Hannover, Universiẗat, Diss., 2005.

Chemnitz, Zwickau, Techn. Universiẗat, Diss., 1998.

Bochum, Universiẗat, Diss., 2000.

Frankfurt (Main), Universiẗat, Diss., 2006.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in engl. Sprache.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. - Univ. Paris-Sud 11 & Laboratoire Francis Perrin Cea Saclay. / Zsfassung in dt. Sprache.

Conjugation of reactive intermediates of drugs with proteins or DNA may result in toxic effects such as hepatotoxicity, agranulocytosis, allergies, tumors, etc. From 1975 to 1999, 2.9% of drugs were withdrawn from the market due to such severe adverse drug reactions. Thus, formation of chemically reactive intermediates is a widely discussed problem in drug development processes. Early detection of potentially toxic compounds is required for drug discovery and drug development. Conjugation of such electrophilic compounds with glutathione (GSH) is one of the most important detoxifying reactions in vivo. Processing of these GSH-conjugates ultimately leads to the formation of renally cleared mercapturic acids, which may also be oxidized to sulfoxides. Thus, mercapturic acids may be generated and detected in vitro and non-invasively in vivo in urine to assess the reactivity of a compound in early stages of drug development processes. Therefore, the aim of this work was to develop and evaluate a HPLC-MS/MS screening method for simple and rapid detection and characterization of known and unknown mercapturic acids and application of the method to several different matrices. Based on the common constant neutral loss (CNL) of 129 Da of all mercapturic acids tested (in negative ion mode), a CNL survey scan was performed using a linear ion trap instrument and was combined with two enhanced product ion (EPI) scans with different collision energies to characterize the detected signals. The CNL resulted from the cleavage between the sulfur and the carbon atom in the N-acetyl-L-cysteine moiety. After optimization of the experimental parameters, the detection limits of the reference substances in rat urine ranged from 0.3 to 15.5 pmol on column (i.e. 20 ng/ml to 800 ng/ml). For in vitro evaluation of the method, the model compounds acetaminophen, diclofenac, bifonazole, clozapine, troglitazone, carbamazepine, and bisphenol A were screened for formation of reactive intermediates and, hence, detection of the corresponding mercapturic acids. To determine possible species- and tissue-specific toxicities, the model compounds were incubated with stimulated neutrophils and with liver microsomes from rats and humans. Species-specific differences were observed in incubations of acetaminophen and diclofenac with rat and human hepatic microsomes. Tissue-specific differences in biotransformation of the model compounds in incubations with human neutrophils and human liver microsomes were observed for diclofenac, carbamazepine, clozapine, and bifonazole. The developed HPLC-MS/MS method was also evaluated in vivo by analysis of rat and human urine. Drug-related mercapturic acids were detected in urine of rats orally treated with acetaminophen (20 mg/kg and 640 mg/kg b.w.) or diclofenac (10 mg/kg and 20 mg/kg b.w.). Human urine samples were analyzed before and after oral administration of a clinically used dose of 500 mg and 50 mg of acetaminophen. Besides detection of the mercapturic acid of N-acetylbenzoquinoneimine (AAP-MA), a second mercapturic acid with m/z 327 occurred dose-dependently in rat and human urine samples after administration of acetaminophen. Further investigations on identification of this metabolite using authentic compounds and comparing their MS/MS mass spectra demonstrated oxidation of AAP-MA to stereoisomeric sulfoxides in vivo. For diclofenac, a novel mercapturic acid with m/z 441 was detected in rat urine samples that was identical to a metabolite obtained in incubations with human neutrophils before. The in vivo formation of this diclofenac metabolite is described here for the first time. In addition, three endogenously formed mercapturic acids were detected and identified. In conclusion, the results of the in vitro and in vivo evaluation demonstrate the advantages of the rapid and generic HPLC-MS/MS screening method for the detection of mercapturic acids, that can be obtained with a minimum of sample preparation and a high throughput in diverse matrices. / Konjugation reaktiver Intermediate mit Proteinen oder DNA kann zu toxischen Effekten wie Hepatotoxizität, Neutropenie, Allergien, Tumoren u.a. führen. Zwischen 1975 und 1999 wurden 2.9% der zugelassenen Arzneistoffe wegen Auftretens solcher unerwünschten, toxischen Nebenwirkungen vom Markt genommen. Daher stellen Substanzen, die reaktive Intermediate bilden können, ein großes Problem in der Arzneistoffentwicklung dar. Aus diesem Grund ist die pharmazeutische Forschungsindustrie daran interessiert, solche potenziell toxischen Substanzen bereits in frühen Phasen der Arzneistoffentwicklung zu erfassen. Elektrophile, reaktive Intermediate sind instabil und reagieren schnell mit nukleophilen Substraten. Die Konjugation reaktiver Intermediate mit Glutathion stellt hierbei einen der Hauptmechanismen der Detoxifizierung im Organismus dar. In vivo können enzymatisch geregelte Reaktionen das Glutathionaddukt abbauen und so zur Bildung renal ausscheidbarer Merkaptursäuren führen, die auch zu den entsprechenden Sulfoxiden oxidiert werden können. Man kann Merkaptursäuren aber auch direkt durch Konjugation mit N-Acetyl-L-cystein gewinnen. So können reaktive Intermediate in vitro generiert und als Merkaptursäuren detektiert und nicht-invasiv auch in vivo erfasst werden. Ziel dieser Arbeit war es, eine HPLC-MS/MS-Screening-Methode zur einfachen und schnellen Detektion und Charakterisierung von bekannten und unbekannten Merkaptursäuren als Biomarker für die Bildung reaktiver Metabolite in verschiedenen Matrices zu entwickeln und zu evaluieren. Für alle untersuchten Merkaptursäuren und deren Sulfoxide war ein Neutralverlust von 129 Da (im negativen Ionenmodus) charakteristisch. Dieser entstand durch Spaltung der Schwefel-Kohlenstoff-Bindung im Merkaptursäureanteil und diente als Basis für die Entwicklung der HPLC-MS/MS-Methode. Dafür wurde ein CNL-Scan auf 129 Da im negativen Ionenmodus durchgeführt. Der CNL-Scan konnte unter Verwendung der vorhandenen Ionenfalle mit zwei Produkt-ionen-Scans (EPI) mit unterschiedlichen Kollisionsenergien kombiniert und für eine Charakterisierung der detektierten Signale verwandt werden. Nach Optimierung der Instrument- und HPLC-Parameter wurden für die einzelnen Referenzsubstanzen Nachweisgrenzen im Bereich von 0.3 bis 15.5 pmol on column (entspricht einem Bereich von 20 ng/ml bis 800 ng/ml) in Rattenurin bestimmt. Für die In-vitro-Evaluierung der CNL-Screening-Methode wurden die Modellsubstanzen Paracetamol, Diclofenac, Troglitazon, Bifonazol, Clozapin, Carbamazepin und Bisphenol A auf die Bildung reaktiver Intermediate hin untersucht, die durch Zusatz von N-acetylcystein abgefangen wurden. Um eventuell Aufschluß über gewebe- oder speziesspezifische Toxizitäten von Arzneistoffen zu bekommen, wurden die Modellsubstanzen in stimulierten neutrophilen Granulozyten und in Ratten- und Humanlebermikrosomen inkubiert. Speziesspezifische Unterschiede in der Bildung von reaktiven Intermediaten zwischen Inkubationen mit Ratten- und Humanlebermikrosomen wurden bei Paracetamol und Diclofenac beobachtet. Organspezifische Unterschiede in der Bildung von reaktiven Intermediaten zwischen Inkubationen mit neutrophilen Granulozyten und humanen Lebermikrosomen wurden bei Diclofenac, Carbamazepin, Clozapin und Bifonazol gefunden. Die HPLC-MS/MS-Screening-Methode wurde durch Messungen von Ratten- und Humanurinproben auch in vivo evaluiert. Arzneistoffbezogene Merkaptursäuren wurden in Urinproben von Ratten gemessen, die über eine Schlundsonde Paracetamol (20 mg/kg und 640 mg/kg K.G.) bzw. Diclofenac (10 mg/kg und 20 mg/kg K.G.) zugeführt bekommen hatten. Humanurin wurde nach Gabe einer therapeutischen Dosis von 500 mg Paracetamol und einer subtherapeutischen Dosis von 50 mg analysiert. Neben der bekannten Merkaptursäure des N-acetylbenzochinonimins (NAPQI) wurde ein weiterer Metabolit (m/z 327) dosisabhängig in den Urinproben von Ratte und Mensch detektiert. Durch nähere Untersuchungen zur Identifizierung dieses Metaboliten anhand von Referenzsubstanzen und deren Massenspektren konnte nachgewiesen werden, dass das Merkapturat des NAPQI zu stereoisomeren Sulfoxiden oxidiert wurde. Bei den Diclofenac-Proben wurde zum ersten Mal ein Metabolit mit m/z 441 in Rattenurin detektiert und charakterisiert, der nur in Inkubationen mit stimulierten neutrophilen Granulozyten, jedoch nicht mit Lebermikrosomen gebildet wurde. Mit der entwickelten HPLC-MS/MS Screening Methode konnten weitere, vom Arzneistoff unabhängige Merkaptursäuren im Urin detektiert und charakterisiert werden. Schließlich zeigen die Ergebnisse zur In-vitro- und In-vivo-Evaluierung die Vorteile dieser schnellen und generischen HPLC-MS/MS-Screening-Methode zur Detektion von Merkaptursäuren, die mit minimaler Probenvorbereitung und hohem Probendurchsatz für verschiedene Matrices eingesetzt werden kann.

Techn. University, Diss., 2003--Berlin.

Hinweis: Zur optimalen Darstellung des Dokumentes bitte die Schriftart „ArnoPro“ installieren. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese und den Reaktionen von heteroatomgebundenen Aziden. Im Speziellem werden vier verschiedene Gruppen untersucht, diese umfassen: Die Synthese von N-Azido-Aminen u. a. mittels nucleophiler Substitution und Diazotransfer-Reaktion, die Synthese von N-Azido-Iminen mittels nucleophiler Substitution und Addition-Reaktion von Azid an Iminium-aktivierte Azide, die Synthese von N4O/N4O2 durch Addition von Azid-Ion an Nitrosyl/Nitronium-Salze und die Synthese von Iod(III)aziden als Iod(III)mono-, -di- und triazid(e) mittels nucleophiler Substitution. Ein besonderes Augenmerk liegt in der Untersuchung der neu etablierten Reaktion zur Synthese von N-Amidino-Pentazolen und N-Azido-Amidinen ausgehend von Chlor-Iminium-Salzen. Es konnte hierbei gezeigt werden, dass nach einer ersten Substitutionsreaktion die neu eingeführte Azid-Gruppe durch die Nachbarschaft zur Iminium-Struktur aktiviert wird und so ein weiteres Azid-Ion an der Azid-Gruppe angreifen kann. Die sich im Folgenden bildenden N-Amidino-Pentazole und N-Azido-Amidine lassen sich mit Hilfe von 15N-Isotopenmarkierungen eindeutig, ohne unterstützende quantenchemische Rechnungen, bei tiefer Temperatur NMR-spektroskopisch nachweisen und belegen. Der Zerfall dieser Verbindungen bei Raumtemperatur liefert neben drei Äquivalenten Distickstoff ein nucleophiles Carben, welches diversen Folgereaktionen unterliegt und u. a. zu Azidomethylenaminen und Triazenium-Derivaten führt.:I. Inhaltsverzeichnis vi II. Abkürzungsverzeichnis ix 1. Einleitung 1 1.1. Azide - explosiv und vielfältig 1 1.1.1. Allgemeines 1 1.1.2. Heteroatomgebundene Azide in der Literatur 4 1.1.2.1. Überblick und bekannte Reagenzien 4 1.1.2.2. N-Azido-Amine 41 7 1.1.2.3. N-Azido-Imine 67 12 1.2. Stickstoff-haltige Heterocyclen 13 1.3. Zielsetzung 17 2. Ergebnisse und Diskussion 19 2.1. Synthese von N-Azido-Aminen 41 19 2.1.1. Synthese mittels nucleophiler Substitution 20 2.1.1.1. Reaktion von 43a mit NaN3: Die Reaktionsprodukte A und B 20 2.1.1.2. Reaktion von 43a mit NaN3: Aufklärung des Reaktionsmechanismus 22 2.1.1.3. Reaktion von 43a mit NaN3: Variation der Reaktionsbedingungen 26 2.1.1.4. Reaktion von 43a mit NaN3: Variation des Azid-Reagenzes 27 2.1.1.5. Variationen der Abgangsgruppe 29 2.1.2. Synthese mittels Diazotransfer 36 2.1.3. Synthese mittels Azid-Gruppen-Übertragung 43 2.1.4. Synthese über Tetrazenium-Salze 45 2.1.5. Synthese über N-Diazonium-Salze 47 2.2. Synthese von N-Azido-Iminen 67 52 2.2.1. Synthese mittels nucleophiler Substitution 53 2.2.2. Synthese mittels Additionsreaktion 55 2.2.2.1. Vorversuche 56 2.2.2.2. Reaktionssystem nach BALLI et al. 59 2.2.2.3. Weitere Formamid-Derivate 79 2.2.2.4. Weitere Systeme 90 2.3. Synthese von N4O (213) und N4O2 (216) 100 2.4. Synthese von Iod(III)aziden 108 2.4.1. Synthese von Iod(III)monoaziden 108 2.4.2. Synthese von Iod(III)diaziden 110 2.4.3. Synthese von Iod(III)triazid (242) 115 3. Zusammenfassung und Ausblick 120 4. Experimenteller Teil 124 4.1. Arbeitsweisen 124 4.1.1. Sicherheitshinweise zum Umgang mit Aziden 124 4.1.2. Arbeiten unter Inertgas 124 4.1.3. Arbeiten bei tiefer Temperatur 125 4.1.4. Verwendung/Trocknung von Lösungsmitteln 125 4.1.5. NMR-Spektroskopie 125 4.1.6. FT-IR-Spektroskopie 126 4.1.7. in-situ-IR-Spektroskopie 126 4.1.8. HRMS 127 4.1.9. Elementaranalyse 127 4.1.10. Schmelzpunkt 127 4.1.11. Synthese von Methylmethylenimin (117) 127 4.1.12. Synthese von N4O (213) und N4O2 (216) 129 4.2. Synthese der Edukte/Reagenzien 130 4.3. Genutzte, kommerziell verfügbare Chemikalien 131 4.4. Synthesevorschriften 135 4.4.1. Synthese von 1,3,5-Trimethyl-2,3,4,5-tetrahydro-1,3,5-triazinium- chlorid (116a) 135 4.4.2. Synthese von Methylmethylenimin (117) 136 4.4.3. Synthese von N-Brom-N,N-dimethylamin (121a) 137 4.4.4. Synthese von N,N-Dichlormethylamin (125a) 138 4.4.5. Synthese von Benzoesäuremethylester (131) 139 4.4.6. Synthese von N-Chlor-N-methyl-N-prenylamin (43q) 140 4.4.7. Synthese von 1,1-Dibenzyl-2-tosylhydrazin (137) 141 4.4.8. Synthese von N-Methyl-N-(3-methylbut-2-en-1-yl)hydrazin (54q) 142 4.4.9. Synthese von (E)-1-Methyl-2-(1,1-dimethylprop-2-en-1-yl)diazen (132r) 143 4.4.10. Synthese von 1-((2,4,6-Triisopropylphenyl)sulfonyl)-4,5,6,7,8,9-hexahydro-1H-cycloocta[d]-1,2,3-triazol (141) und 2-((2,4,6-Triisopropylphenyl)sulfonyl)-4,5,6,7,8,9-hexahydro-2H-cycloocta[d]-1,2,3-triazol (142) 144 4.4.11. Synthese von 1,1,1,4,4-Pentamethyltetrazenium-triflat (145a) 146 4.4.12. Synthese von 1-Methyl-4,5,6,7,8,9-hexahydro-1H-cycloocta[d]-1,2,3- triazol (152) 147 4.4.13. Synthese von N-Thiocyanato-cyclohexylimin (181u) 148 4.4.14. Synthese von 5-Chloro-1-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrol-1-ium chlorid (185n) 149 4.4.15. Synthese von N-Cyano-N,N-dimethylamin (122) 150 4.4.16. Synthese von N-Azidomethyl-N,N-dimethylamin (48) 151 4.4.17. Synthese von N-Azido-3-ethylbenzothiazol-2-imin (71a) 152 4.4.18. Synthese von 3-Ethyl-N-(4,5,6,7,8,9-hexahydro-1H-cycloocta[d]-1,2,3-triazol-1-yl) benzothiazol-2-imin (196a) 154 4.4.19. Synthese von N'-Azido-N,N-dimethylformamidin (15N4-67a) und N,N-Dimethyl-N'-pentazolyl)formamidin (15N6-199a) 157 4.4.20. Synthese von N-(Azidomethylen)-N-methylmethanaminium- salzen (15N3-186a) 160 4.4.21. Allgemeine Synthesevorschrift zu den N-Azido-formamidinen (15N3-67), Azido-Iminium-Salzen (15N2-186), Diaziden (15N2-187) und N-Amidino-Pentazolen (15N4-199) 161 4.4.22. Synthese von 1-Ethyl-2-(4,5,6,7,8,9-hexahydro-2H-cycloocta[d]-1,2,3-triazol-2-yl)pyridin-1-iumsalzen (210q) 168 4.4.23. Synthese von 2-((1,3-Dimethylimidazolidin-2-yliden)triaz-1-en-1-yl)-1,3-dimethyl-4,5-dihydro-1H-imidazol-3-ium-hexafluorophosphat (208s) 170 4.4.24. Synthese von Ethyl-2-(azido(phenyl)iodanyl)-2-diazoacetat (227a) 171 4.4.25. Synthese von 2-Ethoxy-2-oxo-acetonitril (232a) 172 4.4.26. Synthese von Phenyl((trimethylsilyl)oxy)iodanyl-triflat (239a) 173 5. Literaturverzeichnis 174 6. Danksagung 186 7. Anhang 188 7.1. Teil I 189 7.2. Teil II 199 8. Selbstständigkeitserklärung 294 9. Lebenslauf 295

4,5-Dihydro-1,2,3-oxadiazoles are postulated to be key intermediates in the synthesis of ketones from alkenes on an industrial scale, alkylation of DNA in vivo, decomposition of N-nitrosoureas (potent carcinogens), and are also a subject of great interest for theoretical chemists. In this thesis, formation of the parent compound and decay into secondary products has been studied by NMR monitoring analysis. The elusive properties and the intermediacy of the parent compound, 4,5-dihydro-1,2,3-oxadiazole, in the decomposition of suitably substituted N-nitrosoureas using Tl(I) alkoxides as bases, have been confirmed by the characterisation of its decay products viz., ethylene oxide, acetaldehyde, and especially diazomethane, at very low temperatures by 1H NMR, 13C NMR, 15N NMR, and relevant 2D NMR methods. Moreover, it has been shown that the methylation of nucleophilic molecules by 3-methyl-4,5-dihydro-1,2,3-oxadiazolium salts, which are considered to be activated forms of β−hydroxyalkylnitrosamines, does not involve 4,5-dihydro-1,2,3-oxadiazole as an intermediate, as has been reported in literature; instead, nucleophilic substitution leading to synthesis of open-chain products dominates the reaction. / 4,5-Dihydro-1,2,3-oxadiazole wurden als Schlüsselintermediate in der industriellen Synthese von Ketonen aus Alkenen, der in vivo Alkylierung von DNA und der Zersetzung von N-Nitrosoharnstoffen (potente Karzinogene) postuliert. Sie sind ebenso von großem Interesse in der theoretischen Chemie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Bildung der Stammverbindung und deren Zersetzung in sekundäre Produkte mittels NMR-Verfolgung studiert. Die ausgesprochene Kurzlebigkeit der Stammverbindung 4,5-Dihydro-1,2,3-oxadiazol wurde durch die Charakterisierung der Produkte bei der Zersetzung geeignet substituierter N-Nitrosoharnstoffe mit Tl(I)-Alkoxiden bestätigt. Die Zersetzungsprodukte Ethylenoxid, Acetaldehyd und besonders Diazomethan wurden bei sehr niedrigen Temperaturen mittels 1H-NMR, 13C-NMR, 15N-NMR und relevanten 2D-NMR-Methoden charakterisiert. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Methylierung nucleophiler Spezies mit 3-Methyl-4,5-dihydro-1,2,3-oxadiazoliumsalzen, welchen als aktivierte Äquivalente der β−Hydroxyalkylnitrosamine verstanden werden, nicht zur Bildung von 4,5-Dihydro-1,2,3-oxadiazol als Intermediat führt, so wie dies in der Literatur berichtet wurde. Stattdessen wird die Bildung offenkettiger Produkte durch nukleophile Substitution bevorzugt.