonly licit drug. Besides their central effects, studies have shown that ketamine and ethanol have immunomodulatory properties. However, few studies are conducted with the association of both drugs; thus, we aimed to evaluate the toxic and immunotoxic effects, as well the oxidative potential and the possible neurotoxic effects resulted from the consumption of these drugs associated or not. For this, Wistar rats were treated once daily for up to 28 days with intraperitoneal injections (15 or 30mg/kg/BW) of ketamine (K) or orally with 10% ethanol (E) (gavage or drinking water) or the association of both treatments (KE). Control group received only vehicles. At the end of the experimental period, the animals were euthanized for toxicological, immunotoxicological, oxidative stress and antioxidant status evaluation, and central levels of neurotransmitters. KE animals showed reduced body weight gain and increased levels of urinary ascorbic acid. Reduction of urinary pH and glucose was observed in E and KE groups. Biochemistry analysis showed an increase in HDL levels in all experimental groups; although, KE showed an increase in cholesterol levels, while K group exhibited reduction in triglycerides and alkaline phosphatase (ALP) levels. Only KE group showed renal function alterations. All experimental groups showed hepatic and/or bladder histopathology alterations. E and KE groups exhibited alterations in myeloid and lymphoid cells number with concomitant increased in bone marrow cellularity. Only animals of KE group presented changes in Th2 response. Increased in lipid peroxidation was observed in K-treated animals, as well as GPx and CAT activities and GSSG content of animals treated with E and/or KE. We observed elevation in DA and NOR in hippocampus of E group and 5HT in K group, in addition to an increase in DA and 5HT of the prefrontal cortex of E and K groups, respectively. Thus, we conclude that KE association promotes reduction in body weight gain not related to food consumption. Ethanol, in combination or not, promotes urinary alterations; ketamine reduces ALP levels and the drugs, when in combination, alter lipid and renal profile depending on dose and time of administration. Pro-oxidant effects were balanced due to the action of antioxidants. Ethanol, associated or not, promotes alterations on immune cells without immunomodulatoty responses. Ethanol and/or ketamine also promotes liver histopathological alterations, while this association promotes bladder lesions. In addition, both drugs promote changes in central neurochemical levels; however, when associated do not promoted synergistic effects in evaluated parameters.

A fotoquimioterapia (FQT) é uma técnica de tratamento de doenças graves, inclusive o câncer, que utiliza que utiliza compostos que, sendo introduzidos dentro de um organismo, não possuem alguma atividade contra ele e quando são excitados, através de luz na região espectral de 320 até 800 nm, produzem espécies reativas que induzem a morte celular. Dentre as formas desenvolvidas em FQT, a de maior destaque, e a que vem sendo mais utilizada em clínica, é a Terapia Fotodinâmica (TFD). Apesar das vantagens do uso da TFD, esta técnica possui limitações em sua eficiência, pois seu mecanismo está associado com à formação dos estados excitados do FS e do oxigênio molecular e, por isso, depende dos tempos de vida e rendimentos quânticos destes estados. Outro fator que limita a ampla aplicação da FQT na clínica é o alto custo dos FS utilizados atualmente. No grupo de fotobiofísica do Departamento de Física e Matemática da FCLRP-USP, tem-se trabalhado na busca de novos FS que possuam espécies reativas não excitados como, por exemplo, os radicais livres (peróxidos, ânion superóxido, radical hidroxila etc.), e que sejam mais viáveis economicamente em relação a outros FS já existentes no mercado. Os derivados de nitrofurano são fármacos já utilizados na rotina clínica que possuem as características promissoras para aplicação em FQT. Este trabalho dá continuidade à busca de novos FS. Escolhemos dentre inúmeros derivados de nitrofurano a Nitrofurantoína (NFT), que já é utilizada em clínica desde 1950, e que possui um custo baixo. Sua atividade fototóxica já foi documentada como reações fotoalérgicas em pacientes depois de ser administrada e nos estudos in vitro contra diversas linhagens das células neoplásicas. Contudo, os mecanismos e a dinâmica da fotoação da NFT não estavam ainda bem estabelecidas. Como objetivos gerais deste trabalho, definimos estudar a dinâmica da fotodecomposição da NFT e a liberação de radical NO em soluções aquosas, em função da composição do ambiente, tendo em vista analisar sua potencialidade para aplicação em fotoquimioterapia de diversas doenças, inclusive o câncer. Demonstramos que durante a sua fototransformação, a NFT libera o NO, e o rendimento do processo depende do estado de protonação da NFT. A liberação de NO se realiza por duas vias paralelas: liberação direta pela molécula de NFT e através da fotólise do seu fotoproduto. O estado tripleto da NFT apresenta tempo de vida (t) muito curto, provavelmente devido à participação ativa em formação de um dos fotoprodutos. Pelo fato de ser muito curto, é pouco provável que o estado T1 produza efetivamente, o oxigênio singleto. Assim, podemos associar a fotoatividade da NFT com a liberação de NO. Por fim, propusemos um esquema para a fotoliberação de NO pela fototransformação da NFT. / Photochemotherapy (PCT) is a technique applied in the treatment of serious diseases. For example in cancer, the PCT uses compounds that are introduced into an organism that do not have some activity against him, and that when are excited with light, in the spectral region from 320 to 800 nm, produces reactive species that induce the cell death. The photodynamic therapy (PDT) is the most widely used PCTtechnique in clinical applications. Despite the advantages of the use of PDT, this technique has efficiency limitations, because the PDT mechanism is associated with the formation of excited states in photosensitizer (PS) and in molecular oxygen and therefore, depends on the lifetimes and quantum yields of these states. Another limiting factor of the PDT in more PCT clinical applications is the high cost of the PS used today. The photo-biophysic group of the Department of Physics and Mathematics of the FFCLRP-USP has been working on searching of new PS without reactive species with exited states and cheaper than others PS on the market. For example, our group has investigated the free radicals: peroxide, superoxide anion, hydroxyl radical. This work continues the search for new PS. We chose the Nitrofurantoin (NFT), a nitrofuran derivative, which it is used in clinical applications since 1950 and have a low cost. The nitrofuran derivatives are drugs used in clinical applications with promising characteristics for applications in PCT. The photo-toxic activity of the NFT has been observed in photo-allergic reactions of patients and in vitro studies of several neoplastic cell lines. However, the NFT photo- action mechanisms and kinetics are not well established. The objective of this work was the study of the photo-decomposition dynamics of the NFT and the delivery of the NO radical in aqueous solutions depending on the composition of the environment, aiming to analyze its potential for application in PCT of several diseases, including cancer. In this work we demonstrated that during the photo-transformation, the NFT delivery NO and the yield of this process depends on the protonation state of the NFT. We observed that the NO delivery is made of two parallels ways: a direct delivery by NFT molecule and a delivery by photolysis of their photo-products. Probably due to the active participation in the photo-products formation we observed that the triplet state of NFT has very short lifetime (T) and therefore, it is not expected that the state T1 produces singlet oxygen. Thus, we can associate the NFT photo-activity with the NO delivery. Finally, this work proposes a scheme for NO photo-delivery using the NFT photo-transformation.

No início da lactação as vacas podem apresentar várias doenças metabólicas e infecciosas, como a mastite, devido às abruptas mudanças fisiológicas, entre elas a supressão da reposta imune, concomitante com a queda da ingestão de matéria seca e da concentração sérica de vitamina E. Com o objetivo de estudar a influência da suplementação de vitamina E nas atividades funcionais dos neutrófilos do leite de bovinos, catorze novilhas da raça holandesa foram divididas aletoriamente em dois grupos, sendo um com sete animais não suplementados (controle) e outro com sete animais suplementados com 1000 UI/dia de vitamina E durante 30 dias antes do parto previsto e 10 dias após o mesmo. Na primeira semana após o parto foi colhido o leite dos quartos mamários CMT negativo, após estimulação da leucocitose com a infusão intramamária de solução de glicogênio de ostra a 0,1% e 0,5%, 36 e 12 horas respectivamente, antes da colheita do leite. As células foram isoladas, contadas e estimou-se a viabilidade das mesmas. Em seguida foram realizados os testes de fagocitose incubando-se zimosan opsonizado (2x108/ml) com neutrófilos (2x107/ml), contados no microscópio óptico. Suspensões na concentração de 2x108/ml de cepas de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis, Escherichia coli e Prototheca zopfii procedendes de casos de mastite clínica bovina foram incubados com neutrófilos (2x107/ml). A solução foi plaqueada antes da incubação para fagocitose, após a fagocitose, após o tratamento com antibióticos e após a lise dos neutrófilos para a determinação dos patógenos destruídos. As análises estatíscas foram feitas através da ANOVA. A porcentagem de células que englobaram três ou mais partículas de zimosan opsonizado foi de 52% no grupo não suplementado e 66% no grupo suplementado (P<0,05). Não foram detectadas diferenças estatísticas para a porcentagem de fagocitose de microrganismos opsonizados, sendo 30,2% e 28,8% para o grupo controle e suplementado, respectivamente. A destruição intracelular de patógenos foi de 99%, não diferindo entre os grupos. Em seguida, determinou-se a produção de O2- e H2O2, sendo 1,6 e 3,0 nmol de O2- e 0,83 e 0,67 &micro;M de H2O2 para o grupo controle e suplementado, respectivamente. A atividade enzimática no grupo controle e suplementado foi de 4,3 e 3,6 &micro;mol/min/mg proteína para a catalase, 43 e 49 nmol/min/mg de proteína para a glutationa redutase, 16,2 e 30 nmol/min/mg proteína para a glutaiona peroxidase, 3,85 e 6,32 U/mg proteína para a superóxido dismutase e 0,67 e 0,29 U/mg proteína para a mieloperoxidase, sendo que não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos. A suplementação com vitamina E aumentou a habilidade fagocitária dos neutrófilos somente no ensaio com zimosan e não alterou a atividade enzimática assim como a produção de espécies reativas de oxigênio. O equilíbrio entre as espécies reativas de oxigênio, importante para a destruição intracelular de patógenos, e os antioxidantes é extremamente complexo, não sendo afetado pela suplementação de um único agente antioxidante / At the early lactation, lactating cows are more exposed to metabolic and infectious diseases as mastitis, due to the physiological modifications accomplished with diminishing of dry matter ingestion, immune response depressed and the vitamin E plasmatic concentration level reduction. Therefore, to study the influence of vitamin E supplementation on the function of milk neutrophils, fourteen primigravid holstein heifers were casually allocated in two groups: one was oral supplemented with vitamin E (1000UI/day) 30 days pre parturition and 10 days post parturition, the other group did not receive vitamin E supplementation (control group). During the first week post-parturition, milk was collected from negative CMT quarter after induction of leucocytosis with a intramammary infusion of oyster glycogen infusion (0,1% e 0,5%, 36 e 12 hours respectively). The cells were isolated from milk, counted and the viability was estimated. After these trials the assays: phagocytosis with opsonized zymosan and phagocytosis with microorganisms that cause mastitis were performed. zymosan opzonized particles (2x108/mL) were incubated with neutrophils (2x107/mL) and counted on the optic microscope. The microorganisms (2x108/mL) Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis, Escherichia coli and Prototheca zopfii were incubated with neutrophils (2.107/mL) from milk. Solution were spread plated pre phagocytosis assay, after phagocytosis, post treatment with antibiotics and after break of neutrophils. The results were analysed from the statistical ANOVA. For the phagocytosis assays, 52% of neutrophils from control group phagocyted three or more zymosan particles, and in the supplemented group, 66% of the cells (P< 0,05). For the microorganisms, did not have statistical difference and the results were 30.7% and 28.2% for the control and supplemented groups. The average of the pathogens intracellular kill was 99% in the both groups. In sequence the tests for production O2- and H2O2, enzimatic activity of catalase, superoxide dismutase, glutathione redutase, glutathione peroxidase and myeloperoxidase were made. It were no detected any statiscal differences in respect to the production of O2- and H2O2. The production of O2- was 1,6 nmol and 3,0 nmol and the H2O2 production was 0,83 &micro;M and 0,67 &micro;M for the groups control and supplemented. The control and supplemented group enzymatic activity results obtained were: catalase 4.3 and 3.6 &micro;mol/min/mg protein, glutathione redutase 43 and 49 nmol/min/mg protein, glutathione peroxidase 16.2 and 30 nmol/min/mg protein, superoxide dismuthase 3.85 and 6.32 U/mg protein and myeloperoxidase 0,67 and 0,29 U/mg protein. In relation to these results it was not detected any statistical difference. Vitamin E supplementation increased zymosan phagocytosis and did not affect enzyme activities involved in the mechanisms of protection against oxigen reactive species and microorganism phagocytosis in the neutrophils. The vitamin E supplementation didn´t change the complex balance among the reactions of antioxidants and oxigen reactive species. It can be concluded that due to the complexity of the mechanisms involved the supplementation with just one isolate antioxidant did not interfered with the defence neutrophil activities

A compreensão da fisiologia e dos mecanismos moleculares da sepse tem sido foco de muitos estudos. As infecções severas, como a sepse, são responsáveis por 10% do total de mortes registradas em Unidades de Tratamento Intensivo em todo o mundo. O desfecho da sepse ocorre devido a influência de fatores ambientais e genéticos, cuja expressão de variantes genéticas suportam ou não este desfecho. Muitos mecanismos estão envolvidos na sepse, incluindo a liberação de citocinas e a ativação de neutrófilos, de monócitos e de células endoteliais. Há associação entre superprodução de óxido nítrico, produção excessiva de radicais livres, depleção de antioxidantes, e déficit energético celular. Enzimas antioxidantes endógenas como a Superóxido Dismutase, a Glutationa Peroxidase e a Catalase protegem a célula do dano oxidativo. A enzima superóxido dismutase dependente de manganês é um potente antioxidante intracelular codificada por um gene (SOD2; 6q25-2) que tem sua expressão induzida por mediadores inflamatórios tais como interleucina 1, interleucina 4, interleucina 6, Fator de Necrose Tumoral – α, lipopolisacarídeos. O gene SOD2 apresenta um polimorfismo de mutação de base C47T no exon 2, o qual resulta na substituição do resíduo 16 (Ala16Val) pertencente ao peptídeo sinal da proteína. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito diferencial das variantes - 9Ala e -9Val da superóxido dismutase dependente de manganês sobre as células mononucleares de sangue periférico humano (in vitro) durante um processo infeccioso (induzido por lipopolisacarídeos), investigando sua implicação: (I) na produção de Espécies Reativas; (II) na atividade e imuno-conteúdo da Superóxido Dismutase dependente de Manganês; (III) na atividade e imuno- conteúdo da Catalase; (IV) na atividade e imunoconteúdo da Glutationa Peroxidase; (V) na produção de nitrotirosina; (VI) na produção de nitrito/nitrato; (VII) na liberação de Fator de Necrose Tumoral - α; (VIII) na produção de Carboximetil-lisina; (IX) dienos conjugados; (X) no imuno-conteúdo da Poli (ADP ribose) Polimerase; (XI) no imuno-conteúdo do Receptor de Produtos Avançados de Glicação; (XII) no imuno-conteúdo da Proteína de Choque Térmico; (XIII) no imuno-conteúdo do Fator Nuclear κB; (XIV) no dano ao DNA celular; (XV) na determinação das defesas antioxidantes totais não enzimáticas. Os resultados demonstraram que o polimorfismo Ala-9Val participa na regulação do ambiente redox celular, e que o alelo 47C permite que as células no estado basal (sem lipopolisacarídeos) respondam com mais eficiência ao estresse oxidativo celular. Este alelo apesar de produzir mais espécies reativas também aumenta o mecanismo de defesa antioxidante. Porém, quando em uma doença que produza estresse oxidativo, no caso a sepse, o alelo 47C torna o ambiente intracelular pró-oxidativo podendo agravar a condição celular. Em suma, os dados aqui apresentados sugerem que o polimorfismo Ala-9Val é um alvo promissor para novos estudos com o objetivo de usar marcadores genéticos para direcionar a terapia necessária para cada paciente. / The understanding of the physiology and of molecular mechanisms of sepsis has been focus of many studies. The severe infections, as the sepsis, are responsible for 10% of total of deaths registered in Intensive Care Units all over the world. The outcome of sepsis happens due to influence of environmental and genetic factors, whose the expression of genetic variants supports or not this outcome. Many mechanisms are involved in sepsis, including the cytokines liberation and the neutrophils activation, of monocytes and of endothelial cells. There is association among overproduction of nitric oxide, excessive production of free radicals, depletion of antioxidants, and cellular energy deficit. Endogenous antioxidant enzymes as Superoxide Dismutase, Glutathione Peroxidase and Catalase protect the cell of oxidative damage. The manganese superoxide dismutase enzyme it is a potent antioxidant intracellular codified by a gene (SOD2; 6q25-2) that has her expression induced by the inflammatory mediators such as interleukin 1, interleukin 4, interleukin 6, tumor necrosis factor – α, lipopolysaccharide. The SOD2 gene presents a single-nucleotide polymorphism C47T in the exon 2, which results in the substitution of the residue 16 (Ala16 Val) belonging to the signal peptide of the protein. The aim of this work was to study the differential effect of the variants -9Ala and -9Val of manganese superoxide dismutase on the Peripheral Blood Mononuclears Cells human (in vitro) during an infectious process (induced by lipopolysaccharide), investigating her implication: (I) in the production of Reactive Species; (II) in the activity and immunocontent of Manganese Superoxide Dismutase; (III) in the activity and immunocontent of Catalase; (IV) in the activity and immunocontent of Glutathione Peroxidase; (V) in the nitrotyrosine production; (VI) in the nitrite/nitrate production; (VII) in the production of tumor necrosis factor - α; (VIII) in the production of carboxymethyl lysine; (IX) conjugated dienos; (X) in the immunocontent of the Poly (ADP-ribose) Polymerase; (XI) in the immunocontent of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts; (XII) in the immunocontent of Heat Shock Protein; (XIII) in the immunocontent of the Nuclear Factor kappa B; (XIV) in the damage to cellular DNA; (XV) in the determination of the non-enzymatic antioxidant cellular defenses. The results demonstrated that the polymorphism Ala-9Val it participates in the regulation of the cellular redox environment, and that the 47C allele allows that the cells in the basal state (without lipopolysaccharide) they answer with more efficiency to the stress oxidative cellular. This allele in spite of producing more RS also increases the mechanism of antioxidant defense. However when in a disease that produces oxidative stress, in the case the sepsis, the 47C allele turns intracellular environmental pro-oxidative could worsen the cellular condition. In summary, the data presented here suggest that the polymorphism Ala- 9Val is a promising target for new studies with the goal of using genetic markers to guide therapy required for each patient.