Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseALOF.pdf: 1727082 bytes, checksum: 2bafd71518dd7f0aa291c11a17ad0841 (MD5) Previous issue date: 2004-02-11 / Universidade Federal de Minas Gerais / Enzymatic route to produce antibiotic acts in mild reaction conditions (aqueous medium, neutral pH and moderate temperatures). Furthermore it reduces the number of reaction steps and decreases the amount and toxicity of waste products per kilogram of antibiotic. The enzymatic synthesis of ampicillin from phenylglycine methyl ester (PGME) and 6-aminopenicillanic acid (6-APA) can be an attractive alternative, replacing the chemical route. The use of an immobilized enzyme to catalyze the synthesis is very important to reduce costs. Penicillin G acylase (PGA) [EC 3.5.1.11] from E. coli was immobilized on two supports (agarose gel and silica). This work undertakes an optimization study of the enzymatic synthesis of ampicillin, to find out optimized process conditions. Therefore, it was studied the influence of the following variables: pH, temperature, 6-APA initial concentration, buffer concentration and the presence of methanol. Response variables were productivity, selectivity and yield (based on 6- APA initial concentration). The assays were carried on accordind to factorial design 25. Temperature, pH, and 6-APA initial concentration influenced At synthesis of ampicillin from PGME and 6-APA, two other reactions compete with the synthesis reaction: hydrolysis of PGME (a parallel reaction) and hydrolysis of ampicillin (in series with the synthesis). The yield of the synthesis of ampicillin depend on the rates of three different reactions. The highest yield was achieved at 4ºC, pH 6.5, without methanol, and with low buffer concentration. The results also indicate that it is possible to work with this system at high productivities, and it still keeps high yields at 25ºC, without buffer, and pH 6.5. After the selection of reaction conditions (25ºC, pH 6.5), assays with PGA immobilized on silica carrier were realized. Convensional reactors may cause shearing on derivative enzyme-silica, which led using fixed-bed reactor. Mass transport parameters were estimated by fitting heterogeneous mathematical model to experimental data of catalytic bed with recirculation, running on transient state. Another used support on immobilized enzyme was agarose gel. Domain of experimental assays used in the neural network training and validation were initial substrate concentrations ranged from 50 to 250mM. A mechanistic model to represent the synthesis of ampicillin from PGME and 6-APA is a set of seriesparallel reactions (ampicillin and PGME hydrolysis are undesirable side reactions) would be too complex, with an intractable number of kinetic parameters. Simplified models could not represent all the experimental data, and a hybrid model was used. Neural networks were trained to predict reaction rates and used in the mass balance equations. A feedforward neural network, with one hidden layer was used. Results of the simulation were promising. The operational region that of high productivity and selectivity of antibiotic could be successfully mapped. An important aspect to improve the selectivity of ampicillin synthesis is to precipitate the antibiotic because the hydrolysis reaction would be decreasing. An approprieted biocatalyst which preventing the precipitation was developed, and used in a Taylor vortex reactor where shears are smaller. Synthesis assays using high substrate concentrations were performed in this reactor, occurring precipitate of antibiotic during reaction, to improve yield, selectivity, and productivity of this system. / A rota enzimática para produção de antibióticos atua em condições suaves de temperatura, pressão e pH, em meio aquoso, além de ter bem menor impacto ambiental. A síntese enzimática de ampicilina a partir de éster metílico de fenilglicina (EMFG) e ácido 6-aminopenicilânico (6-APA) foi estudada como alternativa à rota de produção química. O uso de enzimas imobilizadas é comum na literatura devido aos benefícios que estas apresentam em relação às enzimas solúveis: separação do meio reacional e reutilização do biocatalisador. A enzima penicilina G acilase [EC 3.5.1.11] foi imobilizada em dois diferentes suportes (sílica e agarose). O primeiro passo estudado para produção do antibiótico foi a determinação das condições ótimas de operação. Assim, estudouse a influência das seguintes variáveis: pH, temperatura, concentração inicial de 6- APA, concentração iônica do meio reacional e presença de solvente orgânico (metanol). As variáveis-resposta utilizadas foram produtividade, seletividade e rendimento. Os ensaios foram conduzidos segundo um planejamento fatorial 25. As variáveis que mais influenciaram nas respostas foram: temperatura, pH e concentração inicial de 6-APA. O uso de EMFG para acilação do núcleo β- lactâmico, 6-APA, resulta num sistema reativo série-paralelo, cujas reações indesejadas de hidrólise (do EMFG e do antibiótico) ocorrem simultaneamente à de formação do antibiótico. Assim, a concentração máxima atingida de antibiótico depende das velocidades relativas das três reações. Observou-se que o maior rendimento de síntese foi obtido na temperatura de 4ºC, pH 6,5, sem adição de solvente orgânico e em meio reacional de baixa concentração iônica. Os resultados também mostraram que é possível operar o sistema com alta produtividade, e ainda se manterem os rendimento elevados a 25ºC, concentração mais elevada de reagentes, ausência de tampão fosfato e pH 6,5. Após a seleção das condições reacionais (25ºC, pH 6,5), ensaios, utilizando-se a PGA imobilizada em sílica, foram realizados. O derivado enzima-sílica sofre desgaste por cisalhamento em reator convencional, o que levou à utilização de reator de leito fixo. Parâmetros de resistência à transferência de massa externa e interna no suporte sobre a velocidade global de reação foram estimados a partir de dados experimentais, com auxílio de modelo matemático heterogêneo do leito catalítico com recirculação total, operando em regime transiente. O outro suporte empregado na imobilização de PGA foi agarose intercruzada, que tem maior resistência ao cisalhamento. Experimentos de síntese com concentrações iniciais de reagentes variando de 50 a 250mM, utilizando-se o derivado enzima-agarose, formaram o domínio para treinamento de redes neurais que pudessem prever as velocidades de reação, pois um modelo mecanístico das três reações, levando em conta efeitos inibitórios e alostéricos de reagentes e/ou produtos, mostrou-se muito complexo, com número intratável de parâmetros cinéticos. Simplificações desse modelo, diminuindo-se o número de parâmetros ajustáveis, não conseguiram representar os dados experimentais em toda a faixa de interesse. Conjuntos de dados para treinamento supervisionado foram alimentados a redes feedforward com uma camada oculta. Essa abordagem permitiu uma boa representação da síntese de ampicilina na faixa operacional estudada e também direcionou os ensaios para região onde se maximizassem produtividade e seletividade. As velocidades de reação previstas pelas redes neurais foram incluídas nas equações fundamentais de balanço de massa, compondo um modelo híbrido do processo. As simulações com o modelo híbridoneural direcionaram os ensaios de síntese para região onde se maximizaram a produtividade e seletividade da reação. Observou-se que aspecto importante para a melhoria da seletividade na produção de ampicilina era a operação do reator em uma região onde ocorria precipitação do antibiótico, pois quando este cristalizava no próprio reator, diminuía-se sua perda por hidrólise. Um biocatalisador adequado, que suportasse a precipitação da ampicilina no meio reacional, foi desenvolvido, patenteado e utilizado em reator de escoamento em vórtices de Taylor, onde as tensões de cisalhamento são menores. Sínteses utilizando concentrações altas de reagentes foram realizadas nesse reator, de modo a precipitar o antibiótico, incrementando-se rendimento, seletividade e produtividade do sistema.