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Operação ótima de reator para síntese enzimática de ampicilina com cristalização simultânea dos produtos.Ribeiro, Marcelo Perencin de Arruda 05 March 2007 (has links)
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Previous issue date: 2007-03-05 / Universidade Federal de Minas Gerais / Nowadays, industrial production of semi-synthetic penicillins requires low
temperatures, organochloride solvents and yields a great amount of non-recyclable wastes.
During the last decades, concerns about environmental impacts have increased, as well as the
environmental legislation restrictions. Thus, the pursuit of cleaner routes has been
encouraged. Enzymatic synthesis of these antibiotics, using penicillin G acylase (PGA) as
biocatalyst, may be carried out at mild temperatures and pH, and is an environmentalfriendly
route, alternative to the chemical synthesis. However, the low yields of the
enzymatic process are still a drawback for their industrial implementation. An enzymatic
semi-batch reactor using aqueous-precipitated medium is a promising approach to improve
process efficiency. Yet, finding the optimal operation condition of the reactor is still a
challenge, in order to make the enzymatic route economically competitive.
This thesis addresses this issue, focusing on several aspects of the enzymatic
synthesis of ampicillin. The comprehension of the reaction mechanism, still not a consensus
in the literature, was improved especially with respect to the role of the beta-lactam nucleus
during the formation of the acyl-enzyme intermediate, which has important consequences on
the reactor operation.
Diffusion in the biocatalyst pores and its influence on the pH profile within this
micro-environment were assessed through computer simulations. Results indicate
considerable diffusion resistances within the biocatalyst, yielding important pH profiles. The
process complexity leaded to the use of simplified mechanistic or empirical kinetic models.
Applying dynamic optimization (optimal control) techniques, feed profiles for
the reactants were obtained. A simplified model for the integrated semi-batch reactor for enzymatic synthesis of ampicillin with product crystallization was used for this purpose.
Different techniques of dynamic optimization provided qualitatively the same optimum
heuristics for the process operation.
Since simplified models were used in optimal open-loop control algorithms,
theoretical feed policies may diverge from those that would be needed to maintain the track of
the concentration profiles of the optimized reactor. Moreover, disturbances in the input
variables might lead the system to a different course. Thus, on-line monitoring is essential in
pilot plants or industrial reactors. Multivariate calibration using UV spectra was the basis for
the development of a system of analysis via flow injection (FIA), with good results.
Ampicillin synthesis assays using an industrial biocatalyst (Recordatti, Italy)
were run in order to improve some simplified kinetic models.
The re-estimated models were inserted in optimization algorithms, providing
trajectories in accordance with the same heuristics previously obtained. Experimental results
obtained after two runs in the integrated semi-continuous reactor put into evidence a
mismatch between model responses and the real process. This difference may be explained by
the extrapolation of the kinetic model with respect to the enzymatic reactor load. On the other
side, using a biocatalyst wrapped with a secondary inert matrix might alter the microenvironment
of the enzyme, especially with respect to pH.
Using a model that takes into account the effect of pH on the kinetics seems to
be important to allow the fine-tuning of the industrial reactor selectivity and productivity. / A produção industrial de penicilinas semi-sintéticas é conduzida sob condições
extremas de temperatura, demanda solventes organoclorados em seu processo e gera uma
grande quantidade de resíduos não recicláveis. As crescentes preocupações governamentais
em relação ao meio ambiente e a criação de leis de proteção ambiental nas últimas décadas
vêm colocando esses processos sobre críticas e incentivando a busca de rotas alternativas mais
limpas . A síntese enzimática desses antibióticos, usando penicilina G acilase (PGA) como
biocatalisador, pode ser efetuada em condições amenas de temperatura e pH e vem sendo
estudada como alternativa à rota atualmente empregada, mas o maior obstáculo para a
substituição da rota química pela enzimática ainda é o baixo rendimento desta última. O uso
de um reator enzimático semi-contínuo com um meio aquoso-precipitado é uma abordagem
promissora em termos de eficiência. Contudo, ainda é necessário otimizar sua operação para
que a rota enzimática seja economicamente competitiva.
Esta tese enfoca vários aspectos da síntese enzimática de ampicilina. Avançouse
na compreensão do mecanismo de reação, em pontos ainda não consensuais na literatura
em especial com respeito ao papel do núcleo beta-lactâmico durante a etapa de formação do
intermediário acil-enzima, com importantes conseqüências para a operação industrial do
reator.
A difusão nos poros do biocatalisador e sua influência sobre o perfil de pH
nesse micro-ambiente foram avaliadas por meio de simulações computacionais. Os resultados
indicam resistências difusivas apreciáveis no interior do biocatalisador, suficientes para gerar
perfis significativos de pH. A complexidade desse processo como um todo levou a que se
utilizassem modelos cinéticos mecanísticos simplificados ou empíricos.
Por meio de técnicas de otimização dinâmica (controle ótimo), perfis de
alimentação de reagentes foram obtidos. Para isso, um modelo simplificado do reator
enzimático semi-contínuo integrado, com cristalização dos produtos (desejado e indesejado),
foi utilizado. Respostas obtidas usando técnicas diferentes de otimização dinâmica resultaram,
qualitativamente, em uma mesma heurística ótima para a operação do reator.
Com a utilização de modelos simplificados, funções de alimentação obtidas
teoricamente com algoritmos de controle ótimo em malha aberta poderão desviar-se das
funções reais necessárias para manter os perfis de concentração no reator otimizado. Além
disso, perturbações nas variáveis de entrada poderão levar o sistema a percorrer trajetórias
diferentes. Assim, o monitoramento da reação em tempo real é imprescindível em um reator
piloto ou industrial. Neste contexto, foi desenvolvido um procedimento de análise em fluxo
incorporando técnicas de multicalibração. O procedimento proposto apresentou bons
resultados na quantificação dos componentes de interesse, mostrando-se como método
adequado para o monitoramento em tempo real do reator, principalmente, quando feita a
reconciliação dos dados obtidos a partir dos balanços de massa.
Ensaios de síntese de ampicilina, utilizando biocatalisador imobilizado
(Recordatti, Itália) foram realizados com o objetivo de melhorar alguns modelos cinéticos
simplificados.
Os modelos re-estimados foram inseridos em algoritmos de otimização,
resultando em trajetórias que seguem a mesma heurística obtida anteriormente. Entretanto,
duas corridas de validação da estratégia ótima, realizadas em reator semi-contínuo integrado,
evidenciaram um distanciamento entre o modelo utilizado e o processo real. Esses desvios
podem ser explicados pela extrapolação do modelo em termos da carga enzimática utilizada
no reator.
Um modelo que leve em conta o efeito do pH sobre a cinética parece ser
importante para permitir o ajuste fino da seletividade e produtividade do reator industrial.
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Síntese enzimática de ampicilina com diferentes substratos em reator integradoLeite, Geísa de Abreu 12 December 2008 (has links)
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Previous issue date: 2008-12-12 / Universidade Federal de Sao Carlos / Penicillin G acylase (PGA), EC 3.5.1.1.11, is an enzyme employed in the hydrolysis reactions of penicillin G to produce 6-amino penicillanic acid (6-APA), but it can also used in the synthesis of semi-synthetic antibiotics. This work investigated the influence of different biocatalysts conceptions and of different acyl donors on the ampicillin synthesis with immobilized PGA, determining experimentally yield data (antibiotic produced / consumed acyl donor), selectivity (antibiotic produced/D(-)-phenylglycine generated) and productivity (produced antibiotic (mmol)/UI/time). First of all, ampicilina synthesis were carried out in homogeneous solution (with substrates and products solubles), using industrial catalyst Recordatti, in order to verify the influence of the different acyl donors, D(-)- phenylgycine methyl (PGEM), ethyl (PGEE) and isopropyl (PGEI) esters on the synthesis of ampicillin. The results showed that the use of EEPG, besides not reducing the ampicillin synthesis rate, also it reduces the ester hydrolysis rate, showing great potential to increase the selectivity of the enzymatic route. The multipoint covalent attachment of PGA was carried out in agar-agarose support with medium diameter of 1.3 ± 7 × 10-2 mm. That biocatalyst was tested in the ampicillin synthesis at 25ºC with the methyl and ethyl esters, with the objective of evaluating its acting in two pH values (6.2 and 6.5). The ethyl ester presented the yield and selectivity (71 ± 4 and 2.2 ± 4 × 10-1) better than the phenylglycine methyl ester (67 ± 1 and 2.0 ± 1 × 10-1) being the pH 6,2 more favorable. Two different biocatalysts for use in the ampicillin synthesis with simultaneous crystallization of the products were tested: PGA immobilized within agarose particles with average diameter of 95.2 ± 3 × 10-1 μm and, soon after, wrapped by alginate gel, resulting in particles with average diameter of 2.1 ± 6 × 10-2 mm; and PGA immobilized in agarose ME particles (10% wt) with average diameter of 1.4 ± 8 × 10-2 mm. So much the envolvement of the immobilized enzyme by a secondary support (agarose-alginate catalyst) as the use of particles gel of millimetric dimensions (agarose 1.4 mm) caused modifications in the microambient of that enzyme, mainly in reason of the profiles of íons intra-particle generated with the progress of the reaction. In view of the above exposed, ampicillin synthesis were carried out in three different pHs (6.0; 6.2 and 6.5), at 25- °C, using the methyl, ethyl and isopropyl esters with excess of 6-APA. To reduce the hydrolyis of the produced antibiotic, making possible its industrial production, was necessary that it precipitates inside of the synthesis reactor. When we evaluated of global form the selectivity, yield and productivity we concluded that a promising strategy would be to carry out the synthesis using ethyl ester, alginate-PGA-agarose 6BCL catalyst in pH 6.2. By this condition was obtained productivity of 8.0 × 10-5 ± 8 × 10-6, selectivity 2.0 ± 2 × 10-1 and yield 62%. The reactions were also carried out with ester excess, however the selectivity was drastically reduced getting at 1.1 ± 6 × 10-2. The last stage of this work was the kinetic study of the ampicillin synthesis. Synthesis were carried out in several initial conditions of substrate concentration (6-APA and PGEE) in pH 6.0 and 6.2 with the alginate-PGA-agarose 6BCL catalyst. In some cases, ampicilin and D(-) -FG crystals were sowed in the reaction start to check possible inhibitory effects of the products. Largests yields and selectivities were obtained when the concentration of 6-APA was increased by the ester concentration. Inhibitory effect in the antibiotic hydrolysis was verified when a high concentration of both substrates was used. In general, the experiments carried out in heterogeneous medium favored the yield, selectivity and productivity. In all of the experiments the lowest pH (pH 6.0) favored the improvement of the yield and selectivity while the productivity was favored the pH 6.2. The synthesis in fed-batch reactor, with high concentration of substrates, favored the selectivity of the reaction, it passed from 2.5 to 3.5. / Penicilina G Acilase (PGA), EC 3.5.1.1.11, é uma enzima empregada nas reações de hidrólise da penicilina G para produção do ácido 6-amino penicilânico (6-APA), sendo também utilizada na síntese de antibióticos semi-sintéticos. Este trabalho levantou a influência de diferentes concepções de biocatalisador e de diferentes doadores acil sobre a síntese de ampicilina com PGA imobilizada, determinando experimentalmente dados de rendimento (antibiótico produzido/doador acil consumido), seletividade (antibiótico produzido/fenilglicina gerada) e produtividade (antibiótico produzido (mmol)/UI/tempo). Primeiramente foram realizadas sínteses de ampicilina em meio homogêneo (com substratos e produtos solúveis), utilizando catalisador industrial Recordatti, a fim de verificar a influência dos diferentes doadores acil, os ésteres metílico (EMFG), etílico (EEFG) e isopropílico (EIFG) de D-fenilglicina na síntese de ampicilina. Os resultados obtidos mostraram que a utilização de EEFG, além de não reduzir a velocidade de síntese de ampicilina, também diminuiu a velocidade de hidrólise do éster, mostrando grande potencial para aumentar a seletividade da rota enzimática. Em seguida, PGA foi imobilizada covalentemente em matriz agar-agarose com diâmetro médio de 1,3 ± 7 × 10-2 mm. Esse biocatalisador foi testado na síntese de ampicilina, a 25oC com os ésteres metílico e etílico, com o objetivo de avaliar seu desempenho em dois valores de pH (6,2 e 6,5). O éster etílico apresentou rendimentos e seletividades (71,0 ± 4 e 2,2 ± 4 × 10-1) melhores que o éster metílico de fenilglicina (67,0 ± 1 e 2,0 ± 1 × 10-1) sendo o pH 6,2 mais favorável. Dois diferentes biocatalisadores para uso na síntese de ampicilina com cristalização simultânea dos produtos foram testados: PGA imobilizada em partículas de agarose com diâmetro médio de 95,2 ± 3 × 10-1 μm e, em seguida, envolvida em gel de alginato, resultando em partículas com 2,1 ± 6 × 10-2 mm de diâmetro; e PGA imobilizada em partículas de agarose ME 10% ((m/m)) com 1,4 ± 8 × 10-2 mm de diâmetro. Tanto o envolvimento da enzima imobilizada por uma matriz secundária (caso do catalisador agarose-alginato) como o uso de partículas de gel de dimensões milimétricas (agarose 1,4 mm) causaram modificações no microambiente da enzima, principalmente em razão dos perfis intra-partícula de íons gerados com o avanço da reação. Em vista do exposto acima, sínteses de ampicilina foram realizadas em três diferentes pHs (6,0; 6,2 e 6,5), a 25oC, utilizando os ésteres metílico, etílico e isopropílico com excesso de 6- APA. Para reduzir a hidrólise do antibiótico produzido, viabilizando sua produção industrial, foi necessário que ele precipitasse dentro do próprio reator de síntese. Avaliando de forma global seletividade, rendimento e produtividade se concluiu que uma estratégia promissora seria realizar a síntese utilizando éster etílico, catalisador alginato-PGA-agarose 6BCL em pH 6,2. Condição em que se obteve produtividade de 8,0 × 10-5 ± 8 × 10-6, com seletividade 2,0 ± 2 × 10-1 e rendimento 62%. As reações também foram realizadas com excesso de éster, porém a seletividade foi drasticamente reduzida chegando a 1,1 ± 6 × 10-2. A última etapa do trabalho foi o estudo cinético da síntese de ampicilina. Sínteses foram realizadas em várias condições iniciais de concentração de substrato (6-APA e EEFG) em pH 6,0 e 6,2 com o catalisador alginato-PGA-agarose 6BCL. Em alguns casos cristais de ampicilina e D(-)-FG foram semeados no início da reação para verificar possíveis efeitos inibitórios dos produtos. Maiores rendimentos e seletividades foram alcançados quando se aumentava a concentração de 6-APA frente à concentração de éster. Efeito inibitório na hidrólise do antibiótico foi verificado quando se utilizou alta concentração de ambos os substratos. Em geral, os experimentos realizados em meio heterogêneo favoreceram rendimento, seletividade e produtividade. Em todos os experimentos o pH mais baixo (pH 6,0) favoreceu a melhora do rendimento e seletividade enquanto que a produtividade foi favorecida a pH 6,2. A síntese em reator batelada alimentada, com alta concentração dos substratos, favoreceu a seletividade da reação, que passou de 2,5 para 3,5.
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Síntese enzimática de ampicilina em reator integrado.Ferreira, Andrea Lopes de Oliveira 11 February 2004 (has links)
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Previous issue date: 2004-02-11 / Universidade Federal de Minas Gerais / Enzymatic route to produce antibiotic acts in mild reaction conditions
(aqueous medium, neutral pH and moderate temperatures). Furthermore it reduces
the number of reaction steps and decreases the amount and toxicity of waste
products per kilogram of antibiotic. The enzymatic synthesis of ampicillin from
phenylglycine methyl ester (PGME) and 6-aminopenicillanic acid (6-APA) can be
an attractive alternative, replacing the chemical route. The use of an immobilized
enzyme to catalyze the synthesis is very important to reduce costs. Penicillin G
acylase (PGA) [EC 3.5.1.11] from E. coli was immobilized on two supports
(agarose gel and silica). This work undertakes an optimization study of the
enzymatic synthesis of ampicillin, to find out optimized process conditions.
Therefore, it was studied the influence of the following variables: pH,
temperature, 6-APA initial concentration, buffer concentration and the presence of
methanol. Response variables were productivity, selectivity and yield (based on 6-
APA initial concentration). The assays were carried on accordind to factorial
design 25. Temperature, pH, and 6-APA initial concentration influenced
At synthesis of ampicillin from PGME and 6-APA, two other reactions
compete with the synthesis reaction: hydrolysis of PGME (a parallel reaction) and
hydrolysis of ampicillin (in series with the synthesis). The yield of the synthesis of
ampicillin depend on the rates of three different reactions. The highest yield was
achieved at 4ºC, pH 6.5, without methanol, and with low buffer concentration.
The results also indicate that it is possible to work with this system at high
productivities, and it still keeps high yields at 25ºC, without buffer, and pH 6.5.
After the selection of reaction conditions (25ºC, pH 6.5), assays with PGA
immobilized on silica carrier were realized. Convensional reactors may cause
shearing on derivative enzyme-silica, which led using fixed-bed reactor. Mass
transport parameters were estimated by fitting heterogeneous mathematical model
to experimental data of catalytic bed with recirculation, running on transient state.
Another used support on immobilized enzyme was agarose gel. Domain of
experimental assays used in the neural network training and validation were initial
substrate concentrations ranged from 50 to 250mM. A mechanistic model to
represent the synthesis of ampicillin from PGME and 6-APA is a set of seriesparallel
reactions (ampicillin and PGME hydrolysis are undesirable side reactions)
would be too complex, with an intractable number of kinetic parameters.
Simplified models could not represent all the experimental data, and a hybrid
model was used. Neural networks were trained to predict reaction rates and used
in the mass balance equations. A feedforward neural network, with one hidden
layer was used. Results of the simulation were promising. The operational region
that of high productivity and selectivity of antibiotic could be successfully
mapped. An important aspect to improve the selectivity of ampicillin synthesis is
to precipitate the antibiotic because the hydrolysis reaction would be decreasing.
An approprieted biocatalyst which preventing the precipitation was developed,
and used in a Taylor vortex reactor where shears are smaller. Synthesis assays
using high substrate concentrations were performed in this reactor, occurring
precipitate of antibiotic during reaction, to improve yield, selectivity, and productivity of this system. / A rota enzimática para produção de antibióticos atua em condições suaves de
temperatura, pressão e pH, em meio aquoso, além de ter bem menor impacto
ambiental. A síntese enzimática de ampicilina a partir de éster metílico de
fenilglicina (EMFG) e ácido 6-aminopenicilânico (6-APA) foi estudada como
alternativa à rota de produção química. O uso de enzimas imobilizadas é comum
na literatura devido aos benefícios que estas apresentam em relação às enzimas
solúveis: separação do meio reacional e reutilização do biocatalisador.
A enzima penicilina G acilase [EC 3.5.1.11] foi imobilizada em dois diferentes
suportes (sílica e agarose). O primeiro passo estudado para produção do
antibiótico foi a determinação das condições ótimas de operação. Assim, estudouse
a influência das seguintes variáveis: pH, temperatura, concentração inicial de 6-
APA, concentração iônica do meio reacional e presença de solvente orgânico
(metanol). As variáveis-resposta utilizadas foram produtividade, seletividade e
rendimento. Os ensaios foram conduzidos segundo um planejamento fatorial 25.
As variáveis que mais influenciaram nas respostas foram: temperatura, pH e
concentração inicial de 6-APA. O uso de EMFG para acilação do núcleo β-
lactâmico, 6-APA, resulta num sistema reativo série-paralelo, cujas reações
indesejadas de hidrólise (do EMFG e do antibiótico) ocorrem simultaneamente à
de formação do antibiótico. Assim, a concentração máxima atingida de antibiótico
depende das velocidades relativas das três reações. Observou-se que o maior
rendimento de síntese foi obtido na temperatura de 4ºC, pH 6,5, sem adição de
solvente orgânico e em meio reacional de baixa concentração iônica. Os
resultados também mostraram que é possível operar o sistema com alta
produtividade, e ainda se manterem os rendimento elevados a 25ºC, concentração
mais elevada de reagentes, ausência de tampão fosfato e pH 6,5.
Após a seleção das condições reacionais (25ºC, pH 6,5), ensaios, utilizando-se a
PGA imobilizada em sílica, foram realizados. O derivado enzima-sílica sofre
desgaste por cisalhamento em reator convencional, o que levou à utilização de
reator de leito fixo. Parâmetros de resistência à transferência de massa externa e
interna no suporte sobre a velocidade global de reação foram estimados a partir de
dados experimentais, com auxílio de modelo matemático heterogêneo do leito
catalítico com recirculação total, operando em regime transiente.
O outro suporte empregado na imobilização de PGA foi agarose intercruzada, que
tem maior resistência ao cisalhamento. Experimentos de síntese com
concentrações iniciais de reagentes variando de 50 a 250mM, utilizando-se o
derivado enzima-agarose, formaram o domínio para treinamento de redes neurais
que pudessem prever as velocidades de reação, pois um modelo mecanístico das
três reações, levando em conta efeitos inibitórios e alostéricos de reagentes e/ou
produtos, mostrou-se muito complexo, com número intratável de parâmetros
cinéticos. Simplificações desse modelo, diminuindo-se o número de parâmetros
ajustáveis, não conseguiram representar os dados experimentais em toda a faixa
de interesse. Conjuntos de dados para treinamento supervisionado foram
alimentados a redes feedforward com uma camada oculta. Essa abordagem
permitiu uma boa representação da síntese de ampicilina na faixa operacional
estudada e também direcionou os ensaios para região onde se maximizassem
produtividade e seletividade. As velocidades de reação previstas pelas redes neurais foram incluídas nas equações fundamentais de balanço de massa,
compondo um modelo híbrido do processo. As simulações com o modelo híbridoneural
direcionaram os ensaios de síntese para região onde se maximizaram a
produtividade e seletividade da reação.
Observou-se que aspecto importante para a melhoria da seletividade na produção
de ampicilina era a operação do reator em uma região onde ocorria precipitação
do antibiótico, pois quando este cristalizava no próprio reator, diminuía-se sua
perda por hidrólise. Um biocatalisador adequado, que suportasse a precipitação da
ampicilina no meio reacional, foi desenvolvido, patenteado e utilizado em reator
de escoamento em vórtices de Taylor, onde as tensões de cisalhamento são
menores. Sínteses utilizando concentrações altas de reagentes foram realizadas
nesse reator, de modo a precipitar o antibiótico, incrementando-se rendimento,
seletividade e produtividade do sistema.
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