No início da lactação as vacas podem apresentar várias doenças metabólicas e infecciosas, como a mastite, devido às abruptas mudanças fisiológicas, entre elas a supressão da reposta imune, concomitante com a queda da ingestão de matéria seca e da concentração sérica de vitamina E. Com o objetivo de estudar a influência da suplementação de vitamina E nas atividades funcionais dos neutrófilos do leite de bovinos, catorze novilhas da raça holandesa foram divididas aletoriamente em dois grupos, sendo um com sete animais não suplementados (controle) e outro com sete animais suplementados com 1000 UI/dia de vitamina E durante 30 dias antes do parto previsto e 10 dias após o mesmo. Na primeira semana após o parto foi colhido o leite dos quartos mamários CMT negativo, após estimulação da leucocitose com a infusão intramamária de solução de glicogênio de ostra a 0,1% e 0,5%, 36 e 12 horas respectivamente, antes da colheita do leite. As células foram isoladas, contadas e estimou-se a viabilidade das mesmas. Em seguida foram realizados os testes de fagocitose incubando-se zimosan opsonizado (2x108/ml) com neutrófilos (2x107/ml), contados no microscópio óptico. Suspensões na concentração de 2x108/ml de cepas de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis, Escherichia coli e Prototheca zopfii procedendes de casos de mastite clínica bovina foram incubados com neutrófilos (2x107/ml). A solução foi plaqueada antes da incubação para fagocitose, após a fagocitose, após o tratamento com antibióticos e após a lise dos neutrófilos para a determinação dos patógenos destruídos. As análises estatíscas foram feitas através da ANOVA. A porcentagem de células que englobaram três ou mais partículas de zimosan opsonizado foi de 52% no grupo não suplementado e 66% no grupo suplementado (P<0,05). Não foram detectadas diferenças estatísticas para a porcentagem de fagocitose de microrganismos opsonizados, sendo 30,2% e 28,8% para o grupo controle e suplementado, respectivamente. A destruição intracelular de patógenos foi de 99%, não diferindo entre os grupos. Em seguida, determinou-se a produção de O2- e H2O2, sendo 1,6 e 3,0 nmol de O2- e 0,83 e 0,67 &micro;M de H2O2 para o grupo controle e suplementado, respectivamente. A atividade enzimática no grupo controle e suplementado foi de 4,3 e 3,6 &micro;mol/min/mg proteína para a catalase, 43 e 49 nmol/min/mg de proteína para a glutationa redutase, 16,2 e 30 nmol/min/mg proteína para a glutaiona peroxidase, 3,85 e 6,32 U/mg proteína para a superóxido dismutase e 0,67 e 0,29 U/mg proteína para a mieloperoxidase, sendo que não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos. A suplementação com vitamina E aumentou a habilidade fagocitária dos neutrófilos somente no ensaio com zimosan e não alterou a atividade enzimática assim como a produção de espécies reativas de oxigênio. O equilíbrio entre as espécies reativas de oxigênio, importante para a destruição intracelular de patógenos, e os antioxidantes é extremamente complexo, não sendo afetado pela suplementação de um único agente antioxidante / At the early lactation, lactating cows are more exposed to metabolic and infectious diseases as mastitis, due to the physiological modifications accomplished with diminishing of dry matter ingestion, immune response depressed and the vitamin E plasmatic concentration level reduction. Therefore, to study the influence of vitamin E supplementation on the function of milk neutrophils, fourteen primigravid holstein heifers were casually allocated in two groups: one was oral supplemented with vitamin E (1000UI/day) 30 days pre parturition and 10 days post parturition, the other group did not receive vitamin E supplementation (control group). During the first week post-parturition, milk was collected from negative CMT quarter after induction of leucocytosis with a intramammary infusion of oyster glycogen infusion (0,1% e 0,5%, 36 e 12 hours respectively). The cells were isolated from milk, counted and the viability was estimated. After these trials the assays: phagocytosis with opsonized zymosan and phagocytosis with microorganisms that cause mastitis were performed. zymosan opzonized particles (2x108/mL) were incubated with neutrophils (2x107/mL) and counted on the optic microscope. The microorganisms (2x108/mL) Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis, Escherichia coli and Prototheca zopfii were incubated with neutrophils (2.107/mL) from milk. Solution were spread plated pre phagocytosis assay, after phagocytosis, post treatment with antibiotics and after break of neutrophils. The results were analysed from the statistical ANOVA. For the phagocytosis assays, 52% of neutrophils from control group phagocyted three or more zymosan particles, and in the supplemented group, 66% of the cells (P< 0,05). For the microorganisms, did not have statistical difference and the results were 30.7% and 28.2% for the control and supplemented groups. The average of the pathogens intracellular kill was 99% in the both groups. In sequence the tests for production O2- and H2O2, enzimatic activity of catalase, superoxide dismutase, glutathione redutase, glutathione peroxidase and myeloperoxidase were made. It were no detected any statiscal differences in respect to the production of O2- and H2O2. The production of O2- was 1,6 nmol and 3,0 nmol and the H2O2 production was 0,83 &micro;M and 0,67 &micro;M for the groups control and supplemented. The control and supplemented group enzymatic activity results obtained were: catalase 4.3 and 3.6 &micro;mol/min/mg protein, glutathione redutase 43 and 49 nmol/min/mg protein, glutathione peroxidase 16.2 and 30 nmol/min/mg protein, superoxide dismuthase 3.85 and 6.32 U/mg protein and myeloperoxidase 0,67 and 0,29 U/mg protein. In relation to these results it was not detected any statistical difference. Vitamin E supplementation increased zymosan phagocytosis and did not affect enzyme activities involved in the mechanisms of protection against oxigen reactive species and microorganism phagocytosis in the neutrophils. The vitamin E supplementation didn´t change the complex balance among the reactions of antioxidants and oxigen reactive species. It can be concluded that due to the complexity of the mechanisms involved the supplementation with just one isolate antioxidant did not interfered with the defence neutrophil activities

O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antioxidante de extrato de folhas de oliveira (EFO) (Olea europaea L.) por diferentes metodologias analíticas in vitro e in situ, para verificação de efeito em sistemas biológicos. O extrato foi obtido a partir de folhas secas de oliveira, previamente micronizadas, em metanol/água (80/20%) na proporção 1:20 (m/v), após remoção de compostos solúveis em n-hexano. Após liofilização, no EFO foi avaliado o poder redutor por Folin-Ciocalteau, conteúdo de flavonoides totais, teor de oleuropeina, poder de redução do íon férrico (FRAP) e atividade antioxidante sobre DPPHo, ABTSo+, ânion superóxido (O2o-), ácido hipocloroso (HOCl) e óxido nítrico (NOo). O extrato foi também avaliado quanto ao efeito protetor sobre danos oxidativos em eritrócitos humanos. O ácido ascórbico foi utilizado como referência. O experimento foi repetido seis vezes (n = 6) e os ensaios realizados em duplicata. O poder redutor do extrato e o conteúdo de flavonoides totais e oleuropeína foram 131,7 ± 9,4 mg equivalente de ácido gálico/g extrato seco (ms), 19,4 ± 1,3 mg equivalente de quercetina/g ms e 25,5 ± 5,2 mg oleuropeína/g ms, respectivamente. O ensaio de FRAP apresentou 281,8 ± 22,8 mg equivalente de trolox/g ms. O EFO foi efetivo na inibição dos radicais DPPHo e ABTSo+, dependente da concentração de extrato, com valores de IC50 de 13,8 ± 0,8 e 16,1 ± 1,2 &micro;g/mL, respectivamente. Com relação à atividade antioxidante sobre espécies reativas de importância biológica, o EFO apresentou forte capacidade de inibição de O2o- (IC50 = 52,6 ± 2,1 &micro;g/mL) e NOo (IC50 = 48,4 ± 6,8 &micro;g/mL), quando comparado ao ácido ascórbico. Porém, a inibição de HOCl não foi tão eficiente (IC50 = 714,1 ± 31,4 &micro;g/mL). O EFO inibiu a hemólise induzida em eritrócitos de maneira dependente da concentração (IC50 = 7,8 ± 1,1 &micro;g/mL), assim como a peroxidação lipídica e a formação de meta-hemoglobina, com valores de IC50 de 38,0 ± 11,7 e 186,3 ± 29,7 &micro;g/mL, respectivamente. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que extrato de folhas de oliveira possui efetiva atividade antioxidante em sistemas biológicos, pelo efeito sequestrador de determinadas espécies reativas que participam dos processos bioquímicos, e pela prevenção de danos oxidativos em eritrócitos humanos. Portanto, sua ingestão pode estar relacionada com a prevenção de estresse oxidativo in vivo, com consequentes benefícios à saúde. / The aim of this study was to evaluate the antioxidant activity of olive leaf extract (OLE) (Olea europaea L.) by different in vitro and in situ analytical methodologies for determination of its effect in biological systems. The extract was obtained from dried olive leaves, previously micronized, in methanol/water (80/20%) in ratio 1:20 (w/v), after removal of n-hexane soluble compounds. After lyophilization, OLE was analyzed for reducing power by Folin-Ciocalteau, total flavonoid content, oleuropein content, ferric reducing antioxidant power (FRAP) and antioxidant activity against DPPHo, ABTSo+, superoxide anion (O2o-), hypochlorous acid (HOCl), and nitric oxide (NOo). The extract was also analyzed against oxidative damage in human erythrocytes. Ascorbic acid was used as reference. The experiment was repeated six times (n = 6) and the assays were performed in duplicate. The reducing power and total flavonoid and oleuropein contents of extract were 131.7 ± 9.4 mg galic acid equivalent/g dry extract (dw), 19.4 ± 1.3 mg quercetin equivalent/g dw, and 25.5 ± 5.2 mg oleuropein/g dw, respectively. The FRAP assay was 281.8 ± 22.8 mg trolox equivalent/g dw. The OLE was effective in inhibition of DPPHo and ABTSo+ radicals, in a concentration dependent manner, with IC50 values of 13.8 ± 0.8 and 16.1 ± 1.2 &micro;g/mL, respectively. In relation to the antioxidant activity against reactive species of biological importance, the OLE showed high ability to inhibit O2o- (IC50 = 52.6 ± 2.1 &micro;g/mL) and NOo (IC50 = 48.4 ± 6.8 &micro;g/mL), when compared to ascorbic acid. However, inhibition of HOCl was not as efficient (IC50 = 714.1 ± 31.4 &micro;g/mL). The OLE inhibited induced erythrocyte hemolysis in a concentration dependent manner (IC50 = 7.8 ± 1.1 &micro;g/mL) as well as lipid peroxidation and the formation of methemoglobin, with IC50 values of 38.0 ± 11.7 and 186.3 ± 29.7 &micro;g/mL, respectively. The results suggest that olive leaf extract has effective antioxidant activity in biological systems, based on its scavenging effect of certain reactive species that participate in biochemical processes, and the prevention of oxidative damage in human erythrocytes. So, the intake of olive leaf extract may be related to the prevention of in vivo oxidative stress, with health benefits.

Avaliamos importância da NADPH oxidase 2 (NOX2) na produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) em ilhotas de ratas alimentadas ou em jejum, incubadas na presença de 2,8 mM ou 16,7 mM de glicose, associada ou não a leucina, com ou sem inibição da NOX2. As ilhotas dos animais alimentados ou em jejum apresentaram reduzida secreção de insulina e altas concentrações de EROs na presença de 2,8 mM de glicose. Esses parâmetros foram invertidos pela adição de inibidores da NOX2. A leucina, que é metabolizada no Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos, também aumentou a secreção de insulina por aumento de ATP, e diminuiu as EROs, devido ao aumento de NADPH, um substrato do sistema antioxidante. Desse modo, quando as ilhotas são submetidas ao jejum, a diminuição da atividade secretória é fundamental para impedir que quantidades maiores de hormônio sejam secretadas, podendo levar a uma hipoglicemia. Porém, na presença de alta concentração de glicose, a ativação das defesas antioxidantes da célula b atenua o excesso de EROS, liberando a secreção de insulina. / We sought to evaluate the importance of NADPH oxidase 2 (NOX2) in the production of reactive oxygen species (ROS) in islets from rats fed or fasted, incubated in the presence of glucose 2.8 mM or 16.7 mM, with or without leucine or inhibition of NOX2. Islets of fed or fasted animals showed reduced insulin secretion and high concentration of ROS in the presence of 2.8 mM glucose. These parameters were reversed by addition of inhibitors NOX2. Leucine that is metabolized in the cycle of Tricarboxylic Acids (TCA) also increased insulin secretion, by increasing ATP, and ROS decreased due to the increase of NADPH, a substrate of the antioxidant system. Thus, when the islets are subjected to fasting, decreased secretory activity is essential to prevent amounts of the hormone be secreted and may lead to hypoglycaemia. However, in the presence of high glucose levels, activation of antioxidant defenses of b cell attenuates the excess of ROS, releasing insulin secretion.

O uso recreacional e os efeitos deletérios de drogas lícitas e/ou ilícitas é considerado um problema de saúde pública. Dentre estas drogas destaca-se a cetamina, um anestésico empregado na veterinária e o etanol, a droga lícita mais utilizada. Além dos efeitos centrais, estudos revelam que a cetamina e o etanol possuem propriedades imunomodulatórias. No entanto, poucos estudos são realizados com a associação destas drogas; assim, o objetivo deste estudo foi o de avaliar os efeitos tóxicos, imunotóxicos, o potencial oxidativo e os possíveis efeitos neurotóxicos resultantes do consumo associado ou não das mesmas. Para isso, ratos Wistar foram tratados uma vez ao dia, por até 28 dias, com injeções intraperitoneais (15 ou 30mg/kg/PV) de cetamina (K) ou com etanol a 10% (E) via oral (gavagem ou adicionado a água de bebida), ou ainda em associação (KE). O grupo controle recebeu apenas os veículos dos tratamentos. Ao final do experimento, os animais foram submetidos à eutanásia para realização de avaliações toxicológicas, imunológicas, oxidativas e antioxidativas, e de neurotransmissores centrais. Os resultados revelaram redução no ganho de peso dos animais tratados com KE e aumento de ácido ascórbico urinário. A redução de pH e glicose urinária foi observada nos grupos E e KE. Na bioquímica, todos os grupos apresentaram aumento de HDL, porém a associação das drogas levou a um aumento do colesterol, enquanto no grupo K, observou-se diminuição dos triglicérides e da fosfatase alcalina. Ainda, somente o grupo KE apresentou alterações na função renal. Todos os grupos experimentais exibiram alterações histopatológicas hepáticas e/ou vesicais. Os grupos E e KE apresentaram alterações no número de células mieloides e linfoides concomitantes ao aumento na celularidade de medula óssea. Apenas animais do grupo KE apresentaram alteração na resposta do tipo Th2. Foi observado o aumento da peroxidação lipídica nos animais tratados com K, bem como aumento na atividade de GPx e CAT e do conteúdo de GSSG dos animais tratados com E e/ou KE nos órgãos analisados. Ao nível central, observou-se elevação dos níveis de DA e NOR no hipocampo dos animais do grupo E, e 5HT nos animais do grupo K; além de aumento de DA e 5HT no córtex pré-frontal dos animais dos grupos E e K, respectivamente. Assim, concluímos que a associação KE promove redução do ganho de peso não relacionado ao consumo de ração. O etanol, em associação ou não, promove alterações nos parâmetros urinários; a cetamina promove diminuição nos níveis de FA e as drogas quando em associação alteram o perfil lipídico e renal na dependência da dose e do tempo de administração. Efeitos pró-oxidantes entraram em equilíbrio devido à ação de antioxidantes. O etanol, em associação ou não, promove alterações em células do sistema imune, no entanto, sem promover imunomodulação sobre suas respostas. O etanol e/ou a cetamina também promovem alterações histopatológicas hepáticas, enquanto que a associação ainda promove lesões vesicais. Além disso, ambas as drogas promovem alterações no perfil neuroquímico central; porém, quando associadas não promoveram efeitos sinérgicos sobre os parâmetros avaliados. / The recreational use and the deleterious effects of licit and/or illicit drugs are considered a public health issue. Among these drugs are ketamine, used in veterinary anaesthesia, and ethanol the most commonly licit drug. Besides their central effects, studies have shown that ketamine and ethanol have immunomodulatory properties. However, few studies are conducted with the association of both drugs; thus, we aimed to evaluate the toxic and immunotoxic effects, as well the oxidative potential and the possible neurotoxic effects resulted from the consumption of these drugs associated or not. For this, Wistar rats were treated once daily for up to 28 days with intraperitoneal injections (15 or 30mg/kg/BW) of ketamine (K) or orally with 10% ethanol (E) (gavage or drinking water) or the association of both treatments (KE). Control group received only vehicles. At the end of the experimental period, the animals were euthanized for toxicological, immunotoxicological, oxidative stress and antioxidant status evaluation, and central levels of neurotransmitters. KE animals showed reduced body weight gain and increased levels of urinary ascorbic acid. Reduction of urinary pH and glucose was observed in E and KE groups. Biochemistry analysis showed an increase in HDL levels in all experimental groups; although, KE showed an increase in cholesterol levels, while K group exhibited reduction in triglycerides and alkaline phosphatase (ALP) levels. Only KE group showed renal function alterations. All experimental groups showed hepatic and/or bladder histopathology alterations. E and KE groups exhibited alterations in myeloid and lymphoid cells number with concomitant increased in bone marrow cellularity. Only animals of KE group presented changes in Th2 response. Increased in lipid peroxidation was observed in K-treated animals, as well as GPx and CAT activities and GSSG content of animals treated with E and/or KE. We observed elevation in DA and NOR in hippocampus of E group and 5HT in K group, in addition to an increase in DA and 5HT of the prefrontal cortex of E and K groups, respectively. Thus, we conclude that KE association promotes reduction in body weight gain not related to food consumption. Ethanol, in combination or not, promotes urinary alterations; ketamine reduces ALP levels and the drugs, when in combination, alter lipid and renal profile depending on dose and time of administration. Pro-oxidant effects were balanced due to the action of antioxidants. Ethanol, associated or not, promotes alterations on immune cells without immunomodulatoty responses. Ethanol and/or ketamine also promotes liver histopathological alterations, while this association promotes bladder lesions. In addition, both drugs promote changes in central neurochemical levels; however, when associated do not promoted synergistic effects in evaluated parameters.

A caprinocultura no Brasil vem crescendo consideravelmente nos últimos anos. No entanto, este crescimento é limitado pela qualidade espermática pós-descongelamento, o que inviabilizaria a utilização de biotecnologias aplicadas à reprodução (e.g., inseminação artificial e transferência de embriões). Um dos motivos para a queda na qualidade espermática pós-descongelação é o ataque das espécies reativas de oxigênio (ROS), que podem levar a danos em membrana, acrossomo, mitocôndria e DNA. Uma alternativa para a melhora na qualidade espermática de amostras criopreservadas de caprinos seria o tratamento do meio diluidor com a antioxidantes. No entanto, é fundamental identificar a espécie reativa de oxigênio mais deletéria ao sêmen de caprinos para determinar o antioxidante ideal. O objetivo do presente estudo foi identificar a ROS mais deletéria ao sêmen de caprinos e, com isso, tratar o diluidor com antioxidantes específicos para a destruição da mesma. No experimento 1, amostras espermáticas de 12 bodes foram submetidas á incubação com 3 sistemas de produção de ROS e um subproduto da peroxidação de lipídeos, conhecida por também levar a danos oxidativos. As amostras espermáticas foram submetidas a incubação com xantina (20mM) e xantina oxidase (ânion superóxido), sulfato de ferro (4mM) e ascorbato (20mM- Radical hidroxila), peróxido de hidrogênio (H2O2; 20 mM) e malondialdeído (20 mM). Após a incubação as amostras espermáticas foram avaliadas quanto a morfologia, motilidade, membrana (eosina/nigrosina), acrossomo (Rosa Bengala/ Fast Green), mitocôndria (3,3 diaminobenzidina) e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS, avalia a susceptibilidade do espermatozóide ao estresse oxidativo). Os resultados do experimento 1 indicaram que a ROS mais deletéria ao espermatozóide caprino é o H2O2, que levou a danos de membrana plasmática e mitocôndria. Assim, no Experimento 2, o diluidor para a criopreservação do sêmen caprino foi suplementado com catalase e Glutationa Peroxidase (GPx), antioxidantes enzimáticos responsáveis pela destruição do H2O2. A análise estatística dos dois experimentos foi realizada através do SAS system for Windows. Os resultados do experimento 2 não revelaram efeitos benéficos para nenhuma das variáveis e com a utilização de ambos os antioxidantes. De fato, a catalase apreesntou efeitos deletérios à membrana plasmática das amostras criopreservadas com 240 UI/mL de catalase quando comparadas ao controle (13,42&plusmn;2,96% e 25,08&plusmn;4,80% de espermatozóides com membrana íntegra, respectivamente). De fato, estudos anteriores indicam que as concentrações de catalase em sêmen de caprinos são extremamente baixas, o que indicaria que o tratamento com as dosagens utilizadas de catalase pode ter sido excessivo. Além disto, diferentes antioxidantes aparentemente atuam em diferentes regiões do espermatozóide, sendo que, apenas a combinação de diferentes antioxidante poderia ser eficiente. Por outro lado, os resultados do Experimento 1 foram obtidos em amostras frescas, sendo que provavelmente, em amostras criopreservadas, a espécie reativa mais deletéria poderia ser outra. / The goat production in Brazil has grown considerably in recent years. However, this growth is limited by the post-thaw sperm quality, which would impais the use of biotechnologies applied to reproduction (e.g., artificial insemination and embryo transfer). One reason for the decline in sperm quality after thawing is the attack of reactive oxygen species (ROS), which can lead to damage of membrane, acrosome, mitochondria and DNA. An alternative to improve the quality of cryoprerved goat sperm samples would be the treatment of the extender with antioxidants. However, it is crucial to identify the reactive oxygen species more deleterious to semen of goats to determine the ideal antioxidant. The aim of this study was to identify the ROS more deleterious to semen of goats and thereby to treat the extender with specific antioxidants for the destruction of this ROS. In experiment 1, sperm samples from 12 goats were incubated with 3 systems of production of ROS and a by-product of lipid peroxidation, known to also lead to oxidative damage. The sperm samples were subjected to incubation with xanthine (20 mM) and xanthine oxidase (superoxide anion), iron sulfate (4 mM) and ascorbate (20mM-hydroxyl radical), hydrogen peroxide (H2O2, 20 mM) and malondialdehyde (20 mM). After incubation the samples were evaluated for sperm morphology, motility, membrane (eosin / nigrosin), acrosome (Rose Bengal / Fast Green), mitochondria (3.3 diaminobenzidine) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS, assesses the susceptibility of sperm to oxidative stress). The results of experiment 1 indicated that ROS most deleterious to the goat sperm is the H2O2, especially due to damages to the plasma membrane and mitochondria. Thus, in Experiment 2, the extender for cryopreservation of goat semen was supplemented with catalase and glutathione peroxidase (GPx), enzymatic antioxidants responsible for the destruction of H2O2. Statistical analyses were performed using the SAS system for Windows. The results of experiment 2 revealed no beneficial effects of the use of neither catalase oor GPx. In fact, catalase showed deleterious effects on the plasma membrane of cryopreserved samples; Samples treated with 240 IU / mL of catalase showed a lower percentage of sperm with intact membrane when compared with controls (13.42 &plusmn; 2.96 &plusmn; 4.80% and 25.08%, respectively ). In fact, previous studies indicate that concentrations of catalase in semen of goats are very low, which indicates that catalase treatment with the dosages used in the present study may have been excessive. Apparently different antioxidants work in different regions of the sperm, and only the combination of different antioxidant could be effective. Moreover, the results of Experiment 1 were obtained in fresh samples, and probably, in cryopreserved samples, other ROS could be the most deleterious.

A fotoquimioterapia (FQT) é uma técnica de tratamento de doenças graves, inclusive o câncer, que utiliza que utiliza compostos que, sendo introduzidos dentro de um organismo, não possuem alguma atividade contra ele e quando são excitados, através de luz na região espectral de 320 até 800 nm, produzem espécies reativas que induzem a morte celular. Dentre as formas desenvolvidas em FQT, a de maior destaque, e a que vem sendo mais utilizada em clínica, é a Terapia Fotodinâmica (TFD). Apesar das vantagens do uso da TFD, esta técnica possui limitações em sua eficiência, pois seu mecanismo está associado com à formação dos estados excitados do FS e do oxigênio molecular e, por isso, depende dos tempos de vida e rendimentos quânticos destes estados. Outro fator que limita a ampla aplicação da FQT na clínica é o alto custo dos FS utilizados atualmente. No grupo de fotobiofísica do Departamento de Física e Matemática da FCLRP-USP, tem-se trabalhado na busca de novos FS que possuam espécies reativas não excitados como, por exemplo, os radicais livres (peróxidos, ânion superóxido, radical hidroxila etc.), e que sejam mais viáveis economicamente em relação a outros FS já existentes no mercado. Os derivados de nitrofurano são fármacos já utilizados na rotina clínica que possuem as características promissoras para aplicação em FQT. Este trabalho dá continuidade à busca de novos FS. Escolhemos dentre inúmeros derivados de nitrofurano a Nitrofurantoína (NFT), que já é utilizada em clínica desde 1950, e que possui um custo baixo. Sua atividade fototóxica já foi documentada como reações fotoalérgicas em pacientes depois de ser administrada e nos estudos in vitro contra diversas linhagens das células neoplásicas. Contudo, os mecanismos e a dinâmica da fotoação da NFT não estavam ainda bem estabelecidas. Como objetivos gerais deste trabalho, definimos estudar a dinâmica da fotodecomposição da NFT e a liberação de radical NO em soluções aquosas, em função da composição do ambiente, tendo em vista analisar sua potencialidade para aplicação em fotoquimioterapia de diversas doenças, inclusive o câncer. Demonstramos que durante a sua fototransformação, a NFT libera o NO, e o rendimento do processo depende do estado de protonação da NFT. A liberação de NO se realiza por duas vias paralelas: liberação direta pela molécula de NFT e através da fotólise do seu fotoproduto. O estado tripleto da NFT apresenta tempo de vida (t) muito curto, provavelmente devido à participação ativa em formação de um dos fotoprodutos. Pelo fato de ser muito curto, é pouco provável que o estado T1 produza efetivamente, o oxigênio singleto. Assim, podemos associar a fotoatividade da NFT com a liberação de NO. Por fim, propusemos um esquema para a fotoliberação de NO pela fototransformação da NFT. / Photochemotherapy (PCT) is a technique applied in the treatment of serious diseases. For example in cancer, the PCT uses compounds that are introduced into an organism that do not have some activity against him, and that when are excited with light, in the spectral region from 320 to 800 nm, produces reactive species that induce the cell death. The photodynamic therapy (PDT) is the most widely used PCTtechnique in clinical applications. Despite the advantages of the use of PDT, this technique has efficiency limitations, because the PDT mechanism is associated with the formation of excited states in photosensitizer (PS) and in molecular oxygen and therefore, depends on the lifetimes and quantum yields of these states. Another limiting factor of the PDT in more PCT clinical applications is the high cost of the PS used today. The photo-biophysic group of the Department of Physics and Mathematics of the FFCLRP-USP has been working on searching of new PS without reactive species with exited states and cheaper than others PS on the market. For example, our group has investigated the free radicals: peroxide, superoxide anion, hydroxyl radical. This work continues the search for new PS. We chose the Nitrofurantoin (NFT), a nitrofuran derivative, which it is used in clinical applications since 1950 and have a low cost. The nitrofuran derivatives are drugs used in clinical applications with promising characteristics for applications in PCT. The photo-toxic activity of the NFT has been observed in photo-allergic reactions of patients and in vitro studies of several neoplastic cell lines. However, the NFT photo- action mechanisms and kinetics are not well established. The objective of this work was the study of the photo-decomposition dynamics of the NFT and the delivery of the NO radical in aqueous solutions depending on the composition of the environment, aiming to analyze its potential for application in PCT of several diseases, including cancer. In this work we demonstrated that during the photo-transformation, the NFT delivery NO and the yield of this process depends on the protonation state of the NFT. We observed that the NO delivery is made of two parallels ways: a direct delivery by NFT molecule and a delivery by photolysis of their photo-products. Probably due to the active participation in the photo-products formation we observed that the triplet state of NFT has very short lifetime (T) and therefore, it is not expected that the state T1 produces singlet oxygen. Thus, we can associate the NFT photo-activity with the NO delivery. Finally, this work proposes a scheme for NO photo-delivery using the NFT photo-transformation.

Microcistinas (MCs) são heptapeptídeos cíclicos produzidos por cianobactérias e possuem potente hepatotoxicidade e atividade promotora de tumor. Em intoxicações agudas induzidas por MCs ocorre infiltração leucocitária no foco inflamatório. Embora os mecanismos de hepatotoxicidade não são claros, o recrutamento de neutrófilos no fígado pode contribuir ao dano tecidual e desenvolvimento tumoral causados por xenobióticos. O objetivo dessa tese foi investigar os efeitos de três estruturalmente distintas MCs (MC-LA, MC-YR e MC-LR) nas seguintes funções de neutrófilos: síntese e expressão de moléculas de adesão, rolamento, adesão, migração e liberação de citocinas e de ROS. Nos ensaios de migração em bolsa de ar, as três MCs induziram similarmente a migração de leucócitos in vivo em tecido subcutâneo de ratos e diferencialmente a secreção de citocinas pró-inflamatórias (CINC, IL-1&#946;, TNF-&#945;, VEGF-&#945; e MIP) no exsudato. Concentrações elevadas de CINC-2&#945;&#946; foram encontradas nos exsudatos inflamatórios de animais após injeção de MC-LA, MC-LR ou MC-YR. MIP-2 elevou-se apenas em exsudatos de animais expostos a MC-LR. Não foram observadas alterações em secreção de IL-1&#946;, TNF-&#945; e VEGF-&#945;. Estudos de microscopia intravital mostraram que apenas a aplicação tópica de MC-LR reforçou o rolamento e a adesão de leucócitos no endotélio de vênulas mesentéricas pós-capilares. Esses últimos resultados podem ser dependentes de aumento e expressão da síntese da L-selectina e &#946;2-integrina nos neutrófilos, tal como avaliado por FACS e PCR-RT, respectivamente. Adicionalmente, em ensaios em câmara de Boyden in vitro, as três MCs promoveram locomoção direta de neutrófilos e aumentaram a migração dessas células em resposta ao fMLP, além do aumento de cálcio intracelular observado por microscopia confocal. Os efeitos das MC-LA, MC-YR e MC-LR em neutrófilos humanos e de ratos tiveram o mesmo padrão de resposta. A análise de viabilidade celular, fragmentação de DNA, despolarização de membrana mitocondrial e liberação de ROS intracelulares foram avaliadas pela técnica de FACS. A concentração de ROS extracelular foi medida por quimiluminescência amplificada por lucigenina. A produção de citocinas em células tratadas foram determinadas por ELISA. Observamos aumento da liberação de IL-8, CINC-2&#945; &#946; e da concentração de ROS extracelular por neutrófilos humanos e de ratos pela exposição dessas células com as MCs. Os resultados aqui obtidos mostram o efeito pró-inflamatório direto das MC-LA, MC-YR e MC-LR. A possibilidade de os neutrófilos migrarem e responderem localmente a MCs contribui para a toxicidade destas toxinas. / Microcystins (MCs) are a family of heptapeptide toxins produced by some genera of Cyanobacteria. MCs have potent hepatotoxicity and tumor-promoting activity. Leukocyte infiltration in the liver was observed in MC-induced acute intoxication. Although the mechanisms of hepatotoxicity induced by MCs are still unclear, neutrophil infiltration in the liver may play an important role in triggering toxic injury and tumor development. The purpose of this thesis was to investigate the effects of three structurally distinct MCs (MC-LA, MC-YR and MC-LR) in the neutrophil functions: synthesis and expression of adhesion molecules, rolling, adhesion, migration and release of cytokines and ROS. In migration assays of the air pouch, the three MCs similarly induced the migration of leukocytes in vivo in subcutaneous tissue of rats and differentially the secretion of pro-inflammatory cytokines (CINC-2&#945;&#946;, IL-1-&#946;, TNF--&#945;, VEGF- &#945; and MIP-2) in exudates. Elevated concentrations of CINC-2&#945;&#946; were found in the inflamed exudates from animals injected with MC-LA, MC-LR or MC-YR, although MIP-2 was only detected in the exudates from animals injected with MC-LR. There were no changes in the secretion of IL-1-&#946;, TNF-&#945; and VEGF--&#945;. Intravital microscopic studies showed that topical application of MC-LR enhanced the numbers of rolling and adhered leukocytes in the endothelium of postcapillary mesenteric venules. The latter effects may be dependent upon induction of the synthesis and expression of L-selectin and -&#945;2-integrin in neutrophils, as assessed by flow cytometry and RT-PCR, respectively. Conversely, the three toxins promoted direct locomotion of neutrophils and enhanced their migration in response to fMLP, as measured by Boyden chamber assays, and increased intracellular calcium, a messenger in the chemotaxic process. The effects of MC-LA, MC-YR and MC-LR in human neutrophils and mice had the same pattern of response. The analyses of cell viability, DNA fragmentation, mitochondrial membrane depolarization of and release of intracellular ROS were evaluated by the technique of FACS. Extracellular ROS content was measured by lucigenin-amplified chemiluminescence, and cytokines were determined by ELISA. We found that these MCs increased interleukin-8 (IL-8), cytokine-induced neutrophil chemoattractant-2&#945;&#946; (CINC-2&#945;&#946;) and extracellular ROS levels in human and rat neutrophils. In conclusion, our results showed that MCs act on specific pathways of neutrophil recruitment, indicating their potential effect on neutrophils activation. This process can significantly contribute to the pathogenesis of hepatic damage due to generation of ROS by neutrophils as well as act on hepatocytes under such conditions and potentially increase injury processes induced by MCs.

Diferentes modelos experimentais podem ser empregados no estudo da injúria às fibras nervosas periféricas, sendo este um modelo de dor neuropática. Inúmeros estudos vêm relatando a participação de espécies reativas de oxigênio (EROs) no processamento da informação nociceptiva e na perpetuação de anormalidades decorrentes da secção nervosa periférica (Kim et al, 2004; Gao et al, 2007). A informação nociceptiva percorre desde centros de processamento espinais até as regiões mais superiores do neuroeixo, incluindo o córtex cerebral. Neste sentido, alguns pesquisadores observaram que a axotomia periférica promove alterações em regiões supraespinais (Pankova, 2009; Taschibana et al, 2008). Porém são escassos ou mesmo inexistentes os trabalhos que avaliam o envolvimento das espécies reativas e das defesas antioxidantes neste modelo experimental, nas regiões encefálicas e, especialmente, em distintas espécies animais, o que proporcionaria uma abordagem comparativa. Assim, este trabalho avaliou parâmetros de estresse oxidativo e defesas antioxidantes em regiões encefálicas de duas espécies distintas de vertebrados, rãs e ratos, em condições basais e após a secção do nervo isquiático. Para tanto se empregaram ratos Wistar e rãs Rana catesbeiana, machos, adultos, os quais foram separados nos seguintes grupos experimentais: controle (animais sem qualquer manipulação cirúrgica) e desnervados (animais com secção do nervo isquiático). As diferentes espécies foram mortas por decapitação aos três e sete dias após os procedimentos cirúrgicos. Nos ratos ainda separou-se um grupo sham (animais onde o nervo foi exposto, porém não seccionado), sendo estes mortos nos mesmos intervalos de tempo. As estruturas nervosas centrais escolhidas para estudo foram o neocórtex e tronco encefálico, nos ratos, e prosencéfalo e tronco encefálico nas rãs. Para avaliação dos parâmetros oxidativos realizaram-se as medidas das atividades antioxidantes das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa transferase (GST), além da quantificação do teor de ácido ascórbico e grau de lipoperoxidação nas regiões encefálicas das diferentes espécies. No encéfalo de ratos e rãs em estado basal, a SOD e o ácido ascórbico apresentaram valores semelhantes entre as espécies, com concentração de ácido ascórbico ligeiramente maior em tronco encefálico de rãs. As atividades da GST e CAT foram peculiares entre as espécies de animais, sendo o valor da atividade da CAT aproximadamente o dobro daquele observado em rato nas duas regiões encefálicas, e o da GST maior apenas no prosencéfalo de rãs. Aos três dias após a secção do nervo isquiático, observou-se aumento significativo da lipoperoxidação nas duas regiões encefálicas de ratos, porém nas rãs este acréscimo foi observado aos 3 e 7 dias no prosencéfalo e apenas aos 3 dias no tronco encefálico. Nos ratos a atividade da CAT aumentou apenas no córtex, não mostrando qualquer modificação significativa nos tecidos de rãs. A enzima SOD mostrou aumento em sua atividade nas duas regiões encefálicas de ratos nos períodos experimentais em estudo, mas teve esta atividade reduzida nas regiões encefálicas de rãs aos 3 dias após a axotomia periférica. Os ratos do grupo sham também mostraram aumentos em seus valores de lipoperoxidação nas regiões estudadas, mas apenas aos 3 dias após a lesão. Os valores de ácido ascórbico não variaram significativamente nas regiões do encéfalo de ratos, mas tiveram aumento significativo nas regiões de rãs aos 7 dias. Diferentemente dos ratos, as regiões encefálicas de rãs diminuíram a atividade da GST aos 3 dias após a secção nervosa periférica. Estes resultados mostram que a secção nervosa periférica, bem como as diferentes intensidades de estimulação nociceptiva (grupos sham e desnervado), é capaz de alterar o estado redox das células em estruturas encefálicas de distintas espécies de vertebrados. Além disso, a injúria nervosa periférica parece ativar diferentes mecanismos de defesa antioxidante no encéfalo de rãs e ratos.

A capacidade de preservar a viabilidade do sêmen pelo emprego das biotecnologias, como refrigeração e criopreservação, oferece muitas vantagens a equideocultura. O estresse oxidativo é um dos principais entraves para estas biotecnicas e advêm do ataque de distintas espécies reativas de oxigênio (EROs). Assim, o objetivo do presente estudo foi verificar o impacto das diferentes EROs sobre os espermatozoides com e sem plasma seminal. Foram colhidos ejaculados de 13 garanhões Mangalarga Marchador de fertilidade conhecida. Os ejaculados foram divididos em duas frações (A e B). As frações foram centrifugadas (2200g/10min) e o pellet com os espermatozoides foi ressuspendido em solução salina fisiológica ou plasma seminal de modo que as duas frações apresentassem a mesma concentração final (sptz/mL). Ambas as frações (A e B) tiveram 4 alíquotas de 400&micro;L retiradas e submetidas a 3 sistemas distintos de produção de EROs (xantina + xantina oxidase que produz anion superóxido; peróxido de hidrogênio; ferro + vitamina C que produz radical hidroxil) e malondialdeído. Após a incubação, as amostras A e B foram avaliadas de acordo com os testes funcionais (coloração de eosina-nigrosina para membranas, fast-green/rosa bengala para acrossomos, coloração 3-3&#39;diaminobenzidina para atividade mitocondrial e SCSA&trade; para susceptibilidade a denaturação de cromatina) e avaliação do índice de peroxidação lipídica (TBARs).Todas as análises estatísticas foram realizadas pelo programa SAS System for Windows. A susceptibilidade do espermatozoide equino ao estresse oxidativo é variável de acordo com a espécie reativa de oxigênio empregada na incubação; as espécies mais deletérias no presente experimento foram a malondialdeído e principalmente o radical hidroxil o que já era esperado. Houve um efeito benéfico quanto a manutenção das funções celulares e status oxidativo em amostras cujo plasma seminal foi preservado. A proteção atribuída ao plasma seminal influenciou parâmetros como atividade mitocondrial, susceptibilidade a denaturação acida da cromatina e índice de peroxidação lipídica. O plasma seminal exerceu mais pronunciada proteção aos eventos desencadeados pela malondialdeído / Biotechnologies such as chilling and cryopreservation of equine semen have been largely used in horse breeding due to its importance on storage and propagation of genetic material. The oxidative stress is one of the main causes of poor results related to the fertility of processed stallion sperm. Oxidative injuries are mainly due to the attack of different reactive oxygen species (ROS). Thus, the aim of the present study was to evaluate the impact of distinct ROS attack on equine spermatozoa with and without seminal plasma. The collection of one ejaculate of thirteen Mangalarga fertile stallions were performed. Ejaculates were divided in two aliquots (A and B). These aliquots were centrifuged (600G /10 min) and pellets were resuspended in saline solution (0,9%) or seminal plasma certifying that each sample had the same concentration (sptz/mL). Both aliquots (A and B) were divided in four samples of 400 &micro;L each and incubated with four ROS generating systems (superoxide anion; hydrogen peroxide; hydroxil radical and malondialdehyde). After the 30 incubation, all the samples were evaluated for membrane integrity (eosin-nigrosin stain), acrosome integrity (simple stain of fast-green/ Bengal rose), 3-3&#39;diaminbenzidine for mitochondrial activity and SCSA&trade; for the chromatin suceptibility to the acid denaturation. Lipid peroxidation was accessed by TBARs assay. Statistical analysis was performed using SAS System for Windows. The susceptibility of equine sperm to the oxidative stress is different in each ROS generation system; but the most deleterious ROS were hydroxyl radical and malondialdehyde. A positive effect of seminal plasma on the sperm viability was observed which may be linked to its protective role. The protection occurred in mitochondria, chromatin and against lipid peroxidation. Higher beneficial effect of seminal plasma was observed in samples treated with malondialdehyde

No início da lactação as vacas podem apresentar várias doenças metabólicas e infecciosas, como a mastite, devido às abruptas mudanças fisiológicas, entre elas a supressão da reposta imune, concomitante com a queda da ingestão de matéria seca e da concentração sérica de vitamina E. Com o objetivo de estudar a influência da suplementação de vitamina E nas atividades funcionais dos neutrófilos do leite de bovinos, catorze novilhas da raça holandesa foram divididas aletoriamente em dois grupos, sendo um com sete animais não suplementados (controle) e outro com sete animais suplementados com 1000 UI/dia de vitamina E durante 30 dias antes do parto previsto e 10 dias após o mesmo. Na primeira semana após o parto foi colhido o leite dos quartos mamários CMT negativo, após estimulação da leucocitose com a infusão intramamária de solução de glicogênio de ostra a 0,1% e 0,5%, 36 e 12 horas respectivamente, antes da colheita do leite. As células foram isoladas, contadas e estimou-se a viabilidade das mesmas. Em seguida foram realizados os testes de fagocitose incubando-se zimosan opsonizado (2x108/ml) com neutrófilos (2x107/ml), contados no microscópio óptico. Suspensões na concentração de 2x108/ml de cepas de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis, Escherichia coli e Prototheca zopfii procedendes de casos de mastite clínica bovina foram incubados com neutrófilos (2x107/ml). A solução foi plaqueada antes da incubação para fagocitose, após a fagocitose, após o tratamento com antibióticos e após a lise dos neutrófilos para a determinação dos patógenos destruídos. As análises estatíscas foram feitas através da ANOVA. A porcentagem de células que englobaram três ou mais partículas de zimosan opsonizado foi de 52% no grupo não suplementado e 66% no grupo suplementado (P<0,05). Não foram detectadas diferenças estatísticas para a porcentagem de fagocitose de microrganismos opsonizados, sendo 30,2% e 28,8% para o grupo controle e suplementado, respectivamente. A destruição intracelular de patógenos foi de 99%, não diferindo entre os grupos. Em seguida, determinou-se a produção de O2- e H2O2, sendo 1,6 e 3,0 nmol de O2- e 0,83 e 0,67 &micro;M de H2O2 para o grupo controle e suplementado, respectivamente. A atividade enzimática no grupo controle e suplementado foi de 4,3 e 3,6 &micro;mol/min/mg proteína para a catalase, 43 e 49 nmol/min/mg de proteína para a glutationa redutase, 16,2 e 30 nmol/min/mg proteína para a glutaiona peroxidase, 3,85 e 6,32 U/mg proteína para a superóxido dismutase e 0,67 e 0,29 U/mg proteína para a mieloperoxidase, sendo que não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos. A suplementação com vitamina E aumentou a habilidade fagocitária dos neutrófilos somente no ensaio com zimosan e não alterou a atividade enzimática assim como a produção de espécies reativas de oxigênio. O equilíbrio entre as espécies reativas de oxigênio, importante para a destruição intracelular de patógenos, e os antioxidantes é extremamente complexo, não sendo afetado pela suplementação de um único agente antioxidante / At the early lactation, lactating cows are more exposed to metabolic and infectious diseases as mastitis, due to the physiological modifications accomplished with diminishing of dry matter ingestion, immune response depressed and the vitamin E plasmatic concentration level reduction. Therefore, to study the influence of vitamin E supplementation on the function of milk neutrophils, fourteen primigravid holstein heifers were casually allocated in two groups: one was oral supplemented with vitamin E (1000UI/day) 30 days pre parturition and 10 days post parturition, the other group did not receive vitamin E supplementation (control group). During the first week post-parturition, milk was collected from negative CMT quarter after induction of leucocytosis with a intramammary infusion of oyster glycogen infusion (0,1% e 0,5%, 36 e 12 hours respectively). The cells were isolated from milk, counted and the viability was estimated. After these trials the assays: phagocytosis with opsonized zymosan and phagocytosis with microorganisms that cause mastitis were performed. zymosan opzonized particles (2x108/mL) were incubated with neutrophils (2x107/mL) and counted on the optic microscope. The microorganisms (2x108/mL) Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis, Escherichia coli and Prototheca zopfii were incubated with neutrophils (2.107/mL) from milk. Solution were spread plated pre phagocytosis assay, after phagocytosis, post treatment with antibiotics and after break of neutrophils. The results were analysed from the statistical ANOVA. For the phagocytosis assays, 52% of neutrophils from control group phagocyted three or more zymosan particles, and in the supplemented group, 66% of the cells (P< 0,05). For the microorganisms, did not have statistical difference and the results were 30.7% and 28.2% for the control and supplemented groups. The average of the pathogens intracellular kill was 99% in the both groups. In sequence the tests for production O2- and H2O2, enzimatic activity of catalase, superoxide dismutase, glutathione redutase, glutathione peroxidase and myeloperoxidase were made. It were no detected any statiscal differences in respect to the production of O2- and H2O2. The production of O2- was 1,6 nmol and 3,0 nmol and the H2O2 production was 0,83 &micro;M and 0,67 &micro;M for the groups control and supplemented. The control and supplemented group enzymatic activity results obtained were: catalase 4.3 and 3.6 &micro;mol/min/mg protein, glutathione redutase 43 and 49 nmol/min/mg protein, glutathione peroxidase 16.2 and 30 nmol/min/mg protein, superoxide dismuthase 3.85 and 6.32 U/mg protein and myeloperoxidase 0,67 and 0,29 U/mg protein. In relation to these results it was not detected any statistical difference. Vitamin E supplementation increased zymosan phagocytosis and did not affect enzyme activities involved in the mechanisms of protection against oxigen reactive species and microorganism phagocytosis in the neutrophils. The vitamin E supplementation didn´t change the complex balance among the reactions of antioxidants and oxigen reactive species. It can be concluded that due to the complexity of the mechanisms involved the supplementation with just one isolate antioxidant did not interfered with the defence neutrophil activities