No description available.

No description available.

The dispersion and reaggreation [sic] stages have been described as a unique feature of embryonic development in annual killifish such as Austrofundulus limnaeus, a killifish that inhabits ephemeral ponds in the Maracaibo basin of Venezuela. These stages have previously been described as an atypical developmental progression in which blastomeres completely disperse on the surface of the yolk and then reaggregate into a mass of cells to form the embryo. Temperature affects the onset as well as the duration of this stage in related annual fishes. We have undertaken this study to show in detail the behavior of blastomere cells and their distributions as a function of developmental temperature. Embryos incubated at either 25 or 30°C were fixed and stained with Hoescht dye to allow visualization and quantification of cell number during the dispersion and reaggregation phases of development. The location of every cell nucleus on the embryo was assessed through photomicroscopy using inverted epifluorescent microsopy [sic]. This analysis revealed that the rate of cell division during the process of dispersion/reaggergation [sic] has a typical sensitivity to temperature with Q10 values of about 2-3. There is no indication that the pattern of blastomere movement and distribution is different in embryos incubated at 25°C versus 30°C. The primary developmental difference was observed as a temporary plateau in blastomere counts at 25°C followed by great variation of blastomere numbers in subsequent timepoints compared to the degree of variation observed in embryos incubated at 30°C. This trend fits the model that embryos developing at 25°C enter into a brief diapause-like event at the dispersion stage from which they emerge at a variable rate. Of great interest, at both temperatures examined, the majority of the dispersed blastomeres do not reaggregate and contribute to the formation of the primary embryonic axis. Prior studies have overemphasized blastomere reaggregation in A. limnaeus due to the limitations of the sampling methods used as well as overdependence upon a statistical test, the coefficient of dispersion. Thus, the present study sheds light on these early mischaracterizations of A. limnaeus development.

Abstract Kidney diseases affect an increasing number of people worldwide, and there is a growing demand to develop new treatments and increase the number of transplantable organs. New treatments can be designed when new knowledge is gained by studying the details of kidney development. The ex vivo culture techniques have been used for over a century to study the development of kidneys, but they are not optimal for long-term imaging and following the nephrogenesis process over time. Kidney organoids, which are cellular aggregates resembling the in vivo kidney, together with intact embryonic kidneys, present a platform for these studies. However, there are limitations when working with primary embryonic kidney cells. Primary embryonic metanephric mesenchymal cells are usually low in number and lose the ability to undergo nephrogenesis rapidly. New ways to culture, biobank, and transfect cells can offer ways for functional testing of the effects of different genes on the nephrogenesis. This study presents new tools for studying nephrogenesis. Time-lapse imaging of organ development may be enhanced by using a Fixed Z-direction (FiZD) culture system where the kidney explant is grown in a restricted 70μm space. The technique enables the segmentation of the individual cells in a two-dimensional image and a dynamic analysis of the time-lapse data. This study also presents a technique of dissociation and reaggregation of the uninduced kidney metanephric mesenchyme (MM). With this novel method of culturing the dissociated MM cells in a growth factor medium for 24 hours, the cells can keep their competence for nephrogenesis. This technique allows the genetic manipulation of the MM cells before the induction to form nephrons, allowing functional testing of genes in the metanephric mesenchyme. This study further presents different techniques for gene editing of MM cells and introduces biobanking of primary kidney cells. It is shown here that the MM and ureteric bud (UB) cells have the capability to remember their fates and build nephron-like structures or continue branching after the cryopreservation in the liquid nitrogen. The methods introduced here provide new ways to create kidney organoids, manipulate their genome, and biobank the primary embryonic kidney cells. The developed FiZD culture system enhances the imaging of kidney development compared to the previously used culture methods. Using this method, the morphogenesis of the developing kidney can be followed more precisely, even in a single cell level. This culture method may also be used to culturing other organs, such as ovary, and may help provide insights into the development of other tissues as well. / Tiivistelmä Munuaissairauksiin sairastuvien määrä on lisääntynyt maailmanlaajuisesti, ja se on aikaansaanut tarpeen uusien hoitokeinojen sekä siirtoelimien kehitykseen. Näiden kehittämiseksi tarvitsemme uutta tietoa munuaisen kehityksestä ja toiminnasta. Munuaisen kehitystä on tutkittu ex vivo -viljelyn avulla jo yli vuosisadan ajan, mutta nykyiset elinviljelytekniikat eivät ole kuitenkaan optimaalisia pitkäkestoiseen time-lapse-kuvaukseen. Tässä työssä käytetään munuaisen kehityksen tutkimiseen hiiren alkion munuaisia sekä munuaisorganoideja, jotka ovat munuaissoluista koostuvia ja aitoa munuaista mallintavia soluaggregaatteja. Primaaristen munuaissolujen käyttöön sisältyy rajoitteita, ja tämä luo tarpeen uusien organoiditekniikoiden kehitykseen ja optimointiin. Primaarisia munuaissoluja on yleensä käytettävissä pieniä määriä, ja ne eivät myöskään sovellu pitkäkestoiseen kasvatukseen, koska ne menettävät nopeasti kykynsä muodostaa nefroneita. Uusien tekniikoiden avulla voidaan parantaa näiden solujen kasvatusta, säilytystä ja transfektointia ja edistää eri geenien vaikutuksia tutkivat funktionaaliset testaukset. Tässä tutkimuksessa esitetään uusia työkaluja nefrogeneesin tutkimiseen. Elinten kehitystä seuraavan time-lapse-kuvauksen laatua voidaan parantaa käyttämällä tässä työssä esitettyä FiZD-kasvatusmenetelmää, jossa munuaiseksplantti kasvaa rajoitetussa 70μm:n tilassa. Kuvat ovat korkealaatuisia, ja se mahdollistaa 2D-kuvan yksittäisten solujen segmentoinnin ja solujen liikkeiden dynaamisen analyysin. Lisäksi tässä tutkimuksessa esitetään ei-indusoidun munuaismesenkyymin käsittelyyn kehitetty dissosiaatio- ja reaggregaatiomenetelmä. Munuaisen kehityksen alkuvaiheessa on mahdollistaerottaa nefroneja muodostava metanefrinen mesenkyymi (MM) sekä munuaisen kokoajaputkiston muodostava ureterin silmu. Metanefrinen mesenkyymi voidaan hajottaa yksisolususpensioksi, säilyttää 24 tuntia kasvutekijämediumissa ja tämän jälkeen reaggregoida ja indusoida muodostamaan nefroneita. Tämä tekniikka mahdollistaa MM-solujen geneettisen muokkauksen, ennen kuin munuaisen kehitys alkaa. Tämä tekniikka mahdollistaa myös dissosioitujen MM solujen geneettiset muokkaukset. Geenien yliekspression tai hiljentämisen avulla voidaan tehdä funktionaalisia kokeita näiden muutosten vaikutuksesta nefrogeneesiin. Lisäksi tässä työssä esitetään munuaisprogenitorisolujen säilömistä syväjäädytyksellä. Munuaisprogenitorisolut voidaan säilöä nestetyppeen, minkä jälkeen ne ovat edelleen kykeneviä muodostamaan nefronirakenteita tai haarautumaan. Tässä väitöskirjatyössä esitettyjen menetelmien avulla on tulevaisuudessa mahdollista saada lisätietoa munuaisten kehitysprosessista. Kehitetty FiZD-kasvatusmenetelmä parantaa munuaisen kehityksen kuvantamista ja mahdollistaa yksittäisten solujen seuraamisen. Tämä kasvatusmenetelmä sopii myös muiden elinten, kuten munarauhasten, ja kudosten kasvatukseen, ja sen avulla voidaan saada tietoa myös niiden kehityksestä.