Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseMPAR.pdf: 5068377 bytes, checksum: 767cce78099d3010d32f9d63d3c82e23 (MD5) Previous issue date: 2007-03-05 / Universidade Federal de Minas Gerais / Nowadays, industrial production of semi-synthetic penicillins requires low temperatures, organochloride solvents and yields a great amount of non-recyclable wastes. During the last decades, concerns about environmental impacts have increased, as well as the environmental legislation restrictions. Thus, the pursuit of cleaner routes has been encouraged. Enzymatic synthesis of these antibiotics, using penicillin G acylase (PGA) as biocatalyst, may be carried out at mild temperatures and pH, and is an environmentalfriendly route, alternative to the chemical synthesis. However, the low yields of the enzymatic process are still a drawback for their industrial implementation. An enzymatic semi-batch reactor using aqueous-precipitated medium is a promising approach to improve process efficiency. Yet, finding the optimal operation condition of the reactor is still a challenge, in order to make the enzymatic route economically competitive. This thesis addresses this issue, focusing on several aspects of the enzymatic synthesis of ampicillin. The comprehension of the reaction mechanism, still not a consensus in the literature, was improved especially with respect to the role of the beta-lactam nucleus during the formation of the acyl-enzyme intermediate, which has important consequences on the reactor operation. Diffusion in the biocatalyst pores and its influence on the pH profile within this micro-environment were assessed through computer simulations. Results indicate considerable diffusion resistances within the biocatalyst, yielding important pH profiles. The process complexity leaded to the use of simplified mechanistic or empirical kinetic models. Applying dynamic optimization (optimal control) techniques, feed profiles for the reactants were obtained. A simplified model for the integrated semi-batch reactor for enzymatic synthesis of ampicillin with product crystallization was used for this purpose. Different techniques of dynamic optimization provided qualitatively the same optimum heuristics for the process operation. Since simplified models were used in optimal open-loop control algorithms, theoretical feed policies may diverge from those that would be needed to maintain the track of the concentration profiles of the optimized reactor. Moreover, disturbances in the input variables might lead the system to a different course. Thus, on-line monitoring is essential in pilot plants or industrial reactors. Multivariate calibration using UV spectra was the basis for the development of a system of analysis via flow injection (FIA), with good results. Ampicillin synthesis assays using an industrial biocatalyst (Recordatti, Italy) were run in order to improve some simplified kinetic models. The re-estimated models were inserted in optimization algorithms, providing trajectories in accordance with the same heuristics previously obtained. Experimental results obtained after two runs in the integrated semi-continuous reactor put into evidence a mismatch between model responses and the real process. This difference may be explained by the extrapolation of the kinetic model with respect to the enzymatic reactor load. On the other side, using a biocatalyst wrapped with a secondary inert matrix might alter the microenvironment of the enzyme, especially with respect to pH. Using a model that takes into account the effect of pH on the kinetics seems to be important to allow the fine-tuning of the industrial reactor selectivity and productivity. / A produção industrial de penicilinas semi-sintéticas é conduzida sob condições extremas de temperatura, demanda solventes organoclorados em seu processo e gera uma grande quantidade de resíduos não recicláveis. As crescentes preocupações governamentais em relação ao meio ambiente e a criação de leis de proteção ambiental nas últimas décadas vêm colocando esses processos sobre críticas e incentivando a busca de rotas alternativas mais limpas . A síntese enzimática desses antibióticos, usando penicilina G acilase (PGA) como biocatalisador, pode ser efetuada em condições amenas de temperatura e pH e vem sendo estudada como alternativa à rota atualmente empregada, mas o maior obstáculo para a substituição da rota química pela enzimática ainda é o baixo rendimento desta última. O uso de um reator enzimático semi-contínuo com um meio aquoso-precipitado é uma abordagem promissora em termos de eficiência. Contudo, ainda é necessário otimizar sua operação para que a rota enzimática seja economicamente competitiva. Esta tese enfoca vários aspectos da síntese enzimática de ampicilina. Avançouse na compreensão do mecanismo de reação, em pontos ainda não consensuais na literatura em especial com respeito ao papel do núcleo beta-lactâmico durante a etapa de formação do intermediário acil-enzima, com importantes conseqüências para a operação industrial do reator. A difusão nos poros do biocatalisador e sua influência sobre o perfil de pH nesse micro-ambiente foram avaliadas por meio de simulações computacionais. Os resultados indicam resistências difusivas apreciáveis no interior do biocatalisador, suficientes para gerar perfis significativos de pH. A complexidade desse processo como um todo levou a que se utilizassem modelos cinéticos mecanísticos simplificados ou empíricos. Por meio de técnicas de otimização dinâmica (controle ótimo), perfis de alimentação de reagentes foram obtidos. Para isso, um modelo simplificado do reator enzimático semi-contínuo integrado, com cristalização dos produtos (desejado e indesejado), foi utilizado. Respostas obtidas usando técnicas diferentes de otimização dinâmica resultaram, qualitativamente, em uma mesma heurística ótima para a operação do reator. Com a utilização de modelos simplificados, funções de alimentação obtidas teoricamente com algoritmos de controle ótimo em malha aberta poderão desviar-se das funções reais necessárias para manter os perfis de concentração no reator otimizado. Além disso, perturbações nas variáveis de entrada poderão levar o sistema a percorrer trajetórias diferentes. Assim, o monitoramento da reação em tempo real é imprescindível em um reator piloto ou industrial. Neste contexto, foi desenvolvido um procedimento de análise em fluxo incorporando técnicas de multicalibração. O procedimento proposto apresentou bons resultados na quantificação dos componentes de interesse, mostrando-se como método adequado para o monitoramento em tempo real do reator, principalmente, quando feita a reconciliação dos dados obtidos a partir dos balanços de massa. Ensaios de síntese de ampicilina, utilizando biocatalisador imobilizado (Recordatti, Itália) foram realizados com o objetivo de melhorar alguns modelos cinéticos simplificados. Os modelos re-estimados foram inseridos em algoritmos de otimização, resultando em trajetórias que seguem a mesma heurística obtida anteriormente. Entretanto, duas corridas de validação da estratégia ótima, realizadas em reator semi-contínuo integrado, evidenciaram um distanciamento entre o modelo utilizado e o processo real. Esses desvios podem ser explicados pela extrapolação do modelo em termos da carga enzimática utilizada no reator. Um modelo que leve em conta o efeito do pH sobre a cinética parece ser importante para permitir o ajuste fino da seletividade e produtividade do reator industrial.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2414.pdf: 14993428 bytes, checksum: da8b438d6672bb118531117cfa66edcb (MD5) Previous issue date: 2008-12-12 / Universidade Federal de Sao Carlos / Penicillin G acylase (PGA), EC 3.5.1.1.11, is an enzyme employed in the hydrolysis reactions of penicillin G to produce 6-amino penicillanic acid (6-APA), but it can also used in the synthesis of semi-synthetic antibiotics. This work investigated the influence of different biocatalysts conceptions and of different acyl donors on the ampicillin synthesis with immobilized PGA, determining experimentally yield data (antibiotic produced / consumed acyl donor), selectivity (antibiotic produced/D(-)-phenylglycine generated) and productivity (produced antibiotic (mmol)/UI/time). First of all, ampicilina synthesis were carried out in homogeneous solution (with substrates and products solubles), using industrial catalyst Recordatti, in order to verify the influence of the different acyl donors, D(-)- phenylgycine methyl (PGEM), ethyl (PGEE) and isopropyl (PGEI) esters on the synthesis of ampicillin. The results showed that the use of EEPG, besides not reducing the ampicillin synthesis rate, also it reduces the ester hydrolysis rate, showing great potential to increase the selectivity of the enzymatic route. The multipoint covalent attachment of PGA was carried out in agar-agarose support with medium diameter of 1.3 ± 7 × 10-2 mm. That biocatalyst was tested in the ampicillin synthesis at 25ºC with the methyl and ethyl esters, with the objective of evaluating its acting in two pH values (6.2 and 6.5). The ethyl ester presented the yield and selectivity (71 ± 4 and 2.2 ± 4 × 10-1) better than the phenylglycine methyl ester (67 ± 1 and 2.0 ± 1 × 10-1) being the pH 6,2 more favorable. Two different biocatalysts for use in the ampicillin synthesis with simultaneous crystallization of the products were tested: PGA immobilized within agarose particles with average diameter of 95.2 ± 3 × 10-1 μm and, soon after, wrapped by alginate gel, resulting in particles with average diameter of 2.1 ± 6 × 10-2 mm; and PGA immobilized in agarose ME particles (10% wt) with average diameter of 1.4 ± 8 × 10-2 mm. So much the envolvement of the immobilized enzyme by a secondary support (agarose-alginate catalyst) as the use of particles gel of millimetric dimensions (agarose 1.4 mm) caused modifications in the microambient of that enzyme, mainly in reason of the profiles of íons intra-particle generated with the progress of the reaction. In view of the above exposed, ampicillin synthesis were carried out in three different pHs (6.0; 6.2 and 6.5), at 25- °C, using the methyl, ethyl and isopropyl esters with excess of 6-APA. To reduce the hydrolyis of the produced antibiotic, making possible its industrial production, was necessary that it precipitates inside of the synthesis reactor. When we evaluated of global form the selectivity, yield and productivity we concluded that a promising strategy would be to carry out the synthesis using ethyl ester, alginate-PGA-agarose 6BCL catalyst in pH 6.2. By this condition was obtained productivity of 8.0 × 10-5 ± 8 × 10-6, selectivity 2.0 ± 2 × 10-1 and yield 62%. The reactions were also carried out with ester excess, however the selectivity was drastically reduced getting at 1.1 ± 6 × 10-2. The last stage of this work was the kinetic study of the ampicillin synthesis. Synthesis were carried out in several initial conditions of substrate concentration (6-APA and PGEE) in pH 6.0 and 6.2 with the alginate-PGA-agarose 6BCL catalyst. In some cases, ampicilin and D(-) -FG crystals were sowed in the reaction start to check possible inhibitory effects of the products. Largests yields and selectivities were obtained when the concentration of 6-APA was increased by the ester concentration. Inhibitory effect in the antibiotic hydrolysis was verified when a high concentration of both substrates was used. In general, the experiments carried out in heterogeneous medium favored the yield, selectivity and productivity. In all of the experiments the lowest pH (pH 6.0) favored the improvement of the yield and selectivity while the productivity was favored the pH 6.2. The synthesis in fed-batch reactor, with high concentration of substrates, favored the selectivity of the reaction, it passed from 2.5 to 3.5. / Penicilina G Acilase (PGA), EC 3.5.1.1.11, é uma enzima empregada nas reações de hidrólise da penicilina G para produção do ácido 6-amino penicilânico (6-APA), sendo também utilizada na síntese de antibióticos semi-sintéticos. Este trabalho levantou a influência de diferentes concepções de biocatalisador e de diferentes doadores acil sobre a síntese de ampicilina com PGA imobilizada, determinando experimentalmente dados de rendimento (antibiótico produzido/doador acil consumido), seletividade (antibiótico produzido/fenilglicina gerada) e produtividade (antibiótico produzido (mmol)/UI/tempo). Primeiramente foram realizadas sínteses de ampicilina em meio homogêneo (com substratos e produtos solúveis), utilizando catalisador industrial Recordatti, a fim de verificar a influência dos diferentes doadores acil, os ésteres metílico (EMFG), etílico (EEFG) e isopropílico (EIFG) de D-fenilglicina na síntese de ampicilina. Os resultados obtidos mostraram que a utilização de EEFG, além de não reduzir a velocidade de síntese de ampicilina, também diminuiu a velocidade de hidrólise do éster, mostrando grande potencial para aumentar a seletividade da rota enzimática. Em seguida, PGA foi imobilizada covalentemente em matriz agar-agarose com diâmetro médio de 1,3 ± 7 × 10-2 mm. Esse biocatalisador foi testado na síntese de ampicilina, a 25oC com os ésteres metílico e etílico, com o objetivo de avaliar seu desempenho em dois valores de pH (6,2 e 6,5). O éster etílico apresentou rendimentos e seletividades (71,0 ± 4 e 2,2 ± 4 × 10-1) melhores que o éster metílico de fenilglicina (67,0 ± 1 e 2,0 ± 1 × 10-1) sendo o pH 6,2 mais favorável. Dois diferentes biocatalisadores para uso na síntese de ampicilina com cristalização simultânea dos produtos foram testados: PGA imobilizada em partículas de agarose com diâmetro médio de 95,2 ± 3 × 10-1 μm e, em seguida, envolvida em gel de alginato, resultando em partículas com 2,1 ± 6 × 10-2 mm de diâmetro; e PGA imobilizada em partículas de agarose ME 10% ((m/m)) com 1,4 ± 8 × 10-2 mm de diâmetro. Tanto o envolvimento da enzima imobilizada por uma matriz secundária (caso do catalisador agarose-alginato) como o uso de partículas de gel de dimensões milimétricas (agarose 1,4 mm) causaram modificações no microambiente da enzima, principalmente em razão dos perfis intra-partícula de íons gerados com o avanço da reação. Em vista do exposto acima, sínteses de ampicilina foram realizadas em três diferentes pHs (6,0; 6,2 e 6,5), a 25oC, utilizando os ésteres metílico, etílico e isopropílico com excesso de 6- APA. Para reduzir a hidrólise do antibiótico produzido, viabilizando sua produção industrial, foi necessário que ele precipitasse dentro do próprio reator de síntese. Avaliando de forma global seletividade, rendimento e produtividade se concluiu que uma estratégia promissora seria realizar a síntese utilizando éster etílico, catalisador alginato-PGA-agarose 6BCL em pH 6,2. Condição em que se obteve produtividade de 8,0 × 10-5 ± 8 × 10-6, com seletividade 2,0 ± 2 × 10-1 e rendimento 62%. As reações também foram realizadas com excesso de éster, porém a seletividade foi drasticamente reduzida chegando a 1,1 ± 6 × 10-2. A última etapa do trabalho foi o estudo cinético da síntese de ampicilina. Sínteses foram realizadas em várias condições iniciais de concentração de substrato (6-APA e EEFG) em pH 6,0 e 6,2 com o catalisador alginato-PGA-agarose 6BCL. Em alguns casos cristais de ampicilina e D(-)-FG foram semeados no início da reação para verificar possíveis efeitos inibitórios dos produtos. Maiores rendimentos e seletividades foram alcançados quando se aumentava a concentração de 6-APA frente à concentração de éster. Efeito inibitório na hidrólise do antibiótico foi verificado quando se utilizou alta concentração de ambos os substratos. Em geral, os experimentos realizados em meio heterogêneo favoreceram rendimento, seletividade e produtividade. Em todos os experimentos o pH mais baixo (pH 6,0) favoreceu a melhora do rendimento e seletividade enquanto que a produtividade foi favorecida a pH 6,2. A síntese em reator batelada alimentada, com alta concentração dos substratos, favoreceu a seletividade da reação, que passou de 2,5 para 3,5.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseALOF.pdf: 1727082 bytes, checksum: 2bafd71518dd7f0aa291c11a17ad0841 (MD5) Previous issue date: 2004-02-11 / Universidade Federal de Minas Gerais / Enzymatic route to produce antibiotic acts in mild reaction conditions (aqueous medium, neutral pH and moderate temperatures). Furthermore it reduces the number of reaction steps and decreases the amount and toxicity of waste products per kilogram of antibiotic. The enzymatic synthesis of ampicillin from phenylglycine methyl ester (PGME) and 6-aminopenicillanic acid (6-APA) can be an attractive alternative, replacing the chemical route. The use of an immobilized enzyme to catalyze the synthesis is very important to reduce costs. Penicillin G acylase (PGA) [EC 3.5.1.11] from E. coli was immobilized on two supports (agarose gel and silica). This work undertakes an optimization study of the enzymatic synthesis of ampicillin, to find out optimized process conditions. Therefore, it was studied the influence of the following variables: pH, temperature, 6-APA initial concentration, buffer concentration and the presence of methanol. Response variables were productivity, selectivity and yield (based on 6- APA initial concentration). The assays were carried on accordind to factorial design 25. Temperature, pH, and 6-APA initial concentration influenced At synthesis of ampicillin from PGME and 6-APA, two other reactions compete with the synthesis reaction: hydrolysis of PGME (a parallel reaction) and hydrolysis of ampicillin (in series with the synthesis). The yield of the synthesis of ampicillin depend on the rates of three different reactions. The highest yield was achieved at 4ºC, pH 6.5, without methanol, and with low buffer concentration. The results also indicate that it is possible to work with this system at high productivities, and it still keeps high yields at 25ºC, without buffer, and pH 6.5. After the selection of reaction conditions (25ºC, pH 6.5), assays with PGA immobilized on silica carrier were realized. Convensional reactors may cause shearing on derivative enzyme-silica, which led using fixed-bed reactor. Mass transport parameters were estimated by fitting heterogeneous mathematical model to experimental data of catalytic bed with recirculation, running on transient state. Another used support on immobilized enzyme was agarose gel. Domain of experimental assays used in the neural network training and validation were initial substrate concentrations ranged from 50 to 250mM. A mechanistic model to represent the synthesis of ampicillin from PGME and 6-APA is a set of seriesparallel reactions (ampicillin and PGME hydrolysis are undesirable side reactions) would be too complex, with an intractable number of kinetic parameters. Simplified models could not represent all the experimental data, and a hybrid model was used. Neural networks were trained to predict reaction rates and used in the mass balance equations. A feedforward neural network, with one hidden layer was used. Results of the simulation were promising. The operational region that of high productivity and selectivity of antibiotic could be successfully mapped. An important aspect to improve the selectivity of ampicillin synthesis is to precipitate the antibiotic because the hydrolysis reaction would be decreasing. An approprieted biocatalyst which preventing the precipitation was developed, and used in a Taylor vortex reactor where shears are smaller. Synthesis assays using high substrate concentrations were performed in this reactor, occurring precipitate of antibiotic during reaction, to improve yield, selectivity, and productivity of this system. / A rota enzimática para produção de antibióticos atua em condições suaves de temperatura, pressão e pH, em meio aquoso, além de ter bem menor impacto ambiental. A síntese enzimática de ampicilina a partir de éster metílico de fenilglicina (EMFG) e ácido 6-aminopenicilânico (6-APA) foi estudada como alternativa à rota de produção química. O uso de enzimas imobilizadas é comum na literatura devido aos benefícios que estas apresentam em relação às enzimas solúveis: separação do meio reacional e reutilização do biocatalisador. A enzima penicilina G acilase [EC 3.5.1.11] foi imobilizada em dois diferentes suportes (sílica e agarose). O primeiro passo estudado para produção do antibiótico foi a determinação das condições ótimas de operação. Assim, estudouse a influência das seguintes variáveis: pH, temperatura, concentração inicial de 6- APA, concentração iônica do meio reacional e presença de solvente orgânico (metanol). As variáveis-resposta utilizadas foram produtividade, seletividade e rendimento. Os ensaios foram conduzidos segundo um planejamento fatorial 25. As variáveis que mais influenciaram nas respostas foram: temperatura, pH e concentração inicial de 6-APA. O uso de EMFG para acilação do núcleo β- lactâmico, 6-APA, resulta num sistema reativo série-paralelo, cujas reações indesejadas de hidrólise (do EMFG e do antibiótico) ocorrem simultaneamente à de formação do antibiótico. Assim, a concentração máxima atingida de antibiótico depende das velocidades relativas das três reações. Observou-se que o maior rendimento de síntese foi obtido na temperatura de 4ºC, pH 6,5, sem adição de solvente orgânico e em meio reacional de baixa concentração iônica. Os resultados também mostraram que é possível operar o sistema com alta produtividade, e ainda se manterem os rendimento elevados a 25ºC, concentração mais elevada de reagentes, ausência de tampão fosfato e pH 6,5. Após a seleção das condições reacionais (25ºC, pH 6,5), ensaios, utilizando-se a PGA imobilizada em sílica, foram realizados. O derivado enzima-sílica sofre desgaste por cisalhamento em reator convencional, o que levou à utilização de reator de leito fixo. Parâmetros de resistência à transferência de massa externa e interna no suporte sobre a velocidade global de reação foram estimados a partir de dados experimentais, com auxílio de modelo matemático heterogêneo do leito catalítico com recirculação total, operando em regime transiente. O outro suporte empregado na imobilização de PGA foi agarose intercruzada, que tem maior resistência ao cisalhamento. Experimentos de síntese com concentrações iniciais de reagentes variando de 50 a 250mM, utilizando-se o derivado enzima-agarose, formaram o domínio para treinamento de redes neurais que pudessem prever as velocidades de reação, pois um modelo mecanístico das três reações, levando em conta efeitos inibitórios e alostéricos de reagentes e/ou produtos, mostrou-se muito complexo, com número intratável de parâmetros cinéticos. Simplificações desse modelo, diminuindo-se o número de parâmetros ajustáveis, não conseguiram representar os dados experimentais em toda a faixa de interesse. Conjuntos de dados para treinamento supervisionado foram alimentados a redes feedforward com uma camada oculta. Essa abordagem permitiu uma boa representação da síntese de ampicilina na faixa operacional estudada e também direcionou os ensaios para região onde se maximizassem produtividade e seletividade. As velocidades de reação previstas pelas redes neurais foram incluídas nas equações fundamentais de balanço de massa, compondo um modelo híbrido do processo. As simulações com o modelo híbridoneural direcionaram os ensaios de síntese para região onde se maximizaram a produtividade e seletividade da reação. Observou-se que aspecto importante para a melhoria da seletividade na produção de ampicilina era a operação do reator em uma região onde ocorria precipitação do antibiótico, pois quando este cristalizava no próprio reator, diminuía-se sua perda por hidrólise. Um biocatalisador adequado, que suportasse a precipitação da ampicilina no meio reacional, foi desenvolvido, patenteado e utilizado em reator de escoamento em vórtices de Taylor, onde as tensões de cisalhamento são menores. Sínteses utilizando concentrações altas de reagentes foram realizadas nesse reator, de modo a precipitar o antibiótico, incrementando-se rendimento, seletividade e produtividade do sistema.