Freiburg i. Br., Univ., Diss., 2008.

Universiẗat, FB Medizin, Diss.--Hamburg, 2005.

Universiẗat, Diss--Ulm, 2004.

Ulm, Univ. Diss., 2005.

Tübingen, Univ., Diss., 2002.

Jedes Jahr werden am Universitätsklinikum Würzburg etwa 100 PatientInnen allogen stammzelltransplantiert. Für den Erfolg einer allogenen Stammzelltransplantation ist neben einer passenden Spenderauswahl und einer optimalen Vorbereitung auch die regelmäßige Nachkontrolle wichtig. Im Rahmen dieser Nachkontrollen werden unter anderem Chimärismusuntersuchungen durchgeführt. Als Chimäre wird in der Wissenschaft ein Lebewesen bezeichnet, das Zellen in sich trägt, die aus zwei oder mehr Zygoten entstanden ist. Der Begriff kommt aus der griechischen Mythologie, in der die Chimäre als Mischwesen aus Löwe, Ziege und Schlange (oder manchmal Drache) beschrieben wurde. Lange Zeit galt die STR/VNTR Methode als Goldstandard für die Nachkontrolle der Chimärismusuntersuchung. Durch Alizadeh et al. wurde bereits im Jahr 2002 eine neuartige Methode beschrieben, die mittels RT-PCR den genauen Chimärismusgrad messen kann. Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Etablierung und Evaluierung dieser Methode der Chimärismusuntersuchung am Universitätsklinikum Würzburg. Es konnte gezeigt werden, dass sie für den klinischen Alltag geeignet ist und wurde auch im Hinblick auf äußere Störfaktoren untersucht. Darüber hinaus wurde eine Methode zur Bestimmung des CD3+ Chimärismus etabliert. Diese Untersuchung ist wichtig für die Abschätzung eines möglichen Abstoßungs- und GvHD Risikos. Seit 2013 finden auf Basis dieser Arbeit regelmäßige Chimärismusuntersuchungen am Universitätsklinikum Würzburg statt. / Every year, hematopoietic stem cell transplantations are being performed on approximately 100 patients at the university hospital Würzburg. Apart from finding a fitting stem cell donor and a perfect preparation of the recipient, follow-up examinations are essential for the long-term success of this procedure. Monitoring the chimerism after allogeneic stem cell transplantation is an essentialpart of those follow-up examinations. In science, a chimera is defined as a living organism, that contains cells deriving from different zygotes. In greek mythology, the „Chimera“ was described as a creature with the head of a lion, the body of a goat and the tail of a snake. For many years, the STR/VNTR method was the standard for post-transplant chimerism testing. In 2002, Alizadeh et al. developed a new method using RT-PCR to monitor chimerism. This dissertation evaluated and established this new method for engraftment analysis of transplanted patients at the university hospital Würzburg. It could be shown that the method was suitable for routine use in clinical practice. In addition, a method to measure CD3 + chimerism was established to evaluate the risks of GvHD or graft failure. Since 2013, chimerism is being tested at the university hospital Würzburg based on the results of this graduate thesis.

Megakaryocytes (MKs) are the largest cells of the hematopoietic system and the precursor cells of platelets. During proplatelet formation (PPF) bone marrow (BM) MKs extent large cytoplasmic protrusions into the lumen of sinusoidal blood vessels. Under homeostatic conditions PPF occurs exclusively in the direction of the sinusoid, while platelet generation into the marrow cavity is prevented. So far, the mechanisms regulating this process in vivo are still not completely understood, especially when PPF is deregulated during disease. This thesis investigated the mechanisms of PPF in native BM and after myeloablation by total body irradiation (TBI). First, we have identified a specialized type of BM stromal cells, so called CXCL12-abundant reticular (CAR) cells, as novel possible regulators of PPF. By using complementary high-resolution microscopy techniques, we have studied the morphogenetic events at the MK/vessel wall interface in new detail, demonstrating that PPF formation preferentially occurs at CAR cell-free sites at the endothelium. In the second part of this thesis, we analyzed the processes leading to BM remodeling in response to myeloablation by TBI. We used confocal laser scanning microscopy (CLSM) to study the kinetic of radiation-triggered vasodilation and mapped extracellular matrix (ECM) proteins after TBI. We could demonstrate that collagen type IV and laminin α5 are specifically degraded at BM sinusoids. At the radiation-injured vessel wall we observed ectopic release of platelet-like particles into the marrow cavity concomitantly to aberrant CAR cell morphology, suggesting that the balance of factors regulating PPF is disturbed after TBI. ECM proteolysis is predominantly mediated by the matrix metalloproteinase MMP9, as revealed by gelatin-zymography and by a newly established BM in situ zymography technique. In transgenic mice lacking MMP9 vascular recovery was delayed, hinting towards a role of MMP9 in vessel reconstitution after myeloablation. In a third series of experiments, we studied the irradiated BM in the context of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). By using mice as BM donors that ubiquitously express the fluorescent reporter protein dsRed we tracked engraftment of donor cells and especially MKs in the recipient BM. We found a distinct engraftment pattern and cluster formation for MKs, which is different from other blood cell lineages. Finally, we assessed platelet function after TBI and HSCT and were the first to demonstrate that platelets become massively hyporeactive, particularly upon stimulation of the collagen receptor GPVI. In summary, our findings shed light on the processes of PPF during health and disease which will help to develop treatments for aberrant thrombopoiesis. / Megakaryozyten (MKs) sind die größten Zellen des hämatopoetischen Systems und die Vorläuferzellen der Blutplättchen. Während der Ausbildung von Proplättchen schnüren MKs im Knochenmark (KM) große zytoplasmatische Ausläufer in das Lumen der sinusoidalen Blutgefäße ab. Unter homöostatischen Bedingungen erfolgt die Proplättchenbildung ausschließlich in Richtung der Sinusoide, während die Thrombozytenbildung in die Knochenmarkkavität verhindert wird. Bislang sind die Mechanismen, die diesen Prozess in vivo steuern, noch nicht vollständig aufgeklärt insbesondere, wenn die Thrombozytenbiogenese unter Krankheitsbedingungen dereguliert ist. In dieser Arbeit wurden die Mechanismen der Thrombopoese im nativen Knochenmark und nach Myeloablation durch Ganzkörperbestrahlung (total body irradiation, TBI) untersucht. Zunächst haben wir einen spezialisierten Typ von KM-Stromazellen, die sog. CXCL12-abundant reticular (CAR) Zellen, als neue mögliche Regulatoren der Proplättchenbildung identifiziert. Durch den Einsatz komplementärer hochauflösender Mikroskopietechniken haben wir die morphogenetischen Vorgänge an der Schnittstelle zwischen MKs und Gefäßwand genauer untersucht und gezeigt, dass die Generierung von Proplättchen bevorzugt an CAR-Zell-freien Stellen am Endothel stattfindet. Im zweiten Teil dieser Arbeit analysierten wir die Prozesse, die zum Knochenmarkumbau nach Myeloablation durch TBI führen. Mit Hilfe von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie untersuchten wir die Kinetik der strahleninduzierten Vasodilatation und kartierten die extrazelluläre Matrix (EZM) Proteine nach TBI. So konnten wir zeigen, dass Kollagen Typ IV und Laminin α5 spezifisch an den Knochenmarksinusoiden abgebaut werden. An der strahlengeschädigten Gefäßwand beobachteten wir die ektope Freisetzung plättchenartiger Partikel in die Knochenmarkkavität, die mit einer abnormalen CAR-Zellmorphologie einherging. Dies weist darauf hin, dass das Gleichgewicht der Faktoren, die die gerichtete Proplättchenbildung regulieren, nach TBI gestört ist. Die EZM-Proteolyse wird vor allem durch die Matrix-Metalloproteinase MMP9 vermittelt, was durch Gelatine-Zymographie und durch eine neu etablierte in situ Zymographie-Technik für das Knochenmark nachgewiesen wurde. Bei transgenen Mäusen, die defizient für MMP9 sind, war die Regeneration der Vaskulatur verzögert, was auf eine Rolle von MMP9 bei der Gefäßrekonstitution nach Myeloablation hindeutet. In einer dritten Versuchsreihe untersuchten wir das bestrahlte KM im Rahmen einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT). Mit Hilfe von Mäusen als KM-Spender, die ubiquitär das fluoreszierende Reporterprotein dsRed exprimieren, verfolgten wir das Anwachsen von Spenderzellen und insbesondere von MKs im Empfängerknochenmark. Wir beobachteten ein eindeutiges Muster bzw. Clusterbildung für anwachsende MKs, die sich von anderen Blutzelllinien unterschied. Schließlich untersuchten wir die Funktion von Thrombozyten nach TBI und HSZT und konnten als erste zeigen, dass Thrombozyten eine massive Hyporeaktivität ausbilden, insbesondere nach Stimulation des Kollagenrezeptors GPVI. Zusammenfassend geben unsere Ergebnisse Aufschluss über die Prozesse der Thrombopoese im nativen und pathologischen Knochenmark, was zur Entwicklung von Therapien zu Behandlung von defekter Thrombozytenbiogenese beitragen wird.

Monocytes can be functionally divided in two subsets, both capable to differentiate into dendritic cells (DCs): CX3CR1loCCR2+ classical monocytes, actively recruited to the sites of inflammation and direct precursors of inflammatory DCs; and CX3CR1hiCCR2− non-classical monocytes, characterized by CX3CR1-dependent recruitment to non-inflamed tissues. Yet, the function of non-classical monocyte-derived DCs (nc-mo-DCs), and the factors, which trigger their recruitment and DC differentiation, have not been clearly defined to date. Here we show that in situ differentiated nc-moDCs mediate immunosuppression in the context of intestinal graft-versus-host disease (GVHD). Employing multi-color confocal microscopy we observed a dramatic loss of steady state host-type CD103+ DC subset immediately after transplantation, followed by an enrichment of immune-regulatory CD11b+ nc-moDCs. Parabiosis experiments revealed that tissue-resident non-classical CX3CR1+ monocytes differentiated in situ into intestinal CD11b+ nc-moDCs after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). Differentiation of this intestinal DC subset depended on CSF-1 but not on Flt3L, thus defining the precursors as monocytes and not pre-DCs. Importantly, CX3CR1 but not CCR2 was required for this DC subset differentiation, hence defining the precursors as non-classical monocytes. In addition, we identify PD-L1 expression by CX3CR1+ nc-moDCs as the major mechanism they employ to suppress alloreactive T cells during acute intestinal GVHD. All together, we demonstrate that host nc-moDCs surprisingly mediate immunosuppression in the context of murine intestinal GVHD – as opposed to classical “inflammatory” monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) – via coinhibitory signaling. This thorough study unravels for the first time a biological function of a - so far only in vitro and phenotypically described - DC subset. Our identification of this beneficial immunoregulatory DC subset points towards alternate future strategies in underpinning molecular pathways to foster their function. We describe an unexpected mechanism of nc-moDCs in allo-HCT and intestinal GVHD, which might also be important for autoimmune disorders or infections of the gastrointestinal tract. / Monozyten (MO) lassen sich funktionell in zwei Subpopulationen unterteilen, die sich in dendritische Zellen (DC) differenzieren können: 1) Klassische Monozyten (CX3CR1loCCR2+), die direkte Vorläuferzellen von inflammatorischen DCs (mo-DCs) sind und aktiv an die Stelle der Entzündung rekrutiert werden und 2) nicht-klassische Monozyten (CX3CR1hiCCR2−). Bisher ist weder die Funktion der, aus nicht-klassischen Monozyten abstammenden, DC-Subpopulation (nc-mo-DCs) bekannt, noch ist geklärt, welche Faktoren die Ausdifferenzierung und die Rekrutierung der nc-mo-DCs in periphere Gewebe ermöglichen. In dieser Dissertationsarbeit zeige ich, dass nc-mo-DCs in situ differenzieren und in der akuten intestinalen Graft-versus-Host Erkrankung (GVHD) immunsuppressiv wirken. Konfokale Mikroskopie verdeutlichte den Rückgang der, im gesunden Gleichgewicht im intestinalen Gewebe dominierenden, CD103+ DCs direkt nach allogener hämatopoetischer Zelltransplantation (HCT) zugunsten immunregulatorischer CD11b+ nc-moDCs. Weiterhin zeigten Parabiose Experimente, dass nicht-klassische CX3CR1+ Monozyten im intestinalen Gewebe ansässig sind und sich nach allogener HCT in situ zu CD11b+ nc-moDCs ausdifferenzieren. Die Differenzierung findet in Abhängigkeit von CSF-1 und unabhängig von Flt3L statt, ein Beweis dafür, dass dieser Zelltyp aus Monozyten und nicht aus DC-Vorläuferzellen gebildet wird. Die Differenzierung dieser intestinalen DC Subpopulation hängt von CX3CR1, nicht jedoch von CCR2 ab, ein Beweis dafür, dass dieser Zelltyp aus nicht-klassischen Monozyten gebildet wird. Mechanistisch zeigen wir, dass nc-moDCs alloreaktive T-Zellen durch die Expression von PD-L1 supprimieren. Zusammenfassend beschreiben wir erstmalig nc-moDCs als neue DC Subpopluation, die im Mausmodell die intestinale GVHD unterdrückt und sich damit wesentlich von den bisher beschriebenen, klassischen proinflammatorischen mo-DCs unterscheidet. Die von den nc-moDCs vermittelte immunregulatorische Wirkung könnte weiterhin eine wichtige Rolle bei Autoimmunerkrankungen und Infektionen im Magen-Darm-Trakt spielen und sollte daher in zukünftigen Therapieansätzen berücksichtigt werden.

Invasive Pilzinfektionen stellen ein großes Problem bei Transplantatempfängern dar. Candida und Aspergillus spp. sind die häufigsten pathogenen Pilze bei Patienten nach KMT und Organtransplantationen. Diese Infektionen sind durch eine hohe Morbidität und Mortalität gekennzeichnet, insbesondere bei Patienten mit persistierender Granulozytopenie und damit jene nach allogener KMT. Die Mortalitätsrate kann durch eine Frühdiagnostik und durch Gabe einer geeigneten Therapie wesentlich reduziert werden. Die Symptome und Zeichen einer systemischen Pilzinfektion sind bei Transplantatempfängern untypisch. Die serologische Diagnostik von invasiven Candidosen oder Aspergillosen stellt eine zusätzliche Möglichkeit zur klinischen Untersuchung und anderen diagnostischen Maßnahmen dar. Diese Untersuchung umfasste 252 Patienten (17 Patienten nach KMT) und 235 Patienten von Intensivtherapiestationen (z. B. nach Organtransplantationen) in den Jahren 1991-1994 von der Humboldt-Universität zu Berlin (Charite). Die Patientenseren wurden routinemäßig auf das Vorkommen einer Candida- und Aspergillus Antigenämie geprüft. Zum Nachweis von zirkulierendem Galactomannan wurde ein Latex Agglutinationstest- Pastorex Candida und Aspergillus, Sanofi Diagnostics Pasteur, genutzt. Invasive Aspergillus-Pilzinfektionen wurden bei acht von 235 Patienten unter Intensivtherapie gefunden. Alle acht Patienten mit invasiver Aspergillose hatten einen positiven Aspergillus-Antigen-Test. Der direkte Nachweis von Antigenbestandteilen von Candida oder Aspergillus spp. erwies sich als vielversprechender frühdiagnostischer Test bei kritisch kranken und immunsupprimierten Patienten. / Invasive fungal infections are a major problem in transplant recipients. Candida and Aspergillus spp. are the most common fungal pathogens causing infection in patients undergoing BMT or solid organ transplantation. These infections are characterised by high morbidity and mortality, especially in patients with persistent granulocytopenia and in these receiving allogeneic bone marrow transplant. The mortality rate can be substantially reduced if an early diagnosis is made and the proper therapy given. The symptoms and signs of deep fungal infection in the transplant recipients are unreliable and often absent regardless of the type of organism or the site of infection. Laboratory tests are essential to establish the diagnosis of invasive fungal infection. The serological diagnosis of invasive candidosis or aspergillosis is at best an adjunct to clinical evaluation and other diagnostic procedures. The study comprises 252 patients undergoing allogeneic bone marrow transplantation (17 patients) and 235 patients from intensive care units (for instance after solid organ transplantation) in the years 1991-1994 at the Humboldt-University of Berlin (Charité). The serum of the patients were routinely screened for the occurrence of Candida and Aspergillus antigenemia (circulating galactomannan was detected using a latex agglutination test-Pastorex Candida and Aspergillus, Sanofi Diagnostics Pasteur). Invasive Aspergillus fungal infection was found in eight of the 235 intensive care patients. All these eight patients with invasive aspergillosis had an positive Aspergillus antigen test. The direct detection of antigenic components of Aspergillus and Candida spp. in serum appears promising as an early diagnostic test in critical ill and immunocompromised patients.

Human cells from acute myeloid leukemia (AML) patients are frequently transplanted into immune-compromised mouse strains to provide an in vivo environment for studies on the biology of the disease. Since frequencies of leukemia re-initiating cells are low and a unique cell surface phenotype that includes all tumor re-initiating activity remains unknown, the underlying mechanisms leading to limitations in the xenotransplantation assay need to be understood and overcome to obtain robust engraftment of AML-containing samples. We report here that in the NSG xenotransplantation assay, the large majority of mononucleated cells from patients with AML fail to establish a reproducible myeloid engraftment despite high donor chimerism. Instead, donor-derived cells mainly consist of polyclonal disease-unrelated expanded co-transplanted human T lymphocytes that induce xenogeneic graft versus host disease and mask the engraftment of human AML in mice. Engraftment of mainly myeloid cell types can be enforced by the prevention of T cell expansion through the depletion of lymphocytes from the graft prior transplantation.