Tie1 é um receptor tirosina quinase expresso em células endoteliais importante em angiogênese, formação de vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes. Este receptor pertence a uma família pequena composta por apenas dois membros (Tie1 e Tie2) para os quais angiopoietinas foram identificadas como ligantes de Tie2. No entanto, Tie1 continua a ser um receptor órfão, sem ligantes identificados até o momento. Sendo assim, é difícil compreender completamente as propriedades biológicas de Tie1 e seus mecanismos moleculares em angiogênese sem um ligante identificado. Entretanto, como sugerido através de estudos de deleção gênica, este receptor é uma molécula essencial na angiogênese, apresentando um papel importante no desenvolvimento da vascularização da retina e desenvolvimento de tumores. O nosso objetivo foi estudar a participação do domínio extracelular de Tie1 na neovascularização e, no processo, identificar possíveis ligantes para este receptor. Através da tecnologia de phage display, identificamos um peptídeo específico e seletivo para Tie1, sugerindo a existência de um sítio de ligação único neste receptor. Mostramos que este peptídeo é capaz de inibir a proliferação de células endoteliais induzida por Ang1, um ligante bem caracterizado de Tie2 que também modula a atividade de Tie1. Além disso, também mostramos que este peptídeo inibe a angiogênese in vivo num modelo animal bastante relevante para estudo de doenças humanas, o modelo da retinopatia induzida por oxigênio. Uma vez que este peptídeo liga-se a um sítio único e seletivo para Tie1, hipotetizamos que o mesmo poderia mimetizar possíveis ligantes naturais deste receptor. Para identificá-los, proteínas com mimetopo cruzado com este peptídeo foram identificadas em extrato proteico de diferentes linhagens celulares. Tais proteínas são possíveis candidatos a interação com Tie1. Em resumo, demonstramos que o domínio extracelular de Tie1 é importante para a angiogênese patológica e identificamos proteínas como possíveis ligantes deste receptor, o que poderá contribuir para um melhor entendimento da participação de Tie1 na formação de vasos. O peptídeo aqui identificado poderá ser ainda uma ferramenta útil para o desenvolvimento de novas terapias anti-angiogênicas com importantes aplicações à saúde humana. / Tie1 is a tyrosine kinase receptor expressed by endothelial cells and important in angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones. This receptor belongs to a small family of receptors composed of two members only (Tie1 and Tie2) to which angiopoietins have been identified as ligands for Tie2. On the other hand, Tie1 is still an orphan receptor with no ligand identified to date. Thus, it is difficult to assess Tie1 mechanism of action in neovascularization without a known ligand. Nevertheless, gene deletion studies have shown that Tie1 is essential in angiogenesis, and plays an important role in retinal and tumoral vascularization. The aim of our study was to evaluate the participation of Tie1 extracellular domain in angiogenesis, and in the process, to identify putative ligands for this receptor. Utilizing phage display, we have identified and characterized a Tie1 specific and selective ligand peptide, which suggests the existence of a binding site unique to this receptor and not shared by other family members. We show that this peptide prevents endothelial cells proliferation, induced by angiopoetin-1, a ligand for Tie2 but which also modulates Tie1 activity. Using a well-accepted mouse model for human diseases, the oxygen induced retinopathy model, we show that this peptide inhibits angiogenesis in vivo. Since this peptide maps to a unique binding site in Tie1, we hypothesized that it might mimic a natural ligand for this receptor. To identify them, proteins with cross reactive epitopes with an anti-peptide sera were identified by proteomic approaches. These proteins are thus possible ligands for Tie1. In summary, we have shown that Tie1 extracellular domain is important in angiogenesis and we have identified putative ligand for this receptor, which might contribute to a better understanding of the molecular mechanisms associated with Tie1 in blood vessel formation. The peptide here characterized may also be an important tool for the development of novel anti-angiogenesis therapeutic approaches for disesase with an angiogenic component.

Tie1 é um receptor tirosina quinase expresso em células endoteliais importante em angiogênese, formação de vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes. Este receptor pertence a uma família pequena composta por apenas dois membros (Tie1 e Tie2) para os quais angiopoietinas foram identificadas como ligantes de Tie2. No entanto, Tie1 continua a ser um receptor órfão, sem ligantes identificados até o momento. Sendo assim, é difícil compreender completamente as propriedades biológicas de Tie1 e seus mecanismos moleculares em angiogênese sem um ligante identificado. Entretanto, como sugerido através de estudos de deleção gênica, este receptor é uma molécula essencial na angiogênese, apresentando um papel importante no desenvolvimento da vascularização da retina e desenvolvimento de tumores. O nosso objetivo foi estudar a participação do domínio extracelular de Tie1 na neovascularização e, no processo, identificar possíveis ligantes para este receptor. Através da tecnologia de phage display, identificamos um peptídeo específico e seletivo para Tie1, sugerindo a existência de um sítio de ligação único neste receptor. Mostramos que este peptídeo é capaz de inibir a proliferação de células endoteliais induzida por Ang1, um ligante bem caracterizado de Tie2 que também modula a atividade de Tie1. Além disso, também mostramos que este peptídeo inibe a angiogênese in vivo num modelo animal bastante relevante para estudo de doenças humanas, o modelo da retinopatia induzida por oxigênio. Uma vez que este peptídeo liga-se a um sítio único e seletivo para Tie1, hipotetizamos que o mesmo poderia mimetizar possíveis ligantes naturais deste receptor. Para identificá-los, proteínas com mimetopo cruzado com este peptídeo foram identificadas em extrato proteico de diferentes linhagens celulares. Tais proteínas são possíveis candidatos a interação com Tie1. Em resumo, demonstramos que o domínio extracelular de Tie1 é importante para a angiogênese patológica e identificamos proteínas como possíveis ligantes deste receptor, o que poderá contribuir para um melhor entendimento da participação de Tie1 na formação de vasos. O peptídeo aqui identificado poderá ser ainda uma ferramenta útil para o desenvolvimento de novas terapias anti-angiogênicas com importantes aplicações à saúde humana. / Tie1 is a tyrosine kinase receptor expressed by endothelial cells and important in angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones. This receptor belongs to a small family of receptors composed of two members only (Tie1 and Tie2) to which angiopoietins have been identified as ligands for Tie2. On the other hand, Tie1 is still an orphan receptor with no ligand identified to date. Thus, it is difficult to assess Tie1 mechanism of action in neovascularization without a known ligand. Nevertheless, gene deletion studies have shown that Tie1 is essential in angiogenesis, and plays an important role in retinal and tumoral vascularization. The aim of our study was to evaluate the participation of Tie1 extracellular domain in angiogenesis, and in the process, to identify putative ligands for this receptor. Utilizing phage display, we have identified and characterized a Tie1 specific and selective ligand peptide, which suggests the existence of a binding site unique to this receptor and not shared by other family members. We show that this peptide prevents endothelial cells proliferation, induced by angiopoetin-1, a ligand for Tie2 but which also modulates Tie1 activity. Using a well-accepted mouse model for human diseases, the oxygen induced retinopathy model, we show that this peptide inhibits angiogenesis in vivo. Since this peptide maps to a unique binding site in Tie1, we hypothesized that it might mimic a natural ligand for this receptor. To identify them, proteins with cross reactive epitopes with an anti-peptide sera were identified by proteomic approaches. These proteins are thus possible ligands for Tie1. In summary, we have shown that Tie1 extracellular domain is important in angiogenesis and we have identified putative ligand for this receptor, which might contribute to a better understanding of the molecular mechanisms associated with Tie1 in blood vessel formation. The peptide here characterized may also be an important tool for the development of novel anti-angiogenesis therapeutic approaches for disesase with an angiogenic component.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia do mesilato de imatinibe, em comparação com a quimioterapia usual com vimblastina e prednisona, no tratamento do mastocitoma canino e descrever os efeitos colaterais apresentados pelas medicações. Bem como analisar a expressão do VEGF (fator de crescimento endotelial), a relação da expressão do gene c-kit por RT-PCR e marcação imunoistoquímica do KIT com a presença de mutações na justamembrana e a relação desta mutação com a resposta à terapia. Para tanto foram incluídos 29 animais com diagnóstico citológico de mastocitoma, estes animais foram submetidos a tomografia computadorizada para determinação das medidas das formações cutâneas e em seguida divididos em 2 grupos. O grupo 1 foi tratado com o protocolo quimioterápico de vimblastina e prednisona por 12 semanas e o grupo 2 com o mesilato de imatinibe na dose de 10 mg/Kg a cada 24 horas por 8 semanas. A avaliação da resposta ao tratamento foi realizada com mensurações periódicas das formações com paquímetro e nova tomografia ao final do tratamento para mensuração do maior diâmetro e volume tumoral. Um fragmento das formações cutâneas foi coletado antes do início do tratamento para graduação histológica da neoplasia, determinação do índice mitótico e imunomarcação para KIT, VEGF e Ki- 67. Parte do material coletado teve o DNA e RNA extraídos e posterior sequenciamento dos exons 11 do gene c-kit e determinação da expressão deste e do seu ligante por RT-PCR. A toxicidade a medicação foi avaliada segundo as normas do VCOG 1.1.A taxa de resposta do grupo VP foi de 7,7 % e no grupo MI de 28,6%, embora os pacientes tratados com mesilato de imatinibe tenham apresentado maior chance de resposta a terapia, não foi observado diferença entre os dois grupos. Os dois protocolos foram bem tolerados, os pacientes do grupo MI d menor número de efeitos colaterais. O grau histológico, Indice mitótico, padrão imunohistoquimico do KIT, além da quantificação do ki-67 foram homogêneos nos dois grupos e não influenciaram na resposta ao tratamento. A quantificação do VEGF foi mais intensa nos pacientes com remissão parcial e total. Não foi observado relação entre a quantificação do KIT e a expressão do gene c-kit, que foi maior nos pacientes que responderam ao tratamento, porém a associação desta com a resposta a terapia não pode ser determinada. Mutações ativantes no exon11 do gene c-kit não foram identificadas. O tratamento com o mesilato de imatinibe é bem tolerado pelos animais, no entanto este não se mostrou superior ao protocolo padrão de quimioterapia para o tratamento do mastocitoma; este resultado pode ter sido influenciado pelo número de animais incluídos no estudo. Mutações em outros domínios do receptor KIT e a ação do ITK em receptores como do PDGF e o VEGF podem estar relacionados a resposta a esta classe de fármacos observada neste estudo, a despeito da ausência de mutações ativantes no exon 11 do gene c-kit. / The objective of this study was to evaluate the efficacy of imatinib mesylate, compared with the usual chemotherapy with vinblastine and prednisone in the treatment of canine mast cell tumor and describe the side effects submitted by medications. Well as analyzing the expression of VEGF (vascular endothelial growth factor), the relationship between the expression of c-kit gene by RT-PCR and immunohistochemical staining of KIT with the presence of mutations in the juxtamembrane and the relationship of this mutation with response to therapy. For both 29 animals with cytological diagnosis of mast cell tumor were included, these animals underwent computed tomography to determine the measured skin formations and then divided into 2 groups. Group 1 was treated with the chemotherapeutic protocol vinblastine and prednisone for 12 weeks and the second group with the imatinib mesylate in a dose of 10 mg / kg every 24 hours for 8 weeks. The assessment of response to treatment was performed with periodic measurements of the formations Caliper and a new computed tomography in the end of treatment to measure the largest tumor diameter and volume. A fragment of skin formations was collected before the initiation of treatment for histological grading, determination of mitotic index, KIT and VEGF staining patterns and the proliferation marker Ki67. Part of the collected material was extracted RNA and DNA and subsequent sequencing of 11 exons of the c-kit gene and determination and expression of its ligand by RT-PCR. The medication toxicity was evaluated according to the standards of VCOG 1.1.A response rate of the VP group was 7.7% and 28.6% MI group, although patients treated with imatinib had a higher chance of response therapy, no difference in response between the two groups was observed. The two protocols were well tolerated, patients in the MI group had a smaller number of side effects. The histological grade, mitotic index, staining patterns KIT, beyond the quantification of Ki-67 were homogeneous in both groups and did not influence the response to treatment. Quantification of VEGF was intensely in patients with partial and total remission. It was no relationship between KIT and quantification of the expression of c-kit gene, which was higher in patients who responded to treatment, but its association with response to therapy cant be determined. Exon11 activating mutations in the c-kit gene were not identified. Treatment with imatinib mesylate is well tolerated by the animals, however this was not superior to standard chemotherapy protocol for the treatment of mast cell tumors; this result may have been influenced by the number of animals included in the study. Mutations in other domains of the KIT receptor and action in ITK receptors as PDGF and VEGF may be related to response to this class of drugs in this study, despite the absence of activating mutations in exon 11 of c-kit gene.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia do mesilato de imatinibe, em comparação com a quimioterapia usual com vimblastina e prednisona, no tratamento do mastocitoma canino e descrever os efeitos colaterais apresentados pelas medicações. Bem como analisar a expressão do VEGF (fator de crescimento endotelial), a relação da expressão do gene c-kit por RT-PCR e marcação imunoistoquímica do KIT com a presença de mutações na justamembrana e a relação desta mutação com a resposta à terapia. Para tanto foram incluídos 29 animais com diagnóstico citológico de mastocitoma, estes animais foram submetidos a tomografia computadorizada para determinação das medidas das formações cutâneas e em seguida divididos em 2 grupos. O grupo 1 foi tratado com o protocolo quimioterápico de vimblastina e prednisona por 12 semanas e o grupo 2 com o mesilato de imatinibe na dose de 10 mg/Kg a cada 24 horas por 8 semanas. A avaliação da resposta ao tratamento foi realizada com mensurações periódicas das formações com paquímetro e nova tomografia ao final do tratamento para mensuração do maior diâmetro e volume tumoral. Um fragmento das formações cutâneas foi coletado antes do início do tratamento para graduação histológica da neoplasia, determinação do índice mitótico e imunomarcação para KIT, VEGF e Ki- 67. Parte do material coletado teve o DNA e RNA extraídos e posterior sequenciamento dos exons 11 do gene c-kit e determinação da expressão deste e do seu ligante por RT-PCR. A toxicidade a medicação foi avaliada segundo as normas do VCOG 1.1.A taxa de resposta do grupo VP foi de 7,7 % e no grupo MI de 28,6%, embora os pacientes tratados com mesilato de imatinibe tenham apresentado maior chance de resposta a terapia, não foi observado diferença entre os dois grupos. Os dois protocolos foram bem tolerados, os pacientes do grupo MI d menor número de efeitos colaterais. O grau histológico, Indice mitótico, padrão imunohistoquimico do KIT, além da quantificação do ki-67 foram homogêneos nos dois grupos e não influenciaram na resposta ao tratamento. A quantificação do VEGF foi mais intensa nos pacientes com remissão parcial e total. Não foi observado relação entre a quantificação do KIT e a expressão do gene c-kit, que foi maior nos pacientes que responderam ao tratamento, porém a associação desta com a resposta a terapia não pode ser determinada. Mutações ativantes no exon11 do gene c-kit não foram identificadas. O tratamento com o mesilato de imatinibe é bem tolerado pelos animais, no entanto este não se mostrou superior ao protocolo padrão de quimioterapia para o tratamento do mastocitoma; este resultado pode ter sido influenciado pelo número de animais incluídos no estudo. Mutações em outros domínios do receptor KIT e a ação do ITK em receptores como do PDGF e o VEGF podem estar relacionados a resposta a esta classe de fármacos observada neste estudo, a despeito da ausência de mutações ativantes no exon 11 do gene c-kit. / The objective of this study was to evaluate the efficacy of imatinib mesylate, compared with the usual chemotherapy with vinblastine and prednisone in the treatment of canine mast cell tumor and describe the side effects submitted by medications. Well as analyzing the expression of VEGF (vascular endothelial growth factor), the relationship between the expression of c-kit gene by RT-PCR and immunohistochemical staining of KIT with the presence of mutations in the juxtamembrane and the relationship of this mutation with response to therapy. For both 29 animals with cytological diagnosis of mast cell tumor were included, these animals underwent computed tomography to determine the measured skin formations and then divided into 2 groups. Group 1 was treated with the chemotherapeutic protocol vinblastine and prednisone for 12 weeks and the second group with the imatinib mesylate in a dose of 10 mg / kg every 24 hours for 8 weeks. The assessment of response to treatment was performed with periodic measurements of the formations Caliper and a new computed tomography in the end of treatment to measure the largest tumor diameter and volume. A fragment of skin formations was collected before the initiation of treatment for histological grading, determination of mitotic index, KIT and VEGF staining patterns and the proliferation marker Ki67. Part of the collected material was extracted RNA and DNA and subsequent sequencing of 11 exons of the c-kit gene and determination and expression of its ligand by RT-PCR. The medication toxicity was evaluated according to the standards of VCOG 1.1.A response rate of the VP group was 7.7% and 28.6% MI group, although patients treated with imatinib had a higher chance of response therapy, no difference in response between the two groups was observed. The two protocols were well tolerated, patients in the MI group had a smaller number of side effects. The histological grade, mitotic index, staining patterns KIT, beyond the quantification of Ki-67 were homogeneous in both groups and did not influence the response to treatment. Quantification of VEGF was intensely in patients with partial and total remission. It was no relationship between KIT and quantification of the expression of c-kit gene, which was higher in patients who responded to treatment, but its association with response to therapy cant be determined. Exon11 activating mutations in the c-kit gene were not identified. Treatment with imatinib mesylate is well tolerated by the animals, however this was not superior to standard chemotherapy protocol for the treatment of mast cell tumors; this result may have been influenced by the number of animals included in the study. Mutations in other domains of the KIT receptor and action in ITK receptors as PDGF and VEGF may be related to response to this class of drugs in this study, despite the absence of activating mutations in exon 11 of c-kit gene.