CAVALCANTI, Bruno Coêlho. Avaliação in vitro do potencial citotóxico de derivados arilaminados nor-ß-lapachônicos : estudos de mecanismo de ação. 2010. 171 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-05-24T15:59:29Z No. of bitstreams: 1 2010_tese_bccavalcanti.pdf: 2020949 bytes, checksum: c9344957598760434a28f59fbd863a7a (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-05-30T14:17:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_tese_bccavalcanti.pdf: 2020949 bytes, checksum: c9344957598760434a28f59fbd863a7a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-30T14:17:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_tese_bccavalcanti.pdf: 2020949 bytes, checksum: c9344957598760434a28f59fbd863a7a (MD5) Previous issue date: 2010 / The search for new cytotoxic derivatives of nor-β-lapachone is part of a growing and continuous search for new active compounds. The present study aimed to evaluate the cytotoxic potential of four arylamino-nor-β-lapachone derivatives (1-4) and the probable mechanism involved in the cytotoxicity of these compounds. Among the tested derivatives, only three of them (1, 3 and 4) and the precursor molecule elicited a significant antiproliferative effects in all human tumor cell lines used in the study. In experiments with peripheral blood mononuclear cells (PBMC), nor-β-lapachone did not induce cytotoxicity, however its derivatives showed antiproliferative effects whose intensity ranged from moderate to weak, with IC50 values equal to 5.02 µM (1), 12.02 µM (3) and 10.65 µM (4). Moreover, all the compounds showed no hemolytic effects (EC50> 219.29 µM). Nor-β-lapachone and its derivatives (1, 3 and 4) induced apoptosis (mitochondrial pathway) in HL-60 cells, based upon morphological and flow cytometric analysis, and interference on HL-60 cell cycle progression, only at the highest concentration (4 µM). Compounds exposure induced intracellular ROS generation, as well as DNA strand breaks in HL-60 (NQO1−) and DU-145 (NQO1+) cell lines. The co-administration of GSH reduced the cellular sensibility to the toxic effects of the studied compounds. Unlike cells pre-treated with BH (glutathione depletor agent), cells pre-exposed to antioxidants agents (NAC or KI) showed low production of free radicals. On the other hand, dicoumarol (NQO1 inhibitor) prevented the ROS formation and DNA strand breaks only in DU-145 cells, indicating that these compounds can be metabolized by other reductases than NQO1. The DNA damage induced by nor-β-lapachone and its derivatives (1, 3 and 4) in DU-145 cells were partially repaired after 24 h, which agrees with the data of unscheduled DNA synthesis. In addition, all active compounds interfere with DNA repair processes of DNA damage induced by MMS, indicating that this action contributes to compounds cytotoxic effects. All active compounds inhibited the proliferation rate of S. cerevisiae strains defective in the expression of DNA topoisomerases (Top1Δ, Top3Δ and Top1ΔTop3Δ) more pronounced than that observed in wild type strain (BY4741), suggesting that the interference on topoisomerases activities may contributes to the cytotoxicity of active compounds. Genotoxicity and mutagenicity studies with Chinese hamster lung fibroblast cell line (V79), showed that all cytotoxic compounds promoted DNA strand breaks, DNA bases oxidation and micronucleus formation in a concentration (10 µM) far higher than needed to induce the same events in tumor cells. Strengthening the ROS contribution on the mutagenic events, the pre-treatment with NAC prevented the formation of micronucleated cells and reduced the V79 cell sensibility to the cytotoxic effects of the studied compounds. These findings underscore the antitumor properties of nor-β-lapachone and its arylamino derivatives and they can be considered as prototypes for the development of new anticancer agents. / A busca por novos derivados citotóxicos da nor-β-lapachona é parte de uma crescente e contínua busca por novos compostos ativos. O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial citotóxico de quatro derivados arilaminos (1-4) da nor-β-lapachona e os prováveis mecanismos envolvidos na citotoxicidade da nor-β-lapachona e de seus derivados. Três derivados (1, 3 e 4) e seu precursor apresentaram elevado potencial citotóxico sobre todas as linhagens celulares tumorais humanas utilizadas. Em estudos com células não tumorais (CMSP), a nor-β-lapachona não induziu citotoxicidade, porém seus derivados apresentaram efeitos antiproliferativos, cuja intensidade variou de moderado a fraco com valores de CI50 iguais a 5,02 µM (1), 12,02 µM (3) e 10,65 µM (4). Além disso, os compostos não apresentaram efeitos hemolíticos (EC50 > 219,29 µM). Tanto a nor-β-lapachona quanto seus derivados (1, 3 e 4) induziram apoptose (via mitocondrial) em células HL-60, como observado através dos ensaios de análises morfológicas e de citometria de fluxo, e distúrbios sobre a progressão do ciclo celular de células HL-60, apenas na maior concentração (4 µM). O tratamento com os compostos induziu a formação de EROS, assim como quebras das fitas da molécula de DNA em células HL-60 (NQO1−) e DU-145 (NQO1+). A co-administração de GSH reduziu a sensibilidade celular aos efeitos tóxicos dos compostos estudados, e o pré-tratamento com agentes antioxidantes (NAC e IK) reduziu drasticamente a produção de radicais livres, o mesmo não ocorrendo com culturas pré-tratadas com BH (agente depletor de GSH). Porém, o dicumarol (inibidor de NQO1) preveniu a formação de EROS e os efeitos genotóxicos apenas na linhagem DU-145, indicando que esses compostos possam ser metabolizados por outras redutases que não a NQO1. As lesões ao DNA de células DU-145 promovidas pela nor-β-lapachona e seus derivados (1, 3 e 4) foram, parcialmente, reparadas após um período de tempo de 24 horas, o que corrobora com a síntese não programada de DNA detectada após a exposição a esses compostos. Além disso, todos os compostos ativos interferiram sobre os processos de reparo dos danos ao DNA induzidos pelo MMS, o que indica que a interferência sobre esses processos contribui para seus efeitos citotóxicos. A nor-β-lapachona e seus derivados arilaminos (1, 3 e 4) inibiram a taxa de proliferação de cepas de S. cerevisiae defectivas na expressão de topoisomerases (Top1Δ, Top3Δ e Top1ΔTop3Δ) de maneira mais pronunciada do que observado na cepa selvagem (BY4741), indicando que a interferência sobre a atividade das topoisomerases influencia, de algum modo, a citotoxicidade desses compostos. Nos estudos de genotoxicidade e mutagenicidade com fibroblastos de pulmão de hamster chinês (linhagem V79), todos os compostos citotóxicos promoveram quebras nas fitas de DNA, oxidação de bases nitrogenadas e indução de micronúcleos, em concentração (10 µM) muito superior do que as necessárias para induzir os mesmos eventos em células tumorais. Reforçando a participação de EROS sobre os eventos mutagênicos, o pré-tratamento com NAC preveniu a formação de células micronucleadas e reduziu a sensibilidade celular aos efeitos tóxicos dos compostos estudados. Esses resultados ressaltam as propriedades antitumorais da nor-β-lapachona e seus derivados arilaminos e que eles podem ser considerados como protótipos para o desenvolvimento de novos agentes anticâncer.

A taurina (ácido 2-aminoetanosulfônico) é um β-aminoácido não utilizado para a síntese protéica, encontrada livremente no liquido intracelular e um dos aminoácidos livres mais abundantes nos leucócitos, cérebro, músculo esquelético, retina e coração, tendo um papel essencial em diversos processos biológicos. As propriedades antioxidantes da taurina já foram estudadas e testadas, no entanto, a maior parte dos estudos feitos até hoje utilizou concentrações menores do que as fisiológicas. O objetivo deste estudo é investigar as propriedades antioxidantes e de scavenger das concentrações fisiológicas de taurina (i.e.: 1, 15, 30 e 60 mM) contra diversas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, utilizando diferentes técnicas in vitro. Nós achamos diferentes reatividades da taurina contra diferentes oxidantes testados. Nenhuma reatividade significativa entre taurina e peróxido de hidrogênio foi encontrada. Por outro lado, a taurina reagiu de forma significativa com óxido nítrico e superóxido. Da mesma forma, a taurina foi capaz de impedir a perda da atividade da superóxido dismutase (CuZnSOD) – um alvo descrito do ONOO- – causada por peroxinitrito in vitro. Além disso, a taurina pode agir como scavenger do radical peroxil e diminuir o dano ex vivo causado pelo tert-butilhidroperóxido em fatias de fígado de rato. Os dados deste trabalho demonstram que a taurina, em concentrações fisiológicas, pode ser um eficiente scavenger de diferentes espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, sugerindo um possível papel nas funções celulares e mitocondrial. / Taurine antioxidant properties have already been studied and tested, however most part of the studies used lower concentrations than physiological. This study was undertaken to investigate the scavenging and antioxidant activities of physiological concentrations of taurine (i.e.: 1, 15, 30 and 60 mM) against several reactive oxygen and nitrogen species, using different in vitro assays. We found different reactivity of taurine against different oxidants. No significant reactivity between taurine and hydrogen peroxide was found. Instead, taurine exhibited a significant reactivity with nitric oxide and superoxide. Also, taurine was able to restore superoxide dismutase activity loss caused by peroxynitrite in vitro. In addition, taurine can scavenge peroxyl radical and decrease the ex vivo damage caused by tert-butilhydroperoxide in rat liver slices. The aforementioned experimental data showed that taurine, at physiological concentrations, efficiently scavenge different reactive oxygen species and reactive nitrogen species, suggesting that these properties could be pivotal for the maintenance of cellular and mitochondrial functions.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2016-04-12T19:15:01Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoEstresseOxidativo.pdf: 1980670 bytes, checksum: 2712926e3f6121cef3cc34dcc87aa1fc (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2016-04-12T19:32:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoEstresseOxidativo.pdf: 1980670 bytes, checksum: 2712926e3f6121cef3cc34dcc87aa1fc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-12T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoEstresseOxidativo.pdf: 1980670 bytes, checksum: 2712926e3f6121cef3cc34dcc87aa1fc (MD5) Previous issue date: 2016 / O Mayaro virus (MAYV) é membro da família Togaviridae, gênero Alphavirus. Em humanos, o MAYV causa a Febre Mayaro, doença que apresenta sintomas parecidos com a dengue e outras arboviroses, com exceção das artralgias e artrites persistentes, que são sintomas característicos da infecção pelos Alphavirus. Embora a Febre Mayaro seja importante em termos de saúde pública, os mecanismos que contribuem para a sua patogênese ainda são pouco elucidados. Neste contexto, trabalhos da literatura têm demostrado que o estresse oxidativo pode contribuir para a patogênese de muitos vírus. O estresse oxidativo é um estado de desregulação da sinalização e do controle redox, onde ocorre um desequilíbrio entre a produção de "Espécies Reactivas de Oxigênio" (EROs) e ação do sistema de defesa antioxidante, levando a danos celulares. Os principais antioxidantes enzimáticos são a Superóxido Dismutase (SOD) e Catalase (CAT), e entre os não-enzimáticos, a Glutationa (GSH). Assim, uma vez que são poucos os trabalhos na literatura pautando a patogênese do MAYV e que o estresse oxidativo pode ser fator chave no estabelecimento/progressão de uma variedade de doenças virais, a proposta desse trabalho foi investigar o envolvimento do estresse oxidativo na infecção pelo MAYV, e se esse evento está relacionado à produção exacerbada de EROs e/ou a alteração nas defesas antioxidantes. Para tal, macrófagos foram utilizados desde que são importantes células envolvidas no estabelecimento da artrite induzida por alfavírus. Macrófagos murinos J774 foram infectados com uma multiplicidade de infecção (moi) de 5 e em diferentes horas pós infecção (hpi) foram avaliados parâmetros oxidantes e antioxidantes nas células. A infecção aumentou a produção de EROs, a atividade da SOD e expressão das enzimas SOD e CAT, mas reduziu o conteúdo de Glutationa total. Níveis aumentados de Malondialdeído (MDA), um biomarcador de peroxidação lipídica, foram encontrados em células infectadas com o MAYV. Ainda, em células infectadas, a expressão do RNAm da citocina Fator de Necrose Tumoral Alfa (TNF-α) aumentou nos tempos iniciais após a infecção. Seguida a maior indução de TNF-α, observamos também em células infectadas pelo MAYV um aumento na expressão gênica da Mataloproteinase de Matriz 3 (MMP-3), cujo papel no dano articular já foi observado na infecção por outros alfavírus. Juntos, nossos resultados sugerem que uma alteração no status redox após infecção pelo MAYV leva as células ao estresse oxidativo e seus efeitos deletérios para a células hospedeiras. Estes resultados apontam para novas abordagens na compreensão dos mecanismos envolvidos na patogênese da infecção pelo MAYV. ______________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT : Mayaro virus (MAYV) is a member of the family Togaviridae, genus Alphavirus. In human beings, the MAYV causes the Mayaro Fever, disease that presents symptoms similar to the dengue and others arboviruses, with an exception of the persistent arthralgia and arthritis, which are characteristic symptoms of the infection caused by the Alphavirus. Although the Mayaro Fever is more important in terms of public health, the mechanisms that contribute of the pathogenesis are still unknown. In this context, studies have shown that oxidative stress may contribute to the pathogenesis of many virus. The oxidative stress is a state of deregulation of the redox signaling and control, where there is an imbalance between the production of “reactive oxygen species" (ROS) and action of the antioxidant defense systems, leading to cellular damage. The main enzymatic antioxidant are the Superoxide Dismutase (SOD), and Catalase (CAT), and among the non-enzyme, the Glutathione (GSH). Therefore, there is little information regarding the pathogenic characteristics of MAYV, and considering that the oxidative stress may be a key factor in the establishment/progression of a variety of viral diseases, the purpose of this study was to examine the involvement of oxidative stress in infection by MAYV. We also analyzed if this event is related to the excessive production of ROS and/or changes in antioxidant defenses. Macrophages were used once that they are important cells involved in the establishment of the alphavirus-induced arthritis. The murine macrophages were infected with a multiplicity of infection (moi) of 5 and at different times post infection (pi) were evaluated parameters oxidants and antioxidants. The infection increased the production of ROS, the activity of SOD and expression of SOD and CAT, but decreased the content of total glutathione. In cells infected with MAYV, were found elevated levels of Malondialdehyde (MDA), a biomarker of lipid peroxidation. In addition, in infected cells, the expression of mRNA of cytokine Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) increased in the inicial hours pi. We also observed in infected cells by MAYV an increased in the gene expression that matrix metalloproteinase 3 (MMP-3), which role in the articular damage has been already observed in the infection by others Alphavirus. Our results suggest that an alteration in the redox status after the infection by MAYV leads the cells to the oxidative stress and its effects deleterious for the host cells. These results show new approaches in the comprehension of mechanisms involved in the pathogenesis of the infection by the MAYV.

A taurina (ácido 2-aminoetanosulfônico) é um β-aminoácido não utilizado para a síntese protéica, encontrada livremente no liquido intracelular e um dos aminoácidos livres mais abundantes nos leucócitos, cérebro, músculo esquelético, retina e coração, tendo um papel essencial em diversos processos biológicos. As propriedades antioxidantes da taurina já foram estudadas e testadas, no entanto, a maior parte dos estudos feitos até hoje utilizou concentrações menores do que as fisiológicas. O objetivo deste estudo é investigar as propriedades antioxidantes e de scavenger das concentrações fisiológicas de taurina (i.e.: 1, 15, 30 e 60 mM) contra diversas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, utilizando diferentes técnicas in vitro. Nós achamos diferentes reatividades da taurina contra diferentes oxidantes testados. Nenhuma reatividade significativa entre taurina e peróxido de hidrogênio foi encontrada. Por outro lado, a taurina reagiu de forma significativa com óxido nítrico e superóxido. Da mesma forma, a taurina foi capaz de impedir a perda da atividade da superóxido dismutase (CuZnSOD) – um alvo descrito do ONOO- – causada por peroxinitrito in vitro. Além disso, a taurina pode agir como scavenger do radical peroxil e diminuir o dano ex vivo causado pelo tert-butilhidroperóxido em fatias de fígado de rato. Os dados deste trabalho demonstram que a taurina, em concentrações fisiológicas, pode ser um eficiente scavenger de diferentes espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, sugerindo um possível papel nas funções celulares e mitocondrial. / Taurine antioxidant properties have already been studied and tested, however most part of the studies used lower concentrations than physiological. This study was undertaken to investigate the scavenging and antioxidant activities of physiological concentrations of taurine (i.e.: 1, 15, 30 and 60 mM) against several reactive oxygen and nitrogen species, using different in vitro assays. We found different reactivity of taurine against different oxidants. No significant reactivity between taurine and hydrogen peroxide was found. Instead, taurine exhibited a significant reactivity with nitric oxide and superoxide. Also, taurine was able to restore superoxide dismutase activity loss caused by peroxynitrite in vitro. In addition, taurine can scavenge peroxyl radical and decrease the ex vivo damage caused by tert-butilhydroperoxide in rat liver slices. The aforementioned experimental data showed that taurine, at physiological concentrations, efficiently scavenge different reactive oxygen species and reactive nitrogen species, suggesting that these properties could be pivotal for the maintenance of cellular and mitochondrial functions.

A taurina (ácido 2-aminoetanosulfônico) é um β-aminoácido não utilizado para a síntese protéica, encontrada livremente no liquido intracelular e um dos aminoácidos livres mais abundantes nos leucócitos, cérebro, músculo esquelético, retina e coração, tendo um papel essencial em diversos processos biológicos. As propriedades antioxidantes da taurina já foram estudadas e testadas, no entanto, a maior parte dos estudos feitos até hoje utilizou concentrações menores do que as fisiológicas. O objetivo deste estudo é investigar as propriedades antioxidantes e de scavenger das concentrações fisiológicas de taurina (i.e.: 1, 15, 30 e 60 mM) contra diversas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, utilizando diferentes técnicas in vitro. Nós achamos diferentes reatividades da taurina contra diferentes oxidantes testados. Nenhuma reatividade significativa entre taurina e peróxido de hidrogênio foi encontrada. Por outro lado, a taurina reagiu de forma significativa com óxido nítrico e superóxido. Da mesma forma, a taurina foi capaz de impedir a perda da atividade da superóxido dismutase (CuZnSOD) – um alvo descrito do ONOO- – causada por peroxinitrito in vitro. Além disso, a taurina pode agir como scavenger do radical peroxil e diminuir o dano ex vivo causado pelo tert-butilhidroperóxido em fatias de fígado de rato. Os dados deste trabalho demonstram que a taurina, em concentrações fisiológicas, pode ser um eficiente scavenger de diferentes espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, sugerindo um possível papel nas funções celulares e mitocondrial. / Taurine antioxidant properties have already been studied and tested, however most part of the studies used lower concentrations than physiological. This study was undertaken to investigate the scavenging and antioxidant activities of physiological concentrations of taurine (i.e.: 1, 15, 30 and 60 mM) against several reactive oxygen and nitrogen species, using different in vitro assays. We found different reactivity of taurine against different oxidants. No significant reactivity between taurine and hydrogen peroxide was found. Instead, taurine exhibited a significant reactivity with nitric oxide and superoxide. Also, taurine was able to restore superoxide dismutase activity loss caused by peroxynitrite in vitro. In addition, taurine can scavenge peroxyl radical and decrease the ex vivo damage caused by tert-butilhydroperoxide in rat liver slices. The aforementioned experimental data showed that taurine, at physiological concentrations, efficiently scavenge different reactive oxygen species and reactive nitrogen species, suggesting that these properties could be pivotal for the maintenance of cellular and mitochondrial functions.

As nitrorredutases compreendem uma família de proteínas conservadas evolutivamente e originalmente identificadas em eubactérias. São enzimas capazes de catalisar a redução do grupo nitro e utilizam FMN (flavina mononucleotideo) ou FAD (flavina adenina dinucleotídeo oxidado) como grupo prostético e NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido) ou NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido) como agentes redutores. As nitrorredutases podem ser encontradas em bactérias e em menor extensão em eucariotos. Dois subgrupos de nitrorredutases foram caracterizados em bactérias: oxigênio-insensível ou tipo I e oxigênio-sensível ou tipo II. Na levedura Saccharomyces cerevisiae duas prováveis nitrorredutases, Frm2p/Hbn1p foram identificadas. Em relação às enzimas pertencentes à família das nitrorredutases não se tem conhecimento sobre a sua função biológica, bem como em relação à sua posição filogenética. Tendo isso em vista, o objetivo deste trabalho é esclarecer a possível função das proteínas Frm2 e Hbn1 de Saccharomyces cerevisiae na resposta ao estresse oxidativo, bem como determinar a posição filogenética e a sua presença em outros organismos procariotos e eucariotos. Os resultados da análise filogenética mostram que bactérias possuem seqüências similares a Frm2p/Hbn1p (denominadas Nr1Ap) que formam um clado distinto dentro da família Frm2p/Hbn1p. Análises de agrupamentos hidrofóbicos (HCA) e modelagem tri-dimensional foram realizadas para comparar regiões conservadas entre proteínas Nr1Ap e Frm2p/Hbn1p. A nitrorredutase Frm2p possivelmente esteja atuando na via de sinalização lipídica, enquanto a função da Hbn1p é desconhecida. Entretanto, alguns estudos têm indicado que as nitrorredutases podem estar envolvidas na resposta a estresse oxidativo. Com o objetivo de esclarecer a função de Frm2p e Hbn1p, foi avaliada a sensibilidade de linhagens de levedura proficientes e deficientes em ambas proteínas ao estresse oxidativo, investigando a competência respiratória, as atividades de enzimas antioxidantes, a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a peroxidação lipídica. Os resultados mostram uma menor atividade basal de superóxido dismutase (SOD) e elevada sensibilidade a óxido de 4-nitroquinolina (4-NQO) e Nnitrosodietilamina (NDEA), indução de mutantes citoplasmáticos (petites), produção intracelular de EROs e peroxidação lipídica quando expostas a estes agentes geradores de superóxido nas linhagens frm2 , hbn1 e frm2 hbn1 . Ainda podemos observar elevada atividade basal de catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e conteúdo de glutationa (GSH) nas linhagens frm2 e frm2 hbn1. Estas linhagens possuem menor produção de EROs e peroxidação lipídica quando expostas aos agentes geradores de peróxidos H2O2 e t-BOOH. Isso sugere que a ausência da Frm2p é o fator responsável por estas alterações vistas. Portanto, neste trabalho foi mostrada a influência das nitrorredutases Frm2 e Hbn1 na resposta ao estresse oxidativo em S. cerevisiae, pela modulação da atividade das enzimas antioxidantes, SOD, CAT e GPx, bem como do conteúdo de GSH. Adicionalmente também foi constatado que as nitrorredutases Frm2p e Hbn1p provavelmente não atuam na metabolização de nitrocompostos. Estes resultados são consistentes com os dados encontrados na análise filogenética, que apontam estas proteínas como constituindo uma nova família de prováveis nitrorredutases ainda não caracterizada, encontrada em bactérias e fungos. / The nitroreductase family comprises a group of FMN (flavine mononucleotide) ou FAD (flavine adenine dinucleotíde oxidade)-dependent enzymes able to metabolize nitrosubstituted compounds using the reducing power of NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide fosfate reduzide) or NADH (nicotinamide adenine dinucleotide reduzide). The nitroreductases can be found within bacterial species and, in a less extend, in eukaryotes. Two types of nitroreductase subgroups were characterized in bacteria: oxygen-insensitive or type I and oxygen sensitive or type II. In the yeast Saccharomyces cerevisiae two putative nitroreductase proteins, Frm2p and Hbn1p, were described. A feature of the nitroreductase family is our lack of knowledge about its biological function and evolutionary history. Taking into account these considerations, the purpose of this work was to elucidate the possible participation of these enzymes in response to oxidative stress as well as to determine the phylogenetic position of Frm2p and Hbn1p and the presence of homologous sequences in other prokaryotic and eukaryotic species. In order to obtain data about the phylogenetic position of Frm2p/Hbn1p, we performed an in-depth phylogenetic analysis of these proteins. The phylogenetic analysis of these proteins showed that bacterial cells have a Frm2p/Hbn1p-like sequences (termed NrlAp) which form a distinct clade within the fungal Frm2p/Hbn1p family. Hydrophobic cluster analysis (HCA) and three-dimensional protein modeling allowed us to compare conserved regions among NrlAp and Frm2/Hbn1p proteins. While Frm2p appears to act in the lipid signaling pathway, the function of Hbn1p is unknown. However, some works suggests a possible involvement from the nitroreductases in response the stress oxidative. In order to elucidate the functions of Frm2p and Hbn1p, we evaluate the sensitivity of proficient and deficient yeast strains for both proteins for oxidative stress, considering the respiratory competence, antioxidant enzyme activities, intracellular reactive oxygen species (ROS) production and lipid peroxidation. The results showed a weaker basal activity of superoxide dismutase (SOD) and higher sensitivity for 4-nitroquinoline-oxide (4-NQO) and NNitrosodiethylamine (NDEA), induction of petites, ROS production and lipid peroxidation when exposed the these superoxide generating agents. The results showed a higher basal activity of catalase (CAT), glutathione peroxidase (Gpx) and reduced glutathione (GSH) content in the single and double mutant strains frm2 and frm2 hbn1 . These strains were less ROS-producing and lipid peroxidation when exposed to peroxides-generating agents H2O2 and t-BOOH. Thus, the absence of Frm2p may be the event responsible for these alterations. Considering the data gathered in this work, we showed the influence of nitroreductases Frm2p and Hbn1p in response to oxidative stress in S. cerevisae yeast by modulation of antioxidant enzymes activities, such as SOD, CAT, GPx and GSH content. Additionally, it was showed that the nitroreductases Frm2p and Hbn1p are not envolved in the activation of nitrocompounds. Theses results are consistent with those found in the filogenetic analysis that indicated that theses proteins belong to the new bacterial and fungal Frm2p/Hbn1p nitroreductase-like family.

Programa de Pós-Graduação em Saúde e Nutrição. Escola de Nutrição, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-05-20T21:01:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoPotencialAntioxidanteLicopeno.pdf: 1200572 bytes, checksum: e394f89e5e877613399c2cb53ae6440a (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-05-22T14:57:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoPotencialAntioxidanteLicopeno.pdf: 1200572 bytes, checksum: e394f89e5e877613399c2cb53ae6440a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-22T14:57:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoPotencialAntioxidanteLicopeno.pdf: 1200572 bytes, checksum: e394f89e5e877613399c2cb53ae6440a (MD5) Previous issue date: 2015 / Carcinogênese é um processo multipassos que pode ser induzido e/ou modulado por agentes químicos ou físicos, incluindo aqueles que induzem espécies reativas de oxigênio (EROs). Estas espécies são geradas a partir de uma grande variedade de processos como a respiração mitocondrial e a NADPH oxidase. A produção excessiva de EROs pode oxidar biomoléculas e facilitar processos relacionados com a carcinogênese. Em baixas doses, estas moléculas podem agir como importantes mediadores do crescimento celular, adesão, diferenciação e apoptose. As EROs podem, por exemplo, modular a via da PKC. PKC é uma família de serina-treonina cinases que regulam uma variedade de funções celulares. A ativação aberrante da PKC está relacionada a doenças como o câncer e o diabetes. A PKC pode ser ativada por EROs e a produção de EROs pode requerer a ativação da PKC porque essas cinases tem um papel na ativação da NADPH oxidase. Dessa forma, a ativação da PKC e da NADPH oxidase podem elevar os níveis de EROs, causando danos celulares. Estas reações potencialmente deletérias podem ser controladas por um sistema de antioxidantes enzimáticos (superóxido dismutase - SOD e catalase - CAT) e não enzimáticos (flavonóides e carotenóides). O licopeno é um carotenóide de coloração vermelha que está presente em vários vegetais e frutas. Trata-se de um dos antioxidantes mais potentes e tem demonstrado desempenhar um importante papel na prevenção de vários tipos de câncer, incluindo o hepatocarcinoma. Sendo assim, este estudo objetivou investigar o potencial antioxidante do licopeno e avaliar o efeito deste carotenóide na via da PKC, em células SK-Hep-1, uma linhagem de hepatocarcinoma altamente invasiva. O potencial antioxidante do licopeno foi examinado através da quantificação celular de EROs e das atividades das enzimas SOD e CAT. O efeito do licopeno na via da PKC foi examinado pela quantificação celular de EROs após estimulação com PMA e ionomicina. O papel da NADPH oxidase foi avaliado através da sua inibição com DPI, um inibidor desta enzima. Nossos resultados mostram que o DPI inibiu a produção de EROs, demonstrando a importância da enzima NADPH oxidase na geração de EROs na linhagem celular estudada. O licopeno diminuiu a produção basal de EROs e aumentou a atividade da SOD. Além disso, o licopeno inibiu a produção de EROs induzida por ionomicina e PMA. Estes resultados analisados em conjunto sugerem que um dos mecanismos antioxidantes do licopeno seja através da modulação da proteína cinase C. Entretanto, mais estudos são necessários para confirmar esta hipótese. _____________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Carcinogenesis is a multistep process which can be induced and/ or modulated by chemical and physical agents, including those that induce reactive oxygen species (ROS).These species are generated by a wide variety of processes like mitochondrial respiration and NADPH oxidase. The excessive generation of ROS might oxidize cellular biomolecules and facilitate carcinogenesis-related processes. In lower doses, these molecules can act as important mediators of cell growth, adhesion, differentiation and apoptosis. ROS can, for example, modulate the PKC pathway. PKC is a family of serine/threonine kinases that regulates a variety of cell functions. Aberrant PKC activation is related to diseases such as cancer and diabetes. PKC can be activated by ROS and ROS production can require PKC activation because these kinases have a role in NADPH oxidase activation. On this way, the PKC and NADPH oxidase activation might elevate intracellular levels of ROS causing damage. These potentially deleterious reactions can be controlled by a system of enzymatic (SOD and CAT) and nonenzymatic antioxidants (flavonoids and carotenoids). Lycopene is a red colored carotenoid present in many vegetables and fruits. It‟s one of the most potent antioxidants and has been shown to play an important role in preventing from various types of cancer, including hepatoma. This study aimed to investigate the antioxidant potential of lycopene and evaluate the effect of this carotenoid on PKC pathway, in SK-Hep-1 cells, a highly invasive hepatoma cell line. The antioxidant potential of lycopene was examined by quantification of cellular ROS and of SOD and CAT activities. The effect of lycopene on PKC pathway was examined by quantification of cellular ROS after stimulation with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin. The role of NADPH oxidase was examined by its inhibition with DPI, an NADPH oxidase inhibitor. Our results show that DPI inhibited ROS production, demonstrating the importance of NADPH oxidase in ROS generation in SK-Hep-1cell. Lycopene decreased basal ROS production and increased SOD activity. Furthermore, lycopene inhibit ROS by ionomycin and PMA-induced. Taken together, these results suggest lycopene antioxidant mechanisms are through modulation of protein kinase C. However, more studies are needed to confirm this hypothesis.

As nitrorredutases compreendem uma família de proteínas conservadas evolutivamente e originalmente identificadas em eubactérias. São enzimas capazes de catalisar a redução do grupo nitro e utilizam FMN (flavina mononucleotideo) ou FAD (flavina adenina dinucleotídeo oxidado) como grupo prostético e NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido) ou NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido) como agentes redutores. As nitrorredutases podem ser encontradas em bactérias e em menor extensão em eucariotos. Dois subgrupos de nitrorredutases foram caracterizados em bactérias: oxigênio-insensível ou tipo I e oxigênio-sensível ou tipo II. Na levedura Saccharomyces cerevisiae duas prováveis nitrorredutases, Frm2p/Hbn1p foram identificadas. Em relação às enzimas pertencentes à família das nitrorredutases não se tem conhecimento sobre a sua função biológica, bem como em relação à sua posição filogenética. Tendo isso em vista, o objetivo deste trabalho é esclarecer a possível função das proteínas Frm2 e Hbn1 de Saccharomyces cerevisiae na resposta ao estresse oxidativo, bem como determinar a posição filogenética e a sua presença em outros organismos procariotos e eucariotos. Os resultados da análise filogenética mostram que bactérias possuem seqüências similares a Frm2p/Hbn1p (denominadas Nr1Ap) que formam um clado distinto dentro da família Frm2p/Hbn1p. Análises de agrupamentos hidrofóbicos (HCA) e modelagem tri-dimensional foram realizadas para comparar regiões conservadas entre proteínas Nr1Ap e Frm2p/Hbn1p. A nitrorredutase Frm2p possivelmente esteja atuando na via de sinalização lipídica, enquanto a função da Hbn1p é desconhecida. Entretanto, alguns estudos têm indicado que as nitrorredutases podem estar envolvidas na resposta a estresse oxidativo. Com o objetivo de esclarecer a função de Frm2p e Hbn1p, foi avaliada a sensibilidade de linhagens de levedura proficientes e deficientes em ambas proteínas ao estresse oxidativo, investigando a competência respiratória, as atividades de enzimas antioxidantes, a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a peroxidação lipídica. Os resultados mostram uma menor atividade basal de superóxido dismutase (SOD) e elevada sensibilidade a óxido de 4-nitroquinolina (4-NQO) e Nnitrosodietilamina (NDEA), indução de mutantes citoplasmáticos (petites), produção intracelular de EROs e peroxidação lipídica quando expostas a estes agentes geradores de superóxido nas linhagens frm2 , hbn1 e frm2 hbn1 . Ainda podemos observar elevada atividade basal de catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e conteúdo de glutationa (GSH) nas linhagens frm2 e frm2 hbn1. Estas linhagens possuem menor produção de EROs e peroxidação lipídica quando expostas aos agentes geradores de peróxidos H2O2 e t-BOOH. Isso sugere que a ausência da Frm2p é o fator responsável por estas alterações vistas. Portanto, neste trabalho foi mostrada a influência das nitrorredutases Frm2 e Hbn1 na resposta ao estresse oxidativo em S. cerevisiae, pela modulação da atividade das enzimas antioxidantes, SOD, CAT e GPx, bem como do conteúdo de GSH. Adicionalmente também foi constatado que as nitrorredutases Frm2p e Hbn1p provavelmente não atuam na metabolização de nitrocompostos. Estes resultados são consistentes com os dados encontrados na análise filogenética, que apontam estas proteínas como constituindo uma nova família de prováveis nitrorredutases ainda não caracterizada, encontrada em bactérias e fungos. / The nitroreductase family comprises a group of FMN (flavine mononucleotide) ou FAD (flavine adenine dinucleotíde oxidade)-dependent enzymes able to metabolize nitrosubstituted compounds using the reducing power of NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide fosfate reduzide) or NADH (nicotinamide adenine dinucleotide reduzide). The nitroreductases can be found within bacterial species and, in a less extend, in eukaryotes. Two types of nitroreductase subgroups were characterized in bacteria: oxygen-insensitive or type I and oxygen sensitive or type II. In the yeast Saccharomyces cerevisiae two putative nitroreductase proteins, Frm2p and Hbn1p, were described. A feature of the nitroreductase family is our lack of knowledge about its biological function and evolutionary history. Taking into account these considerations, the purpose of this work was to elucidate the possible participation of these enzymes in response to oxidative stress as well as to determine the phylogenetic position of Frm2p and Hbn1p and the presence of homologous sequences in other prokaryotic and eukaryotic species. In order to obtain data about the phylogenetic position of Frm2p/Hbn1p, we performed an in-depth phylogenetic analysis of these proteins. The phylogenetic analysis of these proteins showed that bacterial cells have a Frm2p/Hbn1p-like sequences (termed NrlAp) which form a distinct clade within the fungal Frm2p/Hbn1p family. Hydrophobic cluster analysis (HCA) and three-dimensional protein modeling allowed us to compare conserved regions among NrlAp and Frm2/Hbn1p proteins. While Frm2p appears to act in the lipid signaling pathway, the function of Hbn1p is unknown. However, some works suggests a possible involvement from the nitroreductases in response the stress oxidative. In order to elucidate the functions of Frm2p and Hbn1p, we evaluate the sensitivity of proficient and deficient yeast strains for both proteins for oxidative stress, considering the respiratory competence, antioxidant enzyme activities, intracellular reactive oxygen species (ROS) production and lipid peroxidation. The results showed a weaker basal activity of superoxide dismutase (SOD) and higher sensitivity for 4-nitroquinoline-oxide (4-NQO) and NNitrosodiethylamine (NDEA), induction of petites, ROS production and lipid peroxidation when exposed the these superoxide generating agents. The results showed a higher basal activity of catalase (CAT), glutathione peroxidase (Gpx) and reduced glutathione (GSH) content in the single and double mutant strains frm2 and frm2 hbn1 . These strains were less ROS-producing and lipid peroxidation when exposed to peroxides-generating agents H2O2 and t-BOOH. Thus, the absence of Frm2p may be the event responsible for these alterations. Considering the data gathered in this work, we showed the influence of nitroreductases Frm2p and Hbn1p in response to oxidative stress in S. cerevisae yeast by modulation of antioxidant enzymes activities, such as SOD, CAT, GPx and GSH content. Additionally, it was showed that the nitroreductases Frm2p and Hbn1p are not envolved in the activation of nitrocompounds. Theses results are consistent with those found in the filogenetic analysis that indicated that theses proteins belong to the new bacterial and fungal Frm2p/Hbn1p nitroreductase-like family.

As nitrorredutases compreendem uma família de proteínas conservadas evolutivamente e originalmente identificadas em eubactérias. São enzimas capazes de catalisar a redução do grupo nitro e utilizam FMN (flavina mononucleotideo) ou FAD (flavina adenina dinucleotídeo oxidado) como grupo prostético e NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido) ou NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido) como agentes redutores. As nitrorredutases podem ser encontradas em bactérias e em menor extensão em eucariotos. Dois subgrupos de nitrorredutases foram caracterizados em bactérias: oxigênio-insensível ou tipo I e oxigênio-sensível ou tipo II. Na levedura Saccharomyces cerevisiae duas prováveis nitrorredutases, Frm2p/Hbn1p foram identificadas. Em relação às enzimas pertencentes à família das nitrorredutases não se tem conhecimento sobre a sua função biológica, bem como em relação à sua posição filogenética. Tendo isso em vista, o objetivo deste trabalho é esclarecer a possível função das proteínas Frm2 e Hbn1 de Saccharomyces cerevisiae na resposta ao estresse oxidativo, bem como determinar a posição filogenética e a sua presença em outros organismos procariotos e eucariotos. Os resultados da análise filogenética mostram que bactérias possuem seqüências similares a Frm2p/Hbn1p (denominadas Nr1Ap) que formam um clado distinto dentro da família Frm2p/Hbn1p. Análises de agrupamentos hidrofóbicos (HCA) e modelagem tri-dimensional foram realizadas para comparar regiões conservadas entre proteínas Nr1Ap e Frm2p/Hbn1p. A nitrorredutase Frm2p possivelmente esteja atuando na via de sinalização lipídica, enquanto a função da Hbn1p é desconhecida. Entretanto, alguns estudos têm indicado que as nitrorredutases podem estar envolvidas na resposta a estresse oxidativo. Com o objetivo de esclarecer a função de Frm2p e Hbn1p, foi avaliada a sensibilidade de linhagens de levedura proficientes e deficientes em ambas proteínas ao estresse oxidativo, investigando a competência respiratória, as atividades de enzimas antioxidantes, a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a peroxidação lipídica. Os resultados mostram uma menor atividade basal de superóxido dismutase (SOD) e elevada sensibilidade a óxido de 4-nitroquinolina (4-NQO) e Nnitrosodietilamina (NDEA), indução de mutantes citoplasmáticos (petites), produção intracelular de EROs e peroxidação lipídica quando expostas a estes agentes geradores de superóxido nas linhagens frm2 , hbn1 e frm2 hbn1 . Ainda podemos observar elevada atividade basal de catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e conteúdo de glutationa (GSH) nas linhagens frm2 e frm2 hbn1. Estas linhagens possuem menor produção de EROs e peroxidação lipídica quando expostas aos agentes geradores de peróxidos H2O2 e t-BOOH. Isso sugere que a ausência da Frm2p é o fator responsável por estas alterações vistas. Portanto, neste trabalho foi mostrada a influência das nitrorredutases Frm2 e Hbn1 na resposta ao estresse oxidativo em S. cerevisiae, pela modulação da atividade das enzimas antioxidantes, SOD, CAT e GPx, bem como do conteúdo de GSH. Adicionalmente também foi constatado que as nitrorredutases Frm2p e Hbn1p provavelmente não atuam na metabolização de nitrocompostos. Estes resultados são consistentes com os dados encontrados na análise filogenética, que apontam estas proteínas como constituindo uma nova família de prováveis nitrorredutases ainda não caracterizada, encontrada em bactérias e fungos. / The nitroreductase family comprises a group of FMN (flavine mononucleotide) ou FAD (flavine adenine dinucleotíde oxidade)-dependent enzymes able to metabolize nitrosubstituted compounds using the reducing power of NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide fosfate reduzide) or NADH (nicotinamide adenine dinucleotide reduzide). The nitroreductases can be found within bacterial species and, in a less extend, in eukaryotes. Two types of nitroreductase subgroups were characterized in bacteria: oxygen-insensitive or type I and oxygen sensitive or type II. In the yeast Saccharomyces cerevisiae two putative nitroreductase proteins, Frm2p and Hbn1p, were described. A feature of the nitroreductase family is our lack of knowledge about its biological function and evolutionary history. Taking into account these considerations, the purpose of this work was to elucidate the possible participation of these enzymes in response to oxidative stress as well as to determine the phylogenetic position of Frm2p and Hbn1p and the presence of homologous sequences in other prokaryotic and eukaryotic species. In order to obtain data about the phylogenetic position of Frm2p/Hbn1p, we performed an in-depth phylogenetic analysis of these proteins. The phylogenetic analysis of these proteins showed that bacterial cells have a Frm2p/Hbn1p-like sequences (termed NrlAp) which form a distinct clade within the fungal Frm2p/Hbn1p family. Hydrophobic cluster analysis (HCA) and three-dimensional protein modeling allowed us to compare conserved regions among NrlAp and Frm2/Hbn1p proteins. While Frm2p appears to act in the lipid signaling pathway, the function of Hbn1p is unknown. However, some works suggests a possible involvement from the nitroreductases in response the stress oxidative. In order to elucidate the functions of Frm2p and Hbn1p, we evaluate the sensitivity of proficient and deficient yeast strains for both proteins for oxidative stress, considering the respiratory competence, antioxidant enzyme activities, intracellular reactive oxygen species (ROS) production and lipid peroxidation. The results showed a weaker basal activity of superoxide dismutase (SOD) and higher sensitivity for 4-nitroquinoline-oxide (4-NQO) and NNitrosodiethylamine (NDEA), induction of petites, ROS production and lipid peroxidation when exposed the these superoxide generating agents. The results showed a higher basal activity of catalase (CAT), glutathione peroxidase (Gpx) and reduced glutathione (GSH) content in the single and double mutant strains frm2 and frm2 hbn1 . These strains were less ROS-producing and lipid peroxidation when exposed to peroxides-generating agents H2O2 and t-BOOH. Thus, the absence of Frm2p may be the event responsible for these alterations. Considering the data gathered in this work, we showed the influence of nitroreductases Frm2p and Hbn1p in response to oxidative stress in S. cerevisae yeast by modulation of antioxidant enzymes activities, such as SOD, CAT, GPx and GSH content. Additionally, it was showed that the nitroreductases Frm2p and Hbn1p are not envolved in the activation of nitrocompounds. Theses results are consistent with those found in the filogenetic analysis that indicated that theses proteins belong to the new bacterial and fungal Frm2p/Hbn1p nitroreductase-like family.

A fenilcetonúria (PKU) é causada pela deficiência severa da atividade da fenilalanina hidroxilase (PAH), enzima responsável pela conversão de fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr), levando ao aumento dos níveis sanguíneos e teciduais de Phe, bem como de seus metabólitos fenilpiruvato (PPA), fenilactato (PLA) e fenilacetato (PAA). Os pacientes com PKU apresentam disfunção neurológica severa, manifestando convulsões, retardo mental e psicomotor, sintomas que estão associados ao acúmulo desse aminoácido e seus metabólitos. A restrição dietética, que faz parte do tratamento da PKU, nem sempre é mantida pelos pacientes e pode afetar o status antioxidante devido à restrição de nutrientes. Estudos recentes em ratos e com pacientes fenilcetonúricos mostram que o estresse oxidativo (EO) pode estar envolvido na neurofisiopatologia dessa doença, possivelmente devido ao aumento na produção de espécies reativas, e diminuição das defesas antioxidantes. O cérebro, órgão afetado na doença, é extremamente sensível ao EO devido a baixas defesas antioxidantes, alta concentração de ferro e lipídeos insaturados. Aparentemente o fígado não é afetado na PKU, mas é um importante órgão de detoxificação e reservatório de GSH (tripeptídeo antioxidante). O ácido lipoico (AL) é um potente antioxidante facilmente adquirido da dieta, absorvido pelo organismo e tem sido sugerido em estudos para o tratamento e prevenção de EO em modelos de doenças neurodegenerativas. Um estudo recente demonstrou um efeito protetor do AL contra o EO gerado por uma concentração tóxica de Phe em cérebro de ratos jovens. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito do AL na prevenção do EO gerado em um modelo crônico de PKU induzido por injeções diárias de Phe e α-metilfenilalanina (inibidor da PAH). No presente trabalho, o modelo de hiperfenilalaninemia (HPA) causou, no cérebro, aumento de dano a lipídeos, proteínas e DNA; aumento da atividade da superóxido dismutase e diminuição da atividade da catalase, além de mostrar que essas enzimas podem ter um papel importante neste processo, uma vez que suas atividades são afetadas diretamente pela presença de Phe e seus metabólitos. Também foi possível descrever algumas espécies reativas específicas geradas no processo oxidativo envolvido na HPA, como de H2O2, NO• e O2 •-. E ainda, identificou-se que o EO não está restrito ao cérebro e que o fígado pode ter um papel importante em defesa ao EO encontrado na doença. As enzimas glutationa peroxidase, glutationa redutase, glicose-6-fosfato desidrogenase e o conteúdo total de GSH foram diminuídos pela HPA em cérebro dos animais e a atividade da glutamato cisteína ligase foi aumentada. Já no fígado, todas as enzimas relacionadas ao metabolismo da GSH foram aumentadas pela HPA. O tratamento com AL foi capaz de prevenir as alterações enzimáticas além de impedir o dano a biomoléculas. O AL também preveniu o aumento da produção de H2O2 e NO• no cérebro dos animais submetidos ao tratamento de HPA. Quanto ao metabolismo da GSH, o AL foi capaz de manter as atividades enzimáticas aos níveis do controle além de restaurar a produção de GSH no cérebro dos animais afetados pela HPA. De acordo com os resultados, é possível que um tratamento com antioxidantes seja eficaz na manutenção da homeostasia redox nos pacientes servindo como uma abordagem terapêutica inovadora e adicional ao tratamento dietético já aplicado aos pacientes de PKU. / Phenylketonuria (PKU) is caused by a severe deficiency of phenylalanine hydroxylase (PAH), the enzyme responsible for the conversion of phenylalanine (Phe) to tyrosine (Tyr), leading to increased blood and tissue levels of Phe and its metabolites phenylpyruvate (PPA), phenylactate (PLA) and phenylacetate (PAA). Patients with PKU have severe neurological dysfunction, characterized by seizures, mental retardation and psychomotor symptoms that are associated with the accumulation of this amino acid and its metabolites. A restrict diet important for PKU treatment, is not always maintained by patients and this can affect the antioxidant status due to nutrient limitation. Recent studies in rats and patients with PKU show that oxidative stress may be involved in the neuropathophysiology of this disease, possibly due to increased production of reactive oxygen species and decreased antioxidant defenses. The brain, organ affected in the disease, is extremely sensitive to oxidative stress due to low antioxidant defenses and high concentrations of Fe and unsaturated lipids. Apparently, the liver is not affected in PKU, but it is an important organ of detoxification and GSH reservoir (tripeptide antioxidant). Lipoic acid (LA) is a potent antioxidant easily acquired from the diet, absorbed by the body and has been suggested for the treatment and prevention of oxidative stress in different neurodegenerative diseases in many studies. A recent study showed a protective effect of LA against the oxidative stress generated by a toxic concentration of Phe in the brain of young rats. The aim of this study was to evaluate the effect of LA in preventing the oxidative stress generated in a chronic model of PKU induced by daily injections of Phe and α-methylphenylalanine (PAH inhibitor) for 7 days. The hyperphenylalaninemia (HPA) model caused in brain an increase of damage to lipids, proteins and DNA; increased superoxide dismutase activity and decreased catalase activity, showing that these enzymes may play an important role in this process, since their activities are directly affected by the presence of Phe and its metabolites. It was also reported some specific reactive species generated in the oxidation process involved in HPA as H2O2 , NO• and O2 • -. In addition, it was found that oxidative stress is not restricted to the brain, and the liver may play an important role in defense to oxidative stress found in the disease. Activities of glutathione peroxidase, glutathione reductase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and total content of GSH were decreased by the HPA in the brain of animals and the activity of GCL was increased. In the liver, all enzymes related to GSH metabolism were increased by the HPA. Treatment with LA was able to prevent the enzymatic changes in addition to preventing damage to biomolecules. The overproduction of H2O2 and NO• by HPA model was inhibited by LA treatment. Regarding to GSH metabolism, LA was able to maintain enzyme activities and GSH production at control levels in the brain of animals affected by HPA. According to our results, it is possible that a treatment with antioxidants is effective in maintaining redox homeostasis in patients and may be a novel therapeutic approach additional to dietary treatment already applied to PKU patients.