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Frequent RASSF1A gene promoter hypermethylation in breast cancerZhang, Yan. January 2008 (has links)
Ulm, Univ., Diss., 2008.
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Experimentelle Gingivitis in verschiedenen Altersgruppen klinische und mikrobiologische Untersuchung mittels quantitativer real-time PCRWerner, Daniel. Unknown Date (has links)
Univ., Diss., 2010--Marburg.
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LOH- und Expressionsanalysen zur Identifikation neuer prognostischer Marker in Wilms Tumoren / LOH and expression analyses for the identification of new prognostic markers in Wilms tumorsWittmann, Stefanie January 2007 (has links) (PDF)
Der Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, zählt zu den im Kindesalter am häufigsten auftretenden malignen Tumoren und entsteht meist unilateral (90 – 95 %) und sporadisch (98 – 99 %). Leider sind bis heute die molekularen Ursachen, die zur Entwicklung dieser Tumoren führen nur unzureichend aufgeklärt. So werden bisher nur drei Gene mit dem Auftreten von WT in Verbindung gebracht: WT1, CTNNB1 und WTx. Während WT1 und CTNNB1 jeweils Mutationsraten von etwa 10 – 15 % aufweisen, die zudem häufig gemeinsam vorliegen, werden für WTx Mutationsraten von etwa 30 % beobachtet. Die genetischen Alterationen der anderen Tumoren sind noch immer komplett unbekannt. Ziel dieser Arbeit war aus diesem Grund die Identifikation von relevanten Regionen und Genen, die an der Entstehung bzw. dem klinischen Fortschreiten von Wilms Tumoren beteiligt sind. Zusätzlich sollten weitere Untersuchungen zur Einschätzung ihres prognostischen Potenzials dienen. In einem ersten Ansatz wurden die Chromosomenbereiche 11q und 16q in einer großen Anzahl von Wilms Tumoren auf LOH (=loss of heterozygosity), d.h. den (partiellen) Verlust von genetischem Material, untersucht. In beiden Fällen wurden erhöhte LOH-Raten von etwa 20 % beobachtet, jedoch war keine Eingrenzung der relevanten Regionen möglich, da Allelverluste nicht stets ab einem bestimmten Marker beobachtet wurden. Ein Vergleich mit der Histologie ergab signifikante Assoziationen der Allelverluste mit anaplastischen und Mischtyp-Tumoren (nur für LOH 11q), wohingegen kaum LOHs in epithelialen und stromareichen Tumoren festgestellt wurden. Somit scheinen auf 11q und 16q Gene vorzuliegen, die einerseits die Differenzierung in Epithel und Stroma begünstigen oder andererseits ein blastemreiches und anaplastisches Erscheinungsbild verhindern. Jedoch könnte auch die Assoziation von bestimmten Subtypen mit LOH 11q und 16q auf eine Entstehung aus unterschiedlichen Zellen hindeuten. Weiterhin war das Auftreten von LOH, v.a. wenn jeweils der komplette Chromosomenarm betroffen war, mit einem erhöhten Rezidiv- und Sterberisiko (nur LOH 11q) verbunden. Somit konnte gezeigt werden, dass LOH-Untersuchungen auf 11q und 16q zur Identifikation von Hochrisikopatienten für die Entwicklung von Rezidiven bzw. erhöhter Mortalität eingesetzt werden können, wodurch eine individuelle Anpassung der Therapiemaßnahmen ermöglicht wird. In einem zweiten Ansatz wurden eine Reihe von bereits publizierten potenziellen Markergenen in einer großen Anzahl von Wilms Tumoren mit Hilfe der Realtime RT-PCR auf ihre Relevanz überprüft. Allen diesen Genen wurde zuvor eine Funktion bei der histologischen Klassifikation der Tumoren bzw. bei der Vorhersage bestimmter klinischer Verläufe zugeschrieben. Die univariate Analyse diente der Beurteilung der Relevanz einzelner Gene, wohingegen die multivariate Analyse zur Bestimmung von prognostischen Genkombinationen eingesetzt wurde. Anschließend erfolgte die Validierung mittels eines zweiten und unabhängigen Tumorsatzes. Auch wenn viele der bereits publizierten Marker und in der ersten Analyse erhaltenen Assoziationen in einem weiteren und unabhängigen Tumorsatz nicht verifizierbar waren, konnten dennoch einige frühere Ergebnisse repliziert und die Relevanz der entsprechenden Gene nachgewiesen werden. Neben der Verbindung der Repression von HEY2 und TRIM22 mit Hochrisikotumoren bzw. einer höheren Sterbewahrscheinlichkeit fanden sich schwach signifikante Assoziationen auch für die verminderte Expression von TRIM22 und VEGF mit der Histologie. Ebenso waren erhöhte Level von TERT und die Repression von TRIM22 mit der Entwicklung eines Rezidivs verbunden. Vor allem aber die Korrelation der Repression von HEY2 und VEGF sowie einer Überexpression von CA9 mit Rezidiven, Tumoren hoher Malignität oder primären Metastasen verweisen auf die Notwendigkeit, besonders die Hypoxie- und Angiogenese-Signalkaskaden in Wilms Tumoren zu untersuchen, um deren Einfluss v.a. auf das Fortschreiten und die Ausbreitung der Tumoren zu evaluieren. Auch wenn die multivariate Analyse nicht zu relevanten Genkombinationen führte, konnte hier dennoch eine schwache Assoziation der verminderten Expression von TOP2A und TRIM22 mit primären Metastasen oder einer erhöhten Mortalität, sowie der Überexpression von TERT mit der Rezidivbildung bestätigt werden. Interessanterweise stellte sich die Histologie, die derzeit das Hauptkriterium für die Risikoklassifikation darstellt, weder als geeigneter prognostischer Marker für die Beurteilung des Rezidiv- noch des Sterberisikos heraus. Somit sollten Realtime RT-PCR Analysen in Zukunft als weiterer Faktor zur Beurteilung des Rezidiv- und Sterberisikos eingesetzt werden, um eine individuelle Anpassung der Therapie zu ermöglichen. Basierend auf den Ergebnissen der Realtime RT-PCR Analyse wurde der Einfluss der Expression ausgewählter Gene auf Primärkulturen, die aus nativem Wilms Tumormaterial gewonnen wurden, untersucht. Nach der Überexpression von HEY2, EGR1, MYCN und TRIM22 wurden bei allen Zellen hohe Sterberaten beobachtet, v.a. bei HEY2 und EGR1. Leider konnte weder für HEY2 noch für EGR1 der Grund hierfür aufgeklärt werden, allerdings war bei EGR1 weder die Apoptose noch die Seneszenz beteiligt. Im Gegensatz hierzu wurde die Apoptose als entscheidender Mechanismus bei MYCN und v.a. TRIM22 ermittelt. Außerdem scheint bei MYCN ein großer Anteil an Zellen in die Seneszenz einzutreten. Auch wenn diese ersten Untersuchungen an Primärkulturen von Wilms Tumoren eindeutig die Relevanz dieser Gene für die Entwicklung bzw. das Fortschreiten der Tumoren bestätigten, so sind trotz alledem weitere Experimente v.a. in einer größeren Anzahl genetisch unterschiedlicher Primärkulturen nötig, um das endgültige Potenzial dieser Gene aufzuklären. / Wilms tumor (WT), also called Nephroblastoma, belongs to the most common malignant tumors occurring in childhood. Most of these Wilms tumors develop unilaterally (90 – 95 %) and sporadically (98 – 99 %). Unfortunately, only little is known about the molecular background underlying their development with only three genes known so far: WT1, CTNNB1 and WTx. Mutations in WT1 and CTNNB1 occur only in a minor fraction of Wilms tumors of about 10 - 15 % and are often associated with each other, while mutations in WTx can be found in about 30 % of tumors. The genetic alterations of the other tumors are completely unknown. Hence, the aim of this thesis was to identify important regions and genes that are involved in Wilms tumor formation and/or progression and to further characterize their potential as markers for the prediction of certain clinical outcomes. First, chromosome arms 11q and 16q were screened for LOH (= loss of heterozygosity), which means the (partial) loss of the genome in a cell, in a large cohort of Wilms tumors. In both regions LOH rates of about 20 % were detected, but since allele losses did not always start at the same marker in the different tumors it was not possible to delimit any relevant subregions. Since there were significantly higher rates of allele loss in anaplastic and mixed-type (only 11q) tumors and almost no allele loss in epithelial and stromal tumors, 11q and 16q must contain genes that either facilitate the epithelial and stromal differentiation of cells or hamper the appearance of blastemal and anaplastic phenotypes. Otherwise, the obvious possibility to discriminate these histological subtypes by allele loss on 11q and 16q might be explained by a development from different precursor cells. Higher rates of LOH could also be linked to higher risks for relapse and death (11q only), especially when the whole chromosome arms were involved. Therefore, investigation of LOH on 11q and 16q may help to adjust the therapeutic regimens by identifying high-risk patients for relapse and death. A second approach was to reinvestigate the expression of a number of published marker genes in a larger set of Wilms tumors with a uniform method, the realtime RT-PCR. All of the genes were suggested to facilitate classification and/or prediction of certain clinical outcomes. Univariate analysis was performed to screen for relevant genes, followed by multivariate analysis to search for predictive gene combinations. Finally, validation of associations found in the first cohort was performed in a second and independent tumor set. Unfortunately, many of the previously published markers as well as associations of the first tumor set could not be verified in a new and independent tumor set. Nevertheless, it was possible to replicate the results of a number of genes and evidence their prognostic relevance. These included the repression of HEY2 and TRIM22 for high-risk tumors or mortality. Weaker correlations were verified for the repression of TRIM22 and VEGF with the histological risk and for overexpression of TERT and repression of TRIM22 with later relapse. Since the weaker expression of HEY2 and VEGF as well as the overexpression of CA9 was significantly linked to relapse, high malignant tumors or metastasis the hypoxia / angiogenesis pathways should be investigated in Wilms tumors especially with regard to the progression and spreading of tumors. Finally, multivariate analysis substantiated a weak association of repression of TOP2A and TRIM22 with metastasis or death and of overexpression of TERT with subsequent relapse. Most interestingly, histology, the current gold standard used for prediction of risks for relapse and death, could not be verified as potent prognostic factor for neither of them. Hence, realtime RT-PCR analyses can aid in stratification of tumors and prediction of relapse and death risks to intensify therapy for high-risk patients on one hand and to reduce therapy and side-effects in low-risk patients on the other hand. Based on the results of the realtime RT-PCR analyses the expression of several genes was ascertained in primary cell cultures cultivated from native Wilms tumor material. Overexpression of MYCN, TRIM22 and especially HEY2 and EGR1 by viral transduction resulted in high rates of cell death. Unfortunately, the underlying mechanism of death could be determined neither for HEY2 nor for EGR1, though for EGR1 the involvement of apoptosis and senescence could be excluded. In contrast, death in MYCN and especially in TRIM22 overexpressing cells could be attributed to high rates of apoptosis. Furthermore, a large fraction of MYCN cells seem to enter cell senescence and stop to proliferate. These results clearly corroborate the proposed relevance of the investigated genes in the development and/or progression of Wilms tumors. Nevertheless, further experiments in different primary cell cultures of Wilms tumors are necessary to clarify the real potential of these genes.
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LOH- und Expressionsanalysen zur Identifikation neuer prognostischer Marker in Wilms-TumorenWittmann, Stefanie. Unknown Date (has links) (PDF)
Würzburg, Universiẗat, Diss., 2007.
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Qualitativer Nachweis von CCM1, CCM2 und CCM3 sowie die Analyse morphologischer und proliferativer Veränderungen nach Verringerung der Expression von CCM1 in HUV-EndothelzellenHansen, Bodil Unknown Date (has links) (PDF)
Marburg, Univ., Diss., 2009
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"Real-Time-PCR-Untersuchungen zur Persistenz von infektiösen Toxoplasma-gondii-Dauerstadien in Rohwurst-Erzeugnissen"Rosa, Stefanie Ulrike January 2009 (has links)
Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2009
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Etablierung und Evaluierung eines molekularen Nachweises zur Quantifizierung des Chimärismus nach allogener Stammzelltransplantation / Establishment and evaluation of a qPCR- based method to quantify chimerism after allogeneic stem cell transplantationKind, Sebastian January 2020 (has links) (PDF)
Jedes Jahr werden am Universitätsklinikum Würzburg etwa 100 PatientInnen allogen stammzelltransplantiert. Für den Erfolg einer allogenen Stammzelltransplantation ist neben einer passenden Spenderauswahl und einer optimalen Vorbereitung auch die regelmäßige Nachkontrolle wichtig. Im Rahmen dieser Nachkontrollen werden unter anderem Chimärismusuntersuchungen durchgeführt.
Als Chimäre wird in der Wissenschaft ein Lebewesen bezeichnet, das Zellen in sich trägt, die aus zwei oder mehr Zygoten entstanden ist. Der Begriff kommt aus der griechischen Mythologie, in der die Chimäre als Mischwesen aus Löwe, Ziege und Schlange (oder manchmal Drache) beschrieben wurde.
Lange Zeit galt die STR/VNTR Methode als Goldstandard für die Nachkontrolle der Chimärismusuntersuchung. Durch Alizadeh et al. wurde bereits im Jahr 2002 eine neuartige Methode beschrieben, die mittels RT-PCR den genauen Chimärismusgrad messen kann.
Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Etablierung und Evaluierung dieser Methode der Chimärismusuntersuchung am Universitätsklinikum Würzburg. Es konnte gezeigt werden, dass sie für den klinischen Alltag geeignet ist und wurde auch im Hinblick auf äußere Störfaktoren untersucht.
Darüber hinaus wurde eine Methode zur Bestimmung des CD3+ Chimärismus etabliert. Diese Untersuchung ist wichtig für die Abschätzung eines möglichen Abstoßungs- und GvHD Risikos.
Seit 2013 finden auf Basis dieser Arbeit regelmäßige Chimärismusuntersuchungen am Universitätsklinikum Würzburg statt. / Every year, hematopoietic stem cell transplantations are being performed on approximately 100 patients at the university hospital Würzburg. Apart from finding a fitting stem cell donor and a perfect preparation of the recipient, follow-up examinations are essential for the long-term success of this procedure. Monitoring the chimerism after allogeneic stem cell transplantation is an essentialpart of those follow-up examinations. In science, a chimera is defined as a living organism, that contains cells deriving from different zygotes. In greek mythology, the „Chimera“ was described as a creature with the head of a lion, the body of a goat and the tail of a snake. For many years, the STR/VNTR method was the standard for post-transplant chimerism testing. In 2002, Alizadeh et al. developed a new method using RT-PCR to monitor chimerism. This dissertation evaluated and established this new method for engraftment analysis of transplanted patients at the university hospital Würzburg. It could be shown that the method was suitable for routine use in clinical practice. In addition, a method to measure CD3 + chimerism was established to evaluate the risks of GvHD or graft failure. Since 2013, chimerism is being tested at the university hospital Würzburg based on the results of this graduate thesis.
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Prospektive Untersuchung zur Evaluation von Risikofaktoren und Inzidenzen invasiver Pilzinfektionen, sowie der konsekutiven antimykotischen Therapie bei Hochrisikopatienten mit akuter Leukämie und Langzeitaplasie nach Chemotherapie unter besonderer Berücksichtigung der Polymerasekettenreaktion zur Verbesserung der diagnostischen Optionen / Evaluation of risk factors, incidences of invasive fungal infections and antifungal treatment at high risk patients with acute leukaemia and high dose chemotherapy with following prolonged neutropenia considering polymerase chain reaction to improve the diagnostic optionsScheuermann, Sabine Verena January 2009 (has links) (PDF)
In der Hämatoonkologie nimmt die Inzidenz von Pilzinfektionen in den letzten 2 Jahrzehnten deutlich zu, wobei eine frühzeitige Diagnostik und adäquate Therapie hinsichtlich einer hohen Komplikationsrate wichtig ist. Umso deutlicher wird die Notwendigkeit einer Intensivierung und Verbesserung der Diagnostik, beispielsweise durch PCR. Es soll die Wertigkeit der routinemässigen PCR-Untersuchung als frühen Indikator einer Erkrankung in einer nicht durch Studiendiagnostik verfälschten klinischen Routine untersucht werden. Ein weiterer zentraler Punkt dieser Studie ist, ein Risikoprofil für neutropenische Patienten mit Chemotherapie bei Akuter Leukämie zu erstellen. Grundlegende Zusammenhänge zwischen individuellen wie auch generellen Risikofaktoren und Diagnosestellung einer IPI sollen durch die Untersuchung von 62 Patienten geklärt werden. Die PCR-Untersuchung ist ein schnelles und sensitives Verfahren zum Nachweis von Pilz-DNS. Es werden für die Sensitivität einer PCR, hinsichtlich der Diagnosestellung einer IPI im Zeitraum der Datenerhebung, ein Wert von 59,3 % und eine Spezifität von 71,4 % ermittelt. Betrachtet man den Zeitrahmen von 14 Tagen nach Beginn der Aplasie, so kann eine höhere Sensitivität von 72,7 % eruiert werden, wie auch ein hoher negativ prädiktiver Wert von 91,7. Eine invasive Mykose bei Patienten mit mehrfach negativem PCR-Nachweis kann somit als unwahrscheinlich angesehen werden. Besonderes Augenmerk wird in der Studie auch auf das Erstellen eines Risikoprofils für die Patienten hinsichtlich einer invasiven Mykose gelegt. In Hinblick auf die Chemotherapie-Protokolle und -Zyklen wird ein Trend zur frühen Chemotherapie deutlich. Bei der Überprüfung der epidemiologischen Verteilung für Deutschland kann erstmals eine signifikant unterschiedliche jahreszeitliche Verteilung an IPI nachgewiesen werden. So kommt es im Sommer signifikant seltener zu einer invasiven Mykose. Hingegen ist das Risiko der Krankheitsentstehung in den Monaten September, Oktober und November hochsignifikant gesteigert. Dieses sollte bei zukünftigen epidemiologischen Untersuchungen aber eventuell auch zur engmaschigen Diagnostik und Indikation prophylaktischer und empirischer Therapien berücksichtigt werden. / IFI are a life threatening complication in immunsupressed patients and have an increased incidence after chemotherapy for treatment of acute leukaemia (AL). Due its clinical implication as well as to difficulties in diagnosis and the isolation of causal organism, patients most often receive empirical and increasingly prophylactic antifungal therapy (AFT). The best choice of indication and also pharmacoeconomy depend on the local incidence and otherwise applied AFT. Therefore further characterisation of patients at risk and the knowledge influencing factors are essential for improving antifungal approaches. Little is known about climatic influence and seasonal distribution of fungal infections. Here we describe an epidemiological single center evaluation of AFT, clinical diagnosed IFI and its temporal distribution in AL patients. In a prospective evaluation during 2005 to 2006 patients diagnosed with AL and expected neutropenia for more than 9 days after chemotherapy were included and observed for up to 6 months. Underlying disease, patient characteristics, radiological evidence of pulmonary infiltrates, IFI as well as time point and indication of AFT have been collected. 62 patients with AL have been included in the evaluation. For 27 an IFI has been diagnosed clinically but only in a minority a causal pathogen could be detected. 42 patients received AFT. No correlation between the kind of chemotherapy and IFI could be found. There had been a relevant difference in the seasonal distribution of IFI. Especially for patients enrolled between September to November a significant higher incidence of 92% (p 0,002) could be detected. A further aim was to assess the performance of PCR in terms of diagnosing invasive aspergillosis, and we succeeded in supporting the value of a negative PCR result for ruling out IA and thereby helping to limit empirical therapy to those patients who are most likely to have a n invasive fungal infection. IFI is often a clinical indication for antimicrobial therapy in patients suffering from AL. In this evaluation only in a minority of patients the infection and its causal organism could be proven. In the majority of cases an empirical or preemptive therapy was initiated. This emphasis the necessity to intensify diagnostic efforts (e.g. galactomannan testing, BAL) and to improve tests (e.g. PCR). For the first time a seasonal influence on IFI in Germany could be demonstrated showing a significant higher rate in autumn. This should be taken into account in future epidemiological evaluations and might be helpful for the differentiation of prophylactic or empiric AFT.
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Diagnostik der invasiven Aspergillose bei immunsupprimierten Patienten / Diagnosis of Invasive Aspergillosis in immunocompromised patientsBernhardt, Marcel January 2012 (has links) (PDF)
Die invasive Aspergillose ist eine schwerwiegende opportunistische systemische Infektion bei immunsupprimierten Patienten. In dieser Arbeit wurden verschiedene PCR-Verfahren und ein ELISA-Verfahren zum Antigennachweis in Hinblick auf Sensitivität, Sensibilität und positiver bzw. negativer Vorhersagewahrscheinlichkeit verglichen. Die konventionelle 18S-PCR ist ein panfungales Assay und wegen zahlreicher falsch-positiver Ergebnisse nicht geeignet zur Frühdiagnose. Die ITS-PCR hat sich aufgrund guter Spezifität als vielversprechend erwiesen, muss aber noch mit größeren Fallzahlen evaluiert werden. Der Antigennachweis (Platelia, Fa. Bio-Rad) weist eine hohe Sensitivität und negativen prädiktiven Wert auf. Als vielversprechend dürfte zukünftig eine Kombination aus PCR und Antigennachweisverfahren gelten. / Diagnosis of Invasive Aspergillosis in immunocompromised patients
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Untersuchung der Nierenschädigung durch Aldosteron am Rattenmodell über die Quantifizierung von Schädigungsmarkern mittels Real-Time PCR-Technik / Exploring renal damage caused by aldosterone by quantifying damage markers in rats via real time PCR techniqueBasali, Timo January 2017 (has links) (PDF)
Die Breite der Wirkungen von Aldosteron auf Nierenzellen wurde lange Zeit unterschätzt. Inzwischen zeigte sich ein nicht unerheblicher Anteil des Hyperaldosteronismus an arterieller Hypertonie und ebenso mehren sich die Hinweise auf damit assoziierter erhöhter Inzidenz für maligne Entartung von Nierengewebe. In dieser Arbeit wurde der Effekt von Hyperaldosteronismus auf Nierenzellen von Ratten in vivo untersucht. Mittels real time quantitative PCR wurden die relative Expressionsveränderungen der mRNA von validierten Nierenschädigungsmarkern im Hyperaldosteronismusmodell kontrolliert beobachtet und statistisch ausgewertet. Anders als im analog durchgeführten Vorversuch mit DOCA an der Stelle von Aldosteron, ließ sich größtenteils kein über der natürlichen Streuung der Daten liegender, signifikanter Effekt der Nierenschädigung durch überhöhte Aldosteronspiegel nachweisen. Hierfür kommen vielfältige Gründe in Frage. Neben der technischen Variabilität, der Beschaffenheit der internen Kontrolle, potentiell vorhandenen Inhibitoren und der Qualität der mRNA, konnten eine Reihe von weiteren Gründen als Ursache für die Diskrepanz zu den Ergebnissen der mit DOCA behandelten Tiere ausgeschlossen werden. Neben der theoretischen Möglichkeit inter-methodischer Differenzen und sich daraus ergebender Variationen, sowie der noch weiter zu untersuchenden Rolle des Glukokortikoidrezeptors durch dessen variable gleichzeitige Aktivierung, ist die Interpretation im Sinne eines zu gering ausgeprägten Schädigungseffektes durch den Hyperaldosteronismus für den gewählten Stichprobenumfang naheliegend. Hiermit stimmt auch die Tatsache überein, dass der Effekt der Behandlung mit Aldosteron im Vergleich zur Behandlung mit DOCA von vorne herein deutlich geringer ausfallend erwartet wurde. / The broad spectrum of effects of aldosterone on renal cells has been underestimated for a long time. Meanwhile it has been shown that hyperaldosteronism has a considerable share of all cases of arterial hypertension, and the indications for an associated higher incidence of malignant transforming of kidney tissue are also increasing. The subject of this study was to investigate the effect of Hyperaldosteronism on kidney cells in rats. By means of real-time quantitative PCR, the change in the relative expression of mRNA of validated kidney cell damage markers in the hyperaldosteronism model were monitored and statistically evaluated under controlled conditions. In contrast to the previous pre-test with DOCA instead of aldosterone, a significant effect of renal impairment due to excessive aldosterone levels could not be detected. Numerous reasons are conceivable for that. In addition to the technical variability, the nature of the internal control, potentially present inhibitors and the quality of the mRNA, a number of further reasons could be excluded as a cause of the discrepancy with the results of the animals treated with DOCA. Besides the theoretical possibility of inter-methodical differences and resulting variations, as well as the role of the glucocorticoid receptor, which is still to be investigated, the closest interpretation is a damage effect too small to be detected by the given sample size. This is also in agreement with the fact that the effect of the treatment with aldosterone compared with the treatment with DOCA was expected to be significantly lower from the outset.
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