A taurina (ácido 2-aminoetanosulfônico) é um β-aminoácido não utilizado para a síntese protéica, encontrada livremente no liquido intracelular e um dos aminoácidos livres mais abundantes nos leucócitos, cérebro, músculo esquelético, retina e coração, tendo um papel essencial em diversos processos biológicos. As propriedades antioxidantes da taurina já foram estudadas e testadas, no entanto, a maior parte dos estudos feitos até hoje utilizou concentrações menores do que as fisiológicas. O objetivo deste estudo é investigar as propriedades antioxidantes e de scavenger das concentrações fisiológicas de taurina (i.e.: 1, 15, 30 e 60 mM) contra diversas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, utilizando diferentes técnicas in vitro. Nós achamos diferentes reatividades da taurina contra diferentes oxidantes testados. Nenhuma reatividade significativa entre taurina e peróxido de hidrogênio foi encontrada. Por outro lado, a taurina reagiu de forma significativa com óxido nítrico e superóxido. Da mesma forma, a taurina foi capaz de impedir a perda da atividade da superóxido dismutase (CuZnSOD) – um alvo descrito do ONOO- – causada por peroxinitrito in vitro. Além disso, a taurina pode agir como scavenger do radical peroxil e diminuir o dano ex vivo causado pelo tert-butilhidroperóxido em fatias de fígado de rato. Os dados deste trabalho demonstram que a taurina, em concentrações fisiológicas, pode ser um eficiente scavenger de diferentes espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, sugerindo um possível papel nas funções celulares e mitocondrial. / Taurine antioxidant properties have already been studied and tested, however most part of the studies used lower concentrations than physiological. This study was undertaken to investigate the scavenging and antioxidant activities of physiological concentrations of taurine (i.e.: 1, 15, 30 and 60 mM) against several reactive oxygen and nitrogen species, using different in vitro assays. We found different reactivity of taurine against different oxidants. No significant reactivity between taurine and hydrogen peroxide was found. Instead, taurine exhibited a significant reactivity with nitric oxide and superoxide. Also, taurine was able to restore superoxide dismutase activity loss caused by peroxynitrite in vitro. In addition, taurine can scavenge peroxyl radical and decrease the ex vivo damage caused by tert-butilhydroperoxide in rat liver slices. The aforementioned experimental data showed that taurine, at physiological concentrations, efficiently scavenge different reactive oxygen species and reactive nitrogen species, suggesting that these properties could be pivotal for the maintenance of cellular and mitochondrial functions.

A taurina (ácido 2-aminoetanosulfônico) é um β-aminoácido não utilizado para a síntese protéica, encontrada livremente no liquido intracelular e um dos aminoácidos livres mais abundantes nos leucócitos, cérebro, músculo esquelético, retina e coração, tendo um papel essencial em diversos processos biológicos. As propriedades antioxidantes da taurina já foram estudadas e testadas, no entanto, a maior parte dos estudos feitos até hoje utilizou concentrações menores do que as fisiológicas. O objetivo deste estudo é investigar as propriedades antioxidantes e de scavenger das concentrações fisiológicas de taurina (i.e.: 1, 15, 30 e 60 mM) contra diversas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, utilizando diferentes técnicas in vitro. Nós achamos diferentes reatividades da taurina contra diferentes oxidantes testados. Nenhuma reatividade significativa entre taurina e peróxido de hidrogênio foi encontrada. Por outro lado, a taurina reagiu de forma significativa com óxido nítrico e superóxido. Da mesma forma, a taurina foi capaz de impedir a perda da atividade da superóxido dismutase (CuZnSOD) – um alvo descrito do ONOO- – causada por peroxinitrito in vitro. Além disso, a taurina pode agir como scavenger do radical peroxil e diminuir o dano ex vivo causado pelo tert-butilhidroperóxido em fatias de fígado de rato. Os dados deste trabalho demonstram que a taurina, em concentrações fisiológicas, pode ser um eficiente scavenger de diferentes espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, sugerindo um possível papel nas funções celulares e mitocondrial. / Taurine antioxidant properties have already been studied and tested, however most part of the studies used lower concentrations than physiological. This study was undertaken to investigate the scavenging and antioxidant activities of physiological concentrations of taurine (i.e.: 1, 15, 30 and 60 mM) against several reactive oxygen and nitrogen species, using different in vitro assays. We found different reactivity of taurine against different oxidants. No significant reactivity between taurine and hydrogen peroxide was found. Instead, taurine exhibited a significant reactivity with nitric oxide and superoxide. Also, taurine was able to restore superoxide dismutase activity loss caused by peroxynitrite in vitro. In addition, taurine can scavenge peroxyl radical and decrease the ex vivo damage caused by tert-butilhydroperoxide in rat liver slices. The aforementioned experimental data showed that taurine, at physiological concentrations, efficiently scavenge different reactive oxygen species and reactive nitrogen species, suggesting that these properties could be pivotal for the maintenance of cellular and mitochondrial functions.

A taurina (ácido 2-aminoetanosulfônico) é um β-aminoácido não utilizado para a síntese protéica, encontrada livremente no liquido intracelular e um dos aminoácidos livres mais abundantes nos leucócitos, cérebro, músculo esquelético, retina e coração, tendo um papel essencial em diversos processos biológicos. As propriedades antioxidantes da taurina já foram estudadas e testadas, no entanto, a maior parte dos estudos feitos até hoje utilizou concentrações menores do que as fisiológicas. O objetivo deste estudo é investigar as propriedades antioxidantes e de scavenger das concentrações fisiológicas de taurina (i.e.: 1, 15, 30 e 60 mM) contra diversas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, utilizando diferentes técnicas in vitro. Nós achamos diferentes reatividades da taurina contra diferentes oxidantes testados. Nenhuma reatividade significativa entre taurina e peróxido de hidrogênio foi encontrada. Por outro lado, a taurina reagiu de forma significativa com óxido nítrico e superóxido. Da mesma forma, a taurina foi capaz de impedir a perda da atividade da superóxido dismutase (CuZnSOD) – um alvo descrito do ONOO- – causada por peroxinitrito in vitro. Além disso, a taurina pode agir como scavenger do radical peroxil e diminuir o dano ex vivo causado pelo tert-butilhidroperóxido em fatias de fígado de rato. Os dados deste trabalho demonstram que a taurina, em concentrações fisiológicas, pode ser um eficiente scavenger de diferentes espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, sugerindo um possível papel nas funções celulares e mitocondrial. / Taurine antioxidant properties have already been studied and tested, however most part of the studies used lower concentrations than physiological. This study was undertaken to investigate the scavenging and antioxidant activities of physiological concentrations of taurine (i.e.: 1, 15, 30 and 60 mM) against several reactive oxygen and nitrogen species, using different in vitro assays. We found different reactivity of taurine against different oxidants. No significant reactivity between taurine and hydrogen peroxide was found. Instead, taurine exhibited a significant reactivity with nitric oxide and superoxide. Also, taurine was able to restore superoxide dismutase activity loss caused by peroxynitrite in vitro. In addition, taurine can scavenge peroxyl radical and decrease the ex vivo damage caused by tert-butilhydroperoxide in rat liver slices. The aforementioned experimental data showed that taurine, at physiological concentrations, efficiently scavenge different reactive oxygen species and reactive nitrogen species, suggesting that these properties could be pivotal for the maintenance of cellular and mitochondrial functions.

A fenilcetonúria (PKU) é causada pela deficiência severa da atividade da fenilalanina hidroxilase (PAH), enzima responsável pela conversão de fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr), levando ao aumento dos níveis sanguíneos e teciduais de Phe, bem como de seus metabólitos fenilpiruvato (PPA), fenilactato (PLA) e fenilacetato (PAA). Os pacientes com PKU apresentam disfunção neurológica severa, manifestando convulsões, retardo mental e psicomotor, sintomas que estão associados ao acúmulo desse aminoácido e seus metabólitos. A restrição dietética, que faz parte do tratamento da PKU, nem sempre é mantida pelos pacientes e pode afetar o status antioxidante devido à restrição de nutrientes. Estudos recentes em ratos e com pacientes fenilcetonúricos mostram que o estresse oxidativo (EO) pode estar envolvido na neurofisiopatologia dessa doença, possivelmente devido ao aumento na produção de espécies reativas, e diminuição das defesas antioxidantes. O cérebro, órgão afetado na doença, é extremamente sensível ao EO devido a baixas defesas antioxidantes, alta concentração de ferro e lipídeos insaturados. Aparentemente o fígado não é afetado na PKU, mas é um importante órgão de detoxificação e reservatório de GSH (tripeptídeo antioxidante). O ácido lipoico (AL) é um potente antioxidante facilmente adquirido da dieta, absorvido pelo organismo e tem sido sugerido em estudos para o tratamento e prevenção de EO em modelos de doenças neurodegenerativas. Um estudo recente demonstrou um efeito protetor do AL contra o EO gerado por uma concentração tóxica de Phe em cérebro de ratos jovens. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito do AL na prevenção do EO gerado em um modelo crônico de PKU induzido por injeções diárias de Phe e α-metilfenilalanina (inibidor da PAH). No presente trabalho, o modelo de hiperfenilalaninemia (HPA) causou, no cérebro, aumento de dano a lipídeos, proteínas e DNA; aumento da atividade da superóxido dismutase e diminuição da atividade da catalase, além de mostrar que essas enzimas podem ter um papel importante neste processo, uma vez que suas atividades são afetadas diretamente pela presença de Phe e seus metabólitos. Também foi possível descrever algumas espécies reativas específicas geradas no processo oxidativo envolvido na HPA, como de H2O2, NO• e O2 •-. E ainda, identificou-se que o EO não está restrito ao cérebro e que o fígado pode ter um papel importante em defesa ao EO encontrado na doença. As enzimas glutationa peroxidase, glutationa redutase, glicose-6-fosfato desidrogenase e o conteúdo total de GSH foram diminuídos pela HPA em cérebro dos animais e a atividade da glutamato cisteína ligase foi aumentada. Já no fígado, todas as enzimas relacionadas ao metabolismo da GSH foram aumentadas pela HPA. O tratamento com AL foi capaz de prevenir as alterações enzimáticas além de impedir o dano a biomoléculas. O AL também preveniu o aumento da produção de H2O2 e NO• no cérebro dos animais submetidos ao tratamento de HPA. Quanto ao metabolismo da GSH, o AL foi capaz de manter as atividades enzimáticas aos níveis do controle além de restaurar a produção de GSH no cérebro dos animais afetados pela HPA. De acordo com os resultados, é possível que um tratamento com antioxidantes seja eficaz na manutenção da homeostasia redox nos pacientes servindo como uma abordagem terapêutica inovadora e adicional ao tratamento dietético já aplicado aos pacientes de PKU. / Phenylketonuria (PKU) is caused by a severe deficiency of phenylalanine hydroxylase (PAH), the enzyme responsible for the conversion of phenylalanine (Phe) to tyrosine (Tyr), leading to increased blood and tissue levels of Phe and its metabolites phenylpyruvate (PPA), phenylactate (PLA) and phenylacetate (PAA). Patients with PKU have severe neurological dysfunction, characterized by seizures, mental retardation and psychomotor symptoms that are associated with the accumulation of this amino acid and its metabolites. A restrict diet important for PKU treatment, is not always maintained by patients and this can affect the antioxidant status due to nutrient limitation. Recent studies in rats and patients with PKU show that oxidative stress may be involved in the neuropathophysiology of this disease, possibly due to increased production of reactive oxygen species and decreased antioxidant defenses. The brain, organ affected in the disease, is extremely sensitive to oxidative stress due to low antioxidant defenses and high concentrations of Fe and unsaturated lipids. Apparently, the liver is not affected in PKU, but it is an important organ of detoxification and GSH reservoir (tripeptide antioxidant). Lipoic acid (LA) is a potent antioxidant easily acquired from the diet, absorbed by the body and has been suggested for the treatment and prevention of oxidative stress in different neurodegenerative diseases in many studies. A recent study showed a protective effect of LA against the oxidative stress generated by a toxic concentration of Phe in the brain of young rats. The aim of this study was to evaluate the effect of LA in preventing the oxidative stress generated in a chronic model of PKU induced by daily injections of Phe and α-methylphenylalanine (PAH inhibitor) for 7 days. The hyperphenylalaninemia (HPA) model caused in brain an increase of damage to lipids, proteins and DNA; increased superoxide dismutase activity and decreased catalase activity, showing that these enzymes may play an important role in this process, since their activities are directly affected by the presence of Phe and its metabolites. It was also reported some specific reactive species generated in the oxidation process involved in HPA as H2O2 , NO• and O2 • -. In addition, it was found that oxidative stress is not restricted to the brain, and the liver may play an important role in defense to oxidative stress found in the disease. Activities of glutathione peroxidase, glutathione reductase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and total content of GSH were decreased by the HPA in the brain of animals and the activity of GCL was increased. In the liver, all enzymes related to GSH metabolism were increased by the HPA. Treatment with LA was able to prevent the enzymatic changes in addition to preventing damage to biomolecules. The overproduction of H2O2 and NO• by HPA model was inhibited by LA treatment. Regarding to GSH metabolism, LA was able to maintain enzyme activities and GSH production at control levels in the brain of animals affected by HPA. According to our results, it is possible that a treatment with antioxidants is effective in maintaining redox homeostasis in patients and may be a novel therapeutic approach additional to dietary treatment already applied to PKU patients.

A fenilcetonúria (PKU) é causada pela deficiência severa da atividade da fenilalanina hidroxilase (PAH), enzima responsável pela conversão de fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr), levando ao aumento dos níveis sanguíneos e teciduais de Phe, bem como de seus metabólitos fenilpiruvato (PPA), fenilactato (PLA) e fenilacetato (PAA). Os pacientes com PKU apresentam disfunção neurológica severa, manifestando convulsões, retardo mental e psicomotor, sintomas que estão associados ao acúmulo desse aminoácido e seus metabólitos. A restrição dietética, que faz parte do tratamento da PKU, nem sempre é mantida pelos pacientes e pode afetar o status antioxidante devido à restrição de nutrientes. Estudos recentes em ratos e com pacientes fenilcetonúricos mostram que o estresse oxidativo (EO) pode estar envolvido na neurofisiopatologia dessa doença, possivelmente devido ao aumento na produção de espécies reativas, e diminuição das defesas antioxidantes. O cérebro, órgão afetado na doença, é extremamente sensível ao EO devido a baixas defesas antioxidantes, alta concentração de ferro e lipídeos insaturados. Aparentemente o fígado não é afetado na PKU, mas é um importante órgão de detoxificação e reservatório de GSH (tripeptídeo antioxidante). O ácido lipoico (AL) é um potente antioxidante facilmente adquirido da dieta, absorvido pelo organismo e tem sido sugerido em estudos para o tratamento e prevenção de EO em modelos de doenças neurodegenerativas. Um estudo recente demonstrou um efeito protetor do AL contra o EO gerado por uma concentração tóxica de Phe em cérebro de ratos jovens. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito do AL na prevenção do EO gerado em um modelo crônico de PKU induzido por injeções diárias de Phe e α-metilfenilalanina (inibidor da PAH). No presente trabalho, o modelo de hiperfenilalaninemia (HPA) causou, no cérebro, aumento de dano a lipídeos, proteínas e DNA; aumento da atividade da superóxido dismutase e diminuição da atividade da catalase, além de mostrar que essas enzimas podem ter um papel importante neste processo, uma vez que suas atividades são afetadas diretamente pela presença de Phe e seus metabólitos. Também foi possível descrever algumas espécies reativas específicas geradas no processo oxidativo envolvido na HPA, como de H2O2, NO• e O2 •-. E ainda, identificou-se que o EO não está restrito ao cérebro e que o fígado pode ter um papel importante em defesa ao EO encontrado na doença. As enzimas glutationa peroxidase, glutationa redutase, glicose-6-fosfato desidrogenase e o conteúdo total de GSH foram diminuídos pela HPA em cérebro dos animais e a atividade da glutamato cisteína ligase foi aumentada. Já no fígado, todas as enzimas relacionadas ao metabolismo da GSH foram aumentadas pela HPA. O tratamento com AL foi capaz de prevenir as alterações enzimáticas além de impedir o dano a biomoléculas. O AL também preveniu o aumento da produção de H2O2 e NO• no cérebro dos animais submetidos ao tratamento de HPA. Quanto ao metabolismo da GSH, o AL foi capaz de manter as atividades enzimáticas aos níveis do controle além de restaurar a produção de GSH no cérebro dos animais afetados pela HPA. De acordo com os resultados, é possível que um tratamento com antioxidantes seja eficaz na manutenção da homeostasia redox nos pacientes servindo como uma abordagem terapêutica inovadora e adicional ao tratamento dietético já aplicado aos pacientes de PKU. / Phenylketonuria (PKU) is caused by a severe deficiency of phenylalanine hydroxylase (PAH), the enzyme responsible for the conversion of phenylalanine (Phe) to tyrosine (Tyr), leading to increased blood and tissue levels of Phe and its metabolites phenylpyruvate (PPA), phenylactate (PLA) and phenylacetate (PAA). Patients with PKU have severe neurological dysfunction, characterized by seizures, mental retardation and psychomotor symptoms that are associated with the accumulation of this amino acid and its metabolites. A restrict diet important for PKU treatment, is not always maintained by patients and this can affect the antioxidant status due to nutrient limitation. Recent studies in rats and patients with PKU show that oxidative stress may be involved in the neuropathophysiology of this disease, possibly due to increased production of reactive oxygen species and decreased antioxidant defenses. The brain, organ affected in the disease, is extremely sensitive to oxidative stress due to low antioxidant defenses and high concentrations of Fe and unsaturated lipids. Apparently, the liver is not affected in PKU, but it is an important organ of detoxification and GSH reservoir (tripeptide antioxidant). Lipoic acid (LA) is a potent antioxidant easily acquired from the diet, absorbed by the body and has been suggested for the treatment and prevention of oxidative stress in different neurodegenerative diseases in many studies. A recent study showed a protective effect of LA against the oxidative stress generated by a toxic concentration of Phe in the brain of young rats. The aim of this study was to evaluate the effect of LA in preventing the oxidative stress generated in a chronic model of PKU induced by daily injections of Phe and α-methylphenylalanine (PAH inhibitor) for 7 days. The hyperphenylalaninemia (HPA) model caused in brain an increase of damage to lipids, proteins and DNA; increased superoxide dismutase activity and decreased catalase activity, showing that these enzymes may play an important role in this process, since their activities are directly affected by the presence of Phe and its metabolites. It was also reported some specific reactive species generated in the oxidation process involved in HPA as H2O2 , NO• and O2 • -. In addition, it was found that oxidative stress is not restricted to the brain, and the liver may play an important role in defense to oxidative stress found in the disease. Activities of glutathione peroxidase, glutathione reductase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and total content of GSH were decreased by the HPA in the brain of animals and the activity of GCL was increased. In the liver, all enzymes related to GSH metabolism were increased by the HPA. Treatment with LA was able to prevent the enzymatic changes in addition to preventing damage to biomolecules. The overproduction of H2O2 and NO• by HPA model was inhibited by LA treatment. Regarding to GSH metabolism, LA was able to maintain enzyme activities and GSH production at control levels in the brain of animals affected by HPA. According to our results, it is possible that a treatment with antioxidants is effective in maintaining redox homeostasis in patients and may be a novel therapeutic approach additional to dietary treatment already applied to PKU patients.

A fenilcetonúria (PKU) é causada pela deficiência severa da atividade da fenilalanina hidroxilase (PAH), enzima responsável pela conversão de fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr), levando ao aumento dos níveis sanguíneos e teciduais de Phe, bem como de seus metabólitos fenilpiruvato (PPA), fenilactato (PLA) e fenilacetato (PAA). Os pacientes com PKU apresentam disfunção neurológica severa, manifestando convulsões, retardo mental e psicomotor, sintomas que estão associados ao acúmulo desse aminoácido e seus metabólitos. A restrição dietética, que faz parte do tratamento da PKU, nem sempre é mantida pelos pacientes e pode afetar o status antioxidante devido à restrição de nutrientes. Estudos recentes em ratos e com pacientes fenilcetonúricos mostram que o estresse oxidativo (EO) pode estar envolvido na neurofisiopatologia dessa doença, possivelmente devido ao aumento na produção de espécies reativas, e diminuição das defesas antioxidantes. O cérebro, órgão afetado na doença, é extremamente sensível ao EO devido a baixas defesas antioxidantes, alta concentração de ferro e lipídeos insaturados. Aparentemente o fígado não é afetado na PKU, mas é um importante órgão de detoxificação e reservatório de GSH (tripeptídeo antioxidante). O ácido lipoico (AL) é um potente antioxidante facilmente adquirido da dieta, absorvido pelo organismo e tem sido sugerido em estudos para o tratamento e prevenção de EO em modelos de doenças neurodegenerativas. Um estudo recente demonstrou um efeito protetor do AL contra o EO gerado por uma concentração tóxica de Phe em cérebro de ratos jovens. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito do AL na prevenção do EO gerado em um modelo crônico de PKU induzido por injeções diárias de Phe e α-metilfenilalanina (inibidor da PAH). No presente trabalho, o modelo de hiperfenilalaninemia (HPA) causou, no cérebro, aumento de dano a lipídeos, proteínas e DNA; aumento da atividade da superóxido dismutase e diminuição da atividade da catalase, além de mostrar que essas enzimas podem ter um papel importante neste processo, uma vez que suas atividades são afetadas diretamente pela presença de Phe e seus metabólitos. Também foi possível descrever algumas espécies reativas específicas geradas no processo oxidativo envolvido na HPA, como de H2O2, NO• e O2 •-. E ainda, identificou-se que o EO não está restrito ao cérebro e que o fígado pode ter um papel importante em defesa ao EO encontrado na doença. As enzimas glutationa peroxidase, glutationa redutase, glicose-6-fosfato desidrogenase e o conteúdo total de GSH foram diminuídos pela HPA em cérebro dos animais e a atividade da glutamato cisteína ligase foi aumentada. Já no fígado, todas as enzimas relacionadas ao metabolismo da GSH foram aumentadas pela HPA. O tratamento com AL foi capaz de prevenir as alterações enzimáticas além de impedir o dano a biomoléculas. O AL também preveniu o aumento da produção de H2O2 e NO• no cérebro dos animais submetidos ao tratamento de HPA. Quanto ao metabolismo da GSH, o AL foi capaz de manter as atividades enzimáticas aos níveis do controle além de restaurar a produção de GSH no cérebro dos animais afetados pela HPA. De acordo com os resultados, é possível que um tratamento com antioxidantes seja eficaz na manutenção da homeostasia redox nos pacientes servindo como uma abordagem terapêutica inovadora e adicional ao tratamento dietético já aplicado aos pacientes de PKU. / Phenylketonuria (PKU) is caused by a severe deficiency of phenylalanine hydroxylase (PAH), the enzyme responsible for the conversion of phenylalanine (Phe) to tyrosine (Tyr), leading to increased blood and tissue levels of Phe and its metabolites phenylpyruvate (PPA), phenylactate (PLA) and phenylacetate (PAA). Patients with PKU have severe neurological dysfunction, characterized by seizures, mental retardation and psychomotor symptoms that are associated with the accumulation of this amino acid and its metabolites. A restrict diet important for PKU treatment, is not always maintained by patients and this can affect the antioxidant status due to nutrient limitation. Recent studies in rats and patients with PKU show that oxidative stress may be involved in the neuropathophysiology of this disease, possibly due to increased production of reactive oxygen species and decreased antioxidant defenses. The brain, organ affected in the disease, is extremely sensitive to oxidative stress due to low antioxidant defenses and high concentrations of Fe and unsaturated lipids. Apparently, the liver is not affected in PKU, but it is an important organ of detoxification and GSH reservoir (tripeptide antioxidant). Lipoic acid (LA) is a potent antioxidant easily acquired from the diet, absorbed by the body and has been suggested for the treatment and prevention of oxidative stress in different neurodegenerative diseases in many studies. A recent study showed a protective effect of LA against the oxidative stress generated by a toxic concentration of Phe in the brain of young rats. The aim of this study was to evaluate the effect of LA in preventing the oxidative stress generated in a chronic model of PKU induced by daily injections of Phe and α-methylphenylalanine (PAH inhibitor) for 7 days. The hyperphenylalaninemia (HPA) model caused in brain an increase of damage to lipids, proteins and DNA; increased superoxide dismutase activity and decreased catalase activity, showing that these enzymes may play an important role in this process, since their activities are directly affected by the presence of Phe and its metabolites. It was also reported some specific reactive species generated in the oxidation process involved in HPA as H2O2 , NO• and O2 • -. In addition, it was found that oxidative stress is not restricted to the brain, and the liver may play an important role in defense to oxidative stress found in the disease. Activities of glutathione peroxidase, glutathione reductase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and total content of GSH were decreased by the HPA in the brain of animals and the activity of GCL was increased. In the liver, all enzymes related to GSH metabolism were increased by the HPA. Treatment with LA was able to prevent the enzymatic changes in addition to preventing damage to biomolecules. The overproduction of H2O2 and NO• by HPA model was inhibited by LA treatment. Regarding to GSH metabolism, LA was able to maintain enzyme activities and GSH production at control levels in the brain of animals affected by HPA. According to our results, it is possible that a treatment with antioxidants is effective in maintaining redox homeostasis in patients and may be a novel therapeutic approach additional to dietary treatment already applied to PKU patients.

O sistema calicreína-cinina (SCC) é reconhecido por desempenhar funções que envolvem a manutenção da homeostase do sistema cardiovascular. Novas vias de sinalização intracelulares tem sido propostas devido a ativação desencadeada pelas cininas. O objetivo deste estudo foi avaliar os mecanismos moleculares implicados na sinalização dos receptores para cininas sob a função cardiovascular. Foram utilizados animais knockout dos receptores B1 (B1-/-) e B2 (B2-/-) para cininas. Avaliamos a função contrátil cardíaca e vascular, assim como, medimos em ambos tecidos, coração e aorta torácica, a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS). Para avaliar a expressão das enzimas antioxidantes e que sintetizam o óxido nítrico (NO) foram realizados experimentos de western blot, em coração, para detecção e quantificação destas enzimas, assim como, de estruturas relacionadas com a homeostase do cálcio intracelular. Identificamos redução na tensão sistólica cardíaca (B1-/-: 53% e B2-/-: 52%), entretanto, não foram identificadas alterações na tensão diastólica e frequência cardíaca, pela técnica de Langendorff. Propusemos, a participação do SCC na regulação da função cardiovascular através de vias de sinalização intracelular que promovem a produção de ROS. Detectamos aumento na geração do peróxido de hidrogênio (H2O2, B1-/-: 75% e B2-/-: 54%), superóxido (O2 -, B1-/-: 40% e B2-/-: 41%), explicado pela redução na expressão de enzimas antioxidantes detectadas: superóxido dismutase (B1-/-: 32% e B2-/-: 20%), catalase (B1-/-: 34% e B2-/-: 39%) e glutationa peroxidase (B1-/-: 29% e B2-/-: 25%). Adicionalmente, verificamos aumento na produção do NO (B1-/-: 75% e B2-/-: 36%) e sugerimos que o aumento da expressão das óxido nítrico sintases constitutivas (eNOS: B1-/-: 20% e B2-/-: 23% e nNOS: B1-/-: 27% e B2-/-: 30%) e atividades das mesmas (peNOSSer1177: B1-/-: 161% e B2-/-: 154%; peNOSThr495: B1-/-: 43% e B2-/-: 45%; pnNOSSer852: B1-/-: 25% e B2-/-: 26%) sejam os mecanismos envolvidos. Em conjunto, os resultados descritos, indicam o desenvolvimento do estresse oxidativo em cardiomiócitos de animais B1-/- e B2-/-, e que, possivelmente, este estado, causaria o comprometimento na função sistólica cardíaca através de oxidações e/ou nitrosilações das proteínas envolvidas na remoção citosólica do Ca2+ ou, ainda, repercutiria na redução da expressão da SERCA2a (B1-/-: 41% e B2-/-: 46%) e aumento na expressão do NCX (B1-/-: 16% e B2-/-: 22%). Encontramos elevada resistência coronariana nos grupos B1-/- (38%) e B2-/- (38%) e, sugerimos, que a disfunção endotelial seja a principal causa dessa alteração. Confirmamos esta hipótese através de experimentos de reatividade vascular, onde foi demonstrado prejuízos nos mecanismos vasoconstritores (B1-/-: 66% e B2-/-: 266%) e vasodilatadores (B1-/-: 50% e B2-/-: 56%), e ainda, comprometimento da função da nNOS em aorta de animais dos grupos B1-/- e B2-/-. Verificamos que os receptores B1 ou B2 estão espontaneamente heterodimerizados com a nNOS e eNOS. Desta forma, propomos que a deleção dos receptores para cininas criam perturbações na atividade catalítica da nNOS favorecendo o estado de desacoplamento desta enzima e, consequentemente, comprometendo a biodisponibilidade do NO (B1-/-: 30% e B2-/-: 20%) e gerando exacerbada produção de H2O2 (B1-/-: 30% e B2-/-: 52%) e O2 - (B1-/-: 46% e B2-/-: 69%).

Orientador: Adriana Zerlotti Mercadante / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-18T21:40:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chiste_RenanCampos_D.pdf: 8233764 bytes, checksum: 20989b604d256eba3bcdcfda79445208 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Os compostos bioativos presentes no reino vegetal possuem importantes funções e ações biológicas, podendo ser considerados promotores da saúde humana. Já é reconhecida a associação entre a ingestão de frutas e vegetais e a diminuição do risco de desenvolvimento de diversas desordens crônico-degenerativas, tais como câncer, inflamações, doenças cardiovasculares, catarata, degeneração macular e outras, sendo os carotenóides e compostos fenólicos alguns dos grupos de compostos bioativos aos quais são atribuídas tais ações. As sementes e os extratos de urucum (Bixa orellana L.) são utilizados como corantes nas indústrias alimentícias, farmacêutica e de cosméticos, devido à presença majoritária do carotenóide bixina. Até então, não havia sido relatada na literatura a composição de compostos fenólicos das sementes de urucum. Dessa forma, foi desenvolvido e validado um método por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada aos detectores de arranjo de diodos e espectrômetro de massas (HPLC-DAD-MS/MS) para separar, identificar e quantificar bixina e os compostos fenólicos em semente de urucum. Adicionalmente, foi otimizado um procedimento de extração simultânea desses compostos através da metodologia de superfície de resposta. Além de bixina, conhecida por ser o principal carotenóide em sementes de urucum, a hipolaetina e um derivado de ácido caféico foram identificados, pela primeira vez, como os principais compostos fenólicos. O procedimento otimizado envolveu 15 extrações com acetona:metanol:água (50:40:10, v/v/v) como solvente, razão sólido-líquido de 1:9 (m/v) e 5 min para cada extração em ultrassom. O método cromatográfico proposto foi validado com sucesso para a análise simultânea de compostos fenólicos e bixina em sementes de urucum. Extratos líquidos de urucum com elevada capacidade antioxidante e potencial de cor foram obtidos a partir da extração de bixina e de compostos fenólicos de sementes de urucum utilizando solventes com diferentes polaridades (água, etanol:água, etanol, etanol:acetato de etila e acetato de etila). Os valores mais elevados de compostos fenólicos totais foram encontrados nos extratos obtidos com água, etanol:água e etanol (0,5 mg equivalentes de ácido gálico/mL), e o valor mais elevado de bixina foi encontrado no extrato obtido com etanol:acetato de etila (5,2 mg/mL), que foi caracterizado como o mais vermelho e o mais vívido (a* = 40,5, h°=46,1, C* = 58,4). O extrato obtido com etanol:acetato de etila também apresentou a maior atividade anti-radical livre (4,7 umol equivalente Trolox/mL) e a maior porcentagem de proteção ao triptofano contra o oxigênio singlete (63,6 %). Por outro lado, acetato de etila e a mistura etanol:água foram os solventes menos eficazes para a extração de compostos fenólicos e bixina, respectivamente. De acordo com a análise estatística multivariada, etanol:acetato de etila e acetato de etila foram os solventes mais promissores para obtenção de extratos de urucum com ambas as propriedades antioxidantes e de cor. A partir da extração com diferentes solventes (água, etanol:água, etanol, etanol:acetato de etila e acetato de etila), foram também obtidos extratos liofilizados de urucum, e a capacidade antioxidante na desativação de diferentes espécies reativas de oxigênio (ROS) e de nitrogênio (RNS) foi avaliada. Além disso, os teores de compostos fenólicos e de bixina dos extratos de urucum foram determinados por HPLC-DAD. Todos os extratos de urucum foram capazes de desativar todas as espécies reativas testadas (peróxido de hidrogênio, ácido hipocloroso, oxigênio singlete, radical óxido nítrico, ânion peroxinitrito e radical peroxila), em baixas concentrações na faixa de ?g/mL, com exceção do radical superóxido. O extratos de sementes de urucum obtidos com etanol:acetato de etila e acetato de etila, que apresentaram os maiores níveis de hipolaetina e bixina, respectivamente, foram os extratos com a maior capacidade antioxidante. Adicionalmente, o padrão de bixina apresentou os menores valores de IC50 na desativação de todas as ROS e RNS testadas. O piquiá (Caryocar villosum (Aubl.) Pers), fruta nativa da região Amazônica, pode ser considerado uma fonte inexplorada de compostos bioativos, uma vez que poucos estudos sobre seus constituintes químicos e fitoquímicos estão disponíveis. Dessa forma, a composição química e fitoquímica da polpa de piquiá foi determinada, incluindo a composição de carotenóides e de compostos fenólicos por HPLC-DAD-MS/MS. De acordo com a composição nutricional, água (52 %) e lipídios (25 %) foram os principais componentes encontrados na polpa e o valor energético total foi 291 kcal/100 g. Sobre os compostos bioativos, a polpa apresentou (base seca) maior teor de compostos fenólicos (236 mg equivalentes de ácido gálico/100 g), flavonóides totais (67 mg equivalentes de catequina/100 g) e taninos totais (60 mg equivalentes de ácido tânico/100 g) em relação ao teor de carotenóides totais (7 mg/100 g) e alfa-tocoferol (1 mg/100 g). Os principais compostos fenólicos identificados por HPLC-DAD-MS/MS, foram ácido gálico (182 ug/g polpa), seguido por ácido elágico ramnosídeo (107 ug/g polpa) e ácido elágico (104 ug/g polpa). Os principais carotenóides identificados foram all-trans-anteraxantina (3 ug/g), all-trans-zeaxantina (3 ug/g), all-trans-neoxantina (2 ug/g), all-trans-violaxantina (1 ug/g) e all-trans-?-caroteno (0,7 ug/g). A capacidade anti-radical livre da polpa (3,7 mmol equivalente Trolox/100 g) indica que a polpa pode ser considerada um eficiente sequestrador do radical peroxila. Foram obtidos também extratos liofilizados de polpa de piquiá a partir da extração com diferentes solventes (água, etanol:água, etanol, etanol:acetato de etila e acetato de etila). Todos os extratos naturais foram caracterizados em relação ao teor de compostos bioativos (compostos fenólicos totais, flavonóides, taninos, carotenóides e tocoferóis). Além disso, a capacidade de desativação do radical peroxila, assim como a porcentagem de proteção contra o oxigênio singlete foi determinada para todos os extratos. Os extratos obtidos com água e a mistura etanol:água apresentaram os maiores teores (base seca) de compostos fenólicos totais (9,2 e 6,3 mg de equivalentes de ácido gálico/g, respectivamente), flavonóides totais (3,8 e 2,5 mg equivalente de catequina/g, respectivamente) e taninos totais (7,6 e 2,4 mg de ácido tânico/g, respectivamente). O extrato obtido com etanol:água também apresentou a maior capacidade de desativação do radical peroxila (ORAC) (0,3 mmol equivalente Trolox/g extrato). Por outro lado, o extrato obtido com etanol, que foi classificado como o de cor mais vívida e amarelo (C*ab = 13,7 e b* = 13,3), apresentou o maior teor de carotenóides totais (0,1 mg/g) e maior percentual de proteção contra o oxigênio singlete (10,6 %). Com base nos resultados deste estudo, etanol:água, água e etanol são os solventes mais promissores para obtenção de extratos de piquiá com alto teor de compostos bioativos, proteção contra o oxigênio singlete e capacidade sequestradora do radical peroxila. Portanto, tais informações são importantes para as indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica, sabendo que o piquiá e o urucum são fontes naturais acessíveis de compostos bioativos para serem usados como potencial matéria-prima para obtenção de extratos contra os danos oxidativos em alimentos ou sistemas biológicos / Abstract: The bioactive compounds found in the plant kingdom have important biological functions and actions and may be considered human health promoters. The association between the intake of fruits and vegetables and the decreased risk of developing several chronic-degenerative disorders is already recognized, being the carotenoids and phenolic compounds, groups of the bioactive compounds responsible for such actions. The annatto (Bixa orellana L.) seeds and extracts are used as colourant in the food, pharmaceutical and cosmetic industries, due to the presence of bixin. As far as we are concerned, no information about the composition of phenolic compounds present in the annatto seeds and extracts was reported. Thus, a method by high performance liquid chromatography coupled to diode array detector and mass spectrometer (HPLC-DAD-MS/MS) was developed and validated for separation, identification and quantification of phenolic compounds and bixin in annatto seeds. Furthermore, using response surface methodology, an optimized procedure for simultaneous extraction of both compound classes was established. In addition to bixin, known to be the main carotenoid in annatto seeds, hypolaetin and a caffeoyl acid derivative were identified as the main phenolic compounds. The optimized procedure involved 15 extractions using acetone:methanol:water (50:40:10, v/v/v) as solvent, a solid¿liquid ratio of 1:9 (w/v) and an extraction time of 5 min per extraction in a sonicator. Validation data indicated that the developed HPLC method is suitable for the simultaneous analysis of phenolic compounds and bixin in annatto seeds. Liquid annatto extracts with high antioxidant capacity and colour potential were obtained from annatto seeds by extraction of phenolic compounds and bixin using solvents with different polarities (water, ethanol:water, ethanol, ethanol:ethyl acetate and ethyl acetate). The highest levels of total phenolic compounds were found in the water, ethanol:water and ethanol extracts (0.5 mg gallic acid equivalent/mL), and the highest level of bixin was found in the ethanol:ethyl acetate extract (5.2 mg/mL), which was characterised as the reddest and the most vivid one (a* = 40.5, h° = 46.1, C* = 58.4). The ethanol:ethyl acetate extract also showed the highest antioxidant activity (4.7 umol Trolox equivalent/mL) and the highest percentage of tryptophan protection against singlet oxygen (63.6 %). On the other hand, ethyl acetate and ethanol:water were the least effective solvents for the extraction of phenolic compounds and bixin, respectively. According to the multivariate statistical analysis, ethanol:ethyl acetate and ethyl acetate were the most promising solvents to obtain annatto extracts with both antioxidant and colour properties. From the extraction with different solvents (water, ethanol:water, ethanol, ethanol:ethyl acetate and ethyl acetate), freeze-dried annatto extracts were also obtained, and the capacities to scavenge reactive oxygen (ROS) and reactive nitrogen (RNS) species were evaluated. In addition, the levels of phenolic compounds and bixin in the annatto extracts were determined by HPLC-DAD. All annatto extracts were able to scavenge all the tested reactive species (hydrogen peroxide, hypochlorous acid, singlet oxygen, nitric oxide radical, peroxynitrite anion and peroxyl radical) at low concentration in the ug/mL range, with the exception of superoxide radical. The ethanol:ethyl acetate and ethyl acetate extracts of annatto seeds, which presented the highest levels of hypolaetin and bixin, respectively, were the extracts with the highest antioxidant capacity, and the bixin standard presented the lowest IC50 values. Piquia (Caryocar villosum (Aubl.) Pers), a native fruit from Amazon region, can be considered an unexploited source of bioactive compounds, since few studies about chemical and phytochemical constituents are available. Thus, the chemical and phytochemical composition of piquia pulp was determinaed, including the composition of carotenoids and phenolic compounds by HPLC-DAD-MS/MS. According to the nutritional composition, water (52 %) and lipids (25 %) were the major components found in the pulp and the total energetic value was 291 Kcal/100 g. Regarding the bioactive compounds, the pulp presented (dry basis) higher content of phenolic compounds (236 mg gallic acid equivalent/100 g), total flavonoids (67 mg catechin equivalent/100 g) and total tannins (60 mg tannic acid equivalent/100 g) than total carotenoids (7 mg/100 g) and alfa-tochopherol (1 mg/100 g). The major phenolic compounds identified by HPLC-DAD-MS/MS were gallic acid (182 ug/g pulp), followed by ellagic acid rhamnoside (107 ug/g pulp) and ellagic acid (104 ug/g pulp). The main carotenoids identified were all-trans-antheraxanthin (3 ug/g), all-trans-zeaxanthin (3 ug/g), all-trans-neoxanthin (2 ug/g), all-trans-violaxanthin (1 ug/g) and all-trans-beta-carotene (0.7 ug/g). The antioxidant capacity of the pulp (3.7 mmol Trolox/100 g) indicates that the pulp can be considered a good peroxyl radical scavenger. Freeze-dried extracts of piquia using five solvents with different polarities (water, ethanol:water, ethanol, ethanol:ethyl acetate and ethyl acetate) were also obtained. All natural extracts were characterised in relation to the contents of bioactive compounds (total phenolic compounds, flavonoids, tannins, carotenoids and tocopherols). In addition, the scavenging capacity of all piquia extracts against peroxyl radical, as well as the quenching capacity against singlet oxygen were determined. All the data were used for classification of the piquia extracts applying multivariate statistical analysis. The water and ethanol:water extracts presented the highest levels of total phenolic compounds (9.2 and 6.3 mg gallic acid equivalent/g, respectively), total flavonoids (3.8 and 2.5 mg catechin equivalent/g, respectively) and total tannins (7.6 and 2.4 mg tannic acid/g, respectively). The ethanol:water extract also showed the highest scavenging capacity against peroxyl radical (ORAC) (0.3 mmol Trolox equivalent/g extract). On the other hand, the ethanol extract, which was classified as the most vivid and yellow one (C*ab = 13.7 and b* = 13.3), presented the highest level of total carotenoids (0.1 mg/g) and highest percentage of protection against singlet oxygen (10.6 %). Based on the results of this study, ethanol:water mixture, water and ethanol are the most promising solvents to obtain piquia extracts with high contents of bioactive compounds, protection against singlet oxygen and peroxyl radical scavenging capacity. Therefore, such informations are important for the food, cosmetic and pharmaceutical industries, since piquia and annatto are natural sources of bioactive compounds available for use as a potential raw material to obtain extracts against oxidative damage in foods or biological systems / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos

Sepse, a resposta do organismo a uma infecção, está associada a altas taxas de mortalidade. A razão pela qual um mecanismo protetor resulta num quadro clínico fatal permanece inexplicada. Em trabalho prévio nosso grupo demonstrou que exossomos de origem plaquetária são os mais freqüentes em plasma de pacientes com choque séptico e que estes podem induzir apoptose em células musculares lisas vasculares e células endoteliais em cultura. Demonstramos ainda que tais exossomos possuíam uma fonte enzimática de ROS, uma NADPH oxidase cuja atividade poderia estar associada à indução da apoptose (Janiszewski et al., 2004). No presente trabalho, nós buscamos criar um modelo de geração ex vivo de exossomos similares aos encontrados em pacientes sépticos e identificar possíveis vias responsáveis pela liberação destes e seus efeitos. Choque séptico é uma condição relacionada com exposição a lipopolissacarídeo (LPS) e geração de alta quantidade de trombina, TNF e espécies reativas de nitrogênio. Através de citometria de fluxo revelamos que plaquetas humanas expostas ao doador de NO dietilamina-NONOato e ao LPS geraram exossomos similares àqueles encontrados em pacientes com choque séptico, expondo alta quantidade de tetraspaninas CD9, CD63 e CD81 mas pouca fosfatidilserina. Por outro lado, plaquetas expostas à trombina ou TNF liberaram partículas com características claramente distintas, com alta exposição de fosfatidilserina e baixa de tetraspaninas. Assim como os exossomos sépticos, os exossomos obtidos pela exposição de NO e LPS geraram radical superóxido e NO, como demonstrado pela quimioluminescência da lucigenina (5M) e celenterazinina (5M) e pela fluorescência da 4,5-diaminofluoresceína (10mM) e 2,7-diclorofluoresceína (10mM). A análise por Western Blot nos permitiu identificar as subunidades Nox1, Nox2 e p22phox da NADPH oxidase e a isoforma induzível da enzima NO sintase (NOS) nesses exossomos. Como esperado, inibidores da NOS e da NADPH oxidase reduziram significamente os sinais fluorescentes e quimioluminescentes. Em adição, as células endoteliais em cultura expostas aos exossomos gerados por dietilamina-NONOato e LPS sofreram significativo aumento da taxa de apoptose quando comparadas àquelas expostas a exossomos controle. A inibição da NADPH oxidase assim como da NOS reduziu expressivamente tal efeito. Adição de urato (1mM), mostrou efeito aditivo sobre a inibição do sinal fluorescente, assim como redução adicional da taxa apoptótica, sugerindo papel importante do radical peroxinitrito. Nós propomos, assim, que exossomos derivados de plaquetas podem representar papel adicional no já complexo cenário da sinalização vascular redox. Nesse sentido, uma abordagem baseada em exossomos pode fornecer novas ferramentas para o entendimento e até tratamento da disfunção vascular na sepse / Sepsis, the bodys response to infection, is associated with high mortality rates. Why a protective mechanism turns into a deadly clinical picture is a matter of debate, and goes largely unexplained. In previous work we demonstrated that plateled derived exosomes are found in the plasma of septic patients with septic shock and can induce endothelial and vascular smooth muscle cell apoptosis in culture through an enzymatic superoxide source (Janiszewski et al., 2004). In this work we sought to create a model for ex vivo generation of exosomes, and to identify the pathways responsible for ROS release by exosomes and their effects. Septic shock is a condition related to exposure of lipopolysaccharide (LPS), generation of high amounts of thrombin, TNF and nitrogen reactive species. Through flow cytometry we demonstrated that human platelets exposed to the NO-donor diethylamine-NONOate, and to LPS, generated exosomes similar to those found in the blood of septic shock patients, with high exposure of the tetraspanin CD9, CD63, and CD81, but little phosphatidylserine. On the other hand, platelets exposed to thrombin or TNF released particles with clearly distinct characteristics, such as high phosphatidylserine and low tetraspanin. Like the septic exosomes, the exosomes obtained by NO and LPS exposure generated superoxide radical and NO, as disclosed by lucigenin and coelenterazine chemiluminescence and by 4,5-diaminofluorescein and 2,7-dichlorofluorescein fluorescence. Western Blot analysis revealed the presence of Nox1, Nox2 and p22phox NADPH oxidase subunits and the inducible isoform of NO synthase (NOS) in these exosomes. As expected, NOS inhibitors or NADPH oxidase inhibitors significantly reduced the fluorescence and chemiluminescente signals. In addition, endothelial cells exposed to NO or LPS generated exosomes underwent apoptotic death, while control exosomes had no effects on apoptosis. NADPH oxidase as well as NOS inhibition significantly reduced apoptosis rates. Concomitant generation of NO and superoxide suggests biological effects of the highly reactive radical peroxynitrite. In fact, the peroxynitrite scavenger urate (1 mM) showed an additive effect on fluorescent signal inhibition, as well as on endothelial apoptosis rate reduction. We thus propose that platelet-derived exosomes may be another class of actors in the complex play known as vascular redox signaling. In this sense, an exosome-based approach can provide novel tools for further understanding and even treating vascular dysfunction related to sepsis

Sepse, a resposta do organismo a uma infecção, está associada a altas taxas de mortalidade. A razão pela qual um mecanismo protetor resulta num quadro clínico fatal permanece inexplicada. Em trabalho prévio nosso grupo demonstrou que exossomos de origem plaquetária são os mais freqüentes em plasma de pacientes com choque séptico e que estes podem induzir apoptose em células musculares lisas vasculares e células endoteliais em cultura. Demonstramos ainda que tais exossomos possuíam uma fonte enzimática de ROS, uma NADPH oxidase cuja atividade poderia estar associada à indução da apoptose (Janiszewski et al., 2004). No presente trabalho, nós buscamos criar um modelo de geração ex vivo de exossomos similares aos encontrados em pacientes sépticos e identificar possíveis vias responsáveis pela liberação destes e seus efeitos. Choque séptico é uma condição relacionada com exposição a lipopolissacarídeo (LPS) e geração de alta quantidade de trombina, TNF e espécies reativas de nitrogênio. Através de citometria de fluxo revelamos que plaquetas humanas expostas ao doador de NO dietilamina-NONOato e ao LPS geraram exossomos similares àqueles encontrados em pacientes com choque séptico, expondo alta quantidade de tetraspaninas CD9, CD63 e CD81 mas pouca fosfatidilserina. Por outro lado, plaquetas expostas à trombina ou TNF liberaram partículas com características claramente distintas, com alta exposição de fosfatidilserina e baixa de tetraspaninas. Assim como os exossomos sépticos, os exossomos obtidos pela exposição de NO e LPS geraram radical superóxido e NO, como demonstrado pela quimioluminescência da lucigenina (5M) e celenterazinina (5M) e pela fluorescência da 4,5-diaminofluoresceína (10mM) e 2,7-diclorofluoresceína (10mM). A análise por Western Blot nos permitiu identificar as subunidades Nox1, Nox2 e p22phox da NADPH oxidase e a isoforma induzível da enzima NO sintase (NOS) nesses exossomos. Como esperado, inibidores da NOS e da NADPH oxidase reduziram significamente os sinais fluorescentes e quimioluminescentes. Em adição, as células endoteliais em cultura expostas aos exossomos gerados por dietilamina-NONOato e LPS sofreram significativo aumento da taxa de apoptose quando comparadas àquelas expostas a exossomos controle. A inibição da NADPH oxidase assim como da NOS reduziu expressivamente tal efeito. Adição de urato (1mM), mostrou efeito aditivo sobre a inibição do sinal fluorescente, assim como redução adicional da taxa apoptótica, sugerindo papel importante do radical peroxinitrito. Nós propomos, assim, que exossomos derivados de plaquetas podem representar papel adicional no já complexo cenário da sinalização vascular redox. Nesse sentido, uma abordagem baseada em exossomos pode fornecer novas ferramentas para o entendimento e até tratamento da disfunção vascular na sepse / Sepsis, the bodys response to infection, is associated with high mortality rates. Why a protective mechanism turns into a deadly clinical picture is a matter of debate, and goes largely unexplained. In previous work we demonstrated that plateled derived exosomes are found in the plasma of septic patients with septic shock and can induce endothelial and vascular smooth muscle cell apoptosis in culture through an enzymatic superoxide source (Janiszewski et al., 2004). In this work we sought to create a model for ex vivo generation of exosomes, and to identify the pathways responsible for ROS release by exosomes and their effects. Septic shock is a condition related to exposure of lipopolysaccharide (LPS), generation of high amounts of thrombin, TNF and nitrogen reactive species. Through flow cytometry we demonstrated that human platelets exposed to the NO-donor diethylamine-NONOate, and to LPS, generated exosomes similar to those found in the blood of septic shock patients, with high exposure of the tetraspanin CD9, CD63, and CD81, but little phosphatidylserine. On the other hand, platelets exposed to thrombin or TNF released particles with clearly distinct characteristics, such as high phosphatidylserine and low tetraspanin. Like the septic exosomes, the exosomes obtained by NO and LPS exposure generated superoxide radical and NO, as disclosed by lucigenin and coelenterazine chemiluminescence and by 4,5-diaminofluorescein and 2,7-dichlorofluorescein fluorescence. Western Blot analysis revealed the presence of Nox1, Nox2 and p22phox NADPH oxidase subunits and the inducible isoform of NO synthase (NOS) in these exosomes. As expected, NOS inhibitors or NADPH oxidase inhibitors significantly reduced the fluorescence and chemiluminescente signals. In addition, endothelial cells exposed to NO or LPS generated exosomes underwent apoptotic death, while control exosomes had no effects on apoptosis. NADPH oxidase as well as NOS inhibition significantly reduced apoptosis rates. Concomitant generation of NO and superoxide suggests biological effects of the highly reactive radical peroxynitrite. In fact, the peroxynitrite scavenger urate (1 mM) showed an additive effect on fluorescent signal inhibition, as well as on endothelial apoptosis rate reduction. We thus propose that platelet-derived exosomes may be another class of actors in the complex play known as vascular redox signaling. In this sense, an exosome-based approach can provide novel tools for further understanding and even treating vascular dysfunction related to sepsis