Orientador: Andrigo Barboza de Nardi / Resumo: Este estudo teve como objetivo analisar os casos de mastocitomas em 192 cães atendidos no Hospital Veterinário Governador Laudo Natel da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV)-UNESP-Câmpus Jaboticabal, no período de 2005 a 2015, além de analisar a ocorrência dessa neoplasia em relação à raça, idade e sexo; determinar quais as regiões corpóreas foram mais acometidas e as características neoplásicas observadas; avaliar quais são os métodos de diagnóstico mais utilizados no setor; estabelecer os principais graus histológicos diagnosticados, os tratamentos preconizados, avaliar a taxa de recidiva e metástase. Foram avaliados 192 pacientes e foi observado que setenta e seis animais apresentavam múltiplos nódulos (39,6%), e os nódulos acima de três centímetros perfaziam 39,1% das amostras (n=75). Sessenta e um casos de lesões metastáticas em linfonodos regionais – N1 (31,8%) foram encontrados e 71,9% dos nódulos identificados tiveram crescimento rápido, sendo 16,7% (n= 32) localizados em membro pélvico. Foi observada associação estatística entre a presença de nódulos solitários/múltiplos e o grau histológico segundo Kiupel et al. (2011) (p=0,004). Em relação à classificação de Patnaik et al. (1984), as variáveis raça e sexo diferem proporcionalmente entre os grupos histológicos (p=0,008 e 0,040 respectivamente), a presença de linfonodo comprometido por metástase e velocidade de crescimento rápido também tiveram associação com o grau histológico (p=0,002 e 0,001). Além... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

A galectina-1 (Gal-1) pertence à uma família de proteínas ligantes de ?-galactosídeos e participa de vários processos biológicos, tais como a modulação da resposta inflamatória. Os mastócitos desempenham um importante papel em eventos inflamatórios e alérgicos. Entretanto, o impacto da Gal-1 na biologia dos mastócitos é pouco conhecido. Neste trabalho, foram analisados os aspectos morfológicos e funcionais de células RBL-2H3 tratadas com Gal-1. Além disso, foi investigado o efeito da ausência de Gal-1 endógena sobre a desgranulação in vivo. A avaliação da interação de Gal-1Texas-Red com células RBL-2H3, por citometria de fluxo, indicou que esta lectina ligou-se às superfícies dessas células de modo dose-dependente. A Gal-1 foi capaz de promover a exposição de fosfatidilserina (FS, um marcador de apoptose) nas superfícies dessas células por meio de reconhecimento de carboidratos. Entretanto, as células RBL-2H3 tratadas com Gal-1 não apresentaram apoptose e/ou necrose, como indicado pelos resultados obtidos dos ensaios de TUNEL, DNA laddering, hipodiploidia, citotoxicidade e microscopia eletrônica de transmissão. As análises de microscopia eletrônica de varredura e Differential Interference Contrast (DIC) de células tratadas com Gal-1 (10 µM-1 hora) indicaram que essa lectina induziu ondulações apenas nas porções apicais das membranas plasmáticas de células RBL-2H3. Além disso, a Gal-1 modulou negativamente a formação de ondulações nas superfícies de células RBL-2H3 estimuladas via Fc?RI. A distribuição de componentes de Lipid Rafts relacionados ao processo de ativação celular via Fc?RI (Lyn, LAT e GD1b) foi modificada pelo tratamento dessas células com Gal-1 (10 µM), por 1 hora. As células RBL-2H3 tratadas com Gal-1(10µM-45 minutos) apresentaram níveis de liberação da enzima ?-hexosaminidase (?-HEX) semelhantes ao do controle negativo, sugerindo que essa lectina não promove a desgranulação de células RBL-2H3. Por outro lado, a Gal-1 inibiu a desgranulação de células RBL-2H3 ativadas via Fc?RI. O valor máximo de inibição (80%) da liberação de ?-HEX foi atingido quando as células foram tratadas com 10 µM de Gal-1 por 24 horas. Este efeito inibitório não foi detectado quando as células foram tratadas com Gal-1 na presença de ?-D-Tiogalactopiranosídeo (TDG), quando estimuladas com ionóforo de cálcio ou tratadas com a forma monomérica da Gal-1. Os dados de microscopia confocal mostraram que os grânulos secretórios de células submetidas ao procedimento de estimulação via Fc?RI, foram fracamente marcados com o anticorpo AD1 e apresentaram uma distribuição citoplasmática difusa. Entretanto, células tratadas com Gal-1 (10 µM - 24 horas) e estimuladas via Fc?RI foram intensamente marcadas com anticorpo AD1 e mostraram um padrão perinuclear, como detectado em células não estimuladas. De modo interessante, camundongos deficientes para o gene de Gal-1 quando submetidos ao ensaio de anafilaxia passiva cutânea (PCA) apresentaram uma reação significativamente maior que os animais selvagens. Com base no conjunto de resultados obtidos sugere-se que a Gal-1 pode participar da homeostase de mastóctios sem provocar apoptose e/ou necrose dessas células. Além disso, a Gal-1 pode modular o processo de exocitose de mastócitos por meio das propriedades lectínica e de dimerização dessa proteína e esse efeito modulatório parece estar associado a eventos de sinalização celular anteriores ao influxo de cálcio. / Galectin-1 (Gal-1) belongs to a family of ?-galactoside-binding proteins and is involved in several biological processes, including modulation of the inflammatory response. Mast cells play a critical role in allergic and inflammatory events, however, little is known about the impact of Gal-1 on mast cell biology. In this study, we examined the role of Gal-1 in mast cell function using RBL-2H3 (Rat Basophilic Leukemia) and galectin-1 deficient mice. We report that Gal-1 recognized glycoconjugates on mast cells and this interaction promotes phosphatidylserine (PS) exposure in the absence of cell death or apoptosis. Morphological analysis of Gal-1-treated RBL-2H3 cells, by scanning electron microscopy and Differential Interference Contrast (DIC), indicated that Gal-1 induces modifications on cell membranes and modulation of ruffles formation on cell surface of stimulated RBL-2H3 cells. Interesting, Gal-1 treatment of RBL-2H3 cells, with or without stimulation, promotes alterations in the distribution of the components (Lyn, LAT and GD1b) of Lipid Rafts. Gal-1 did not promote degranulation on RBL-2H3 with or without prior sensitization with IgE. However, Gal-1 treatment inhibits the cell degranulation mediated by via Fc?RI and this effect was time and dose-dependent. Also, this inhibition was related to carbohydrate recognition domain and required Gal-1 dimerization. Importantly, confocal microscopy analysis showed that Gal-1 was distributed in cytoplasm close to secretory granules stained AD-1 antibody on RBL-2H3 with or without prior stimulation with Fc?RI. In addition, we found significantly increased passive cutaneous anaphylaxis reaction in Gal-1 deficient mice. The results demonstrated that Gal-1 may participate of homeostasis and exocytose in mast cells suggesting that Gal-1 can have important role in allergic and inflammatory process.

A quimioterapia metronômica é uma modalidade terapêutica onde o agente quimioterápico é administrado em baixas doses, em curtos intervalos e continuamente, diferente da quimioterapia em dose máxima tolerada. Dirigida contra células tumorais e outros tipos de células, como as endoteliais e do sistema imunológico, a metronômica altera o microambiente tumoral e suprime características inatas que apoiam o crescimento dos tumores. O objetivo deste trabalho foi analisar prospectivamente o uso da quimioterapia metronômica com lomustina em pacientes com mastocitoma cutâneo, seus efeitos adversos e comparar com o protocolo de vimblastina e prednisona. Para tanto foram incluídos neste estudo 40 neoplasias obtidas de 32 cães de ambos os sexos e idades variadas, com o diagnóstico citológico e histopatológico de mastocitoma cutâneo, os mesmos foram divididos em dois grupos de forma randomizada. O grupo VP foi tratado com vimblastina na dose de 2mg/m² e prednisona por 12 sessões e o grupo LP foi tratado a metronômica com lomustina na dose de 2,84mg/m²/VO por 4 meses. Quanto à classificação histopatológica dos tumores estudados 67,5% (27/40) das formações mostrou graduação intermediária, correspondendo a grau II/baixo grau. Os efeitos adversos foram avaliados de acordo com os critérios do VCOG. Dos pacientes pertencentes ao grupo VP 62,5% (5/16) apresentaram algum tipo de efeito adverso, sendo os mais frequente os efeitos sob o trato gastrointestinal como: disorexia, anorexia, êmese e diarreia ocorrendo em cinco pacientes (5/16), seguido de leucopenia em três animais (3/16). No grupo LP 50% (8/16) dos pacientes tiveram algum tipo de efeito adverso, o mais comum foi êmese, sendo que apenas um cão apresentou efeito adverso classificado em grau III. Os dois protocolos foram bem tolerados pelos pacientes e não houve significância estatística sobre os efeitos adversos de ambos os grupos (p=0,715). A trombocitose foi a síndrome paraneoplásica mais observada, acometendo 25% de todos os animais (8/32), apresentando significância estatística em relação ao temo de sobrevida global (p=0,000049). A média de sobrevida do grupo VP foi de 404,25 dias (104-815dias) enquanto que do grupo LP foi de 320,25 dias (83-669). Não houve diferença estatística entre os grupos de acordo com o tempo de sobrevida (p=0,662) e o tempo livre de recorrência (p=1). A quimioterapia metronômica com lomustina teve boa aceitação junto aos proprietários dos animais, já que é administrada por via oral e os efeitos adversos foram toleráveis e pouco frequentes. / Metronomic chemotherapy is a therapeutic modality where the chemotherapeutic agent is administered in low doses, continuously for short and regular periods, as opposed to the chemotherapy in maximum tolerated dose. Directed against tumor cells and other cell types, such as endothelial cells and immune system cells, the metronomic chemotherapy alters the tumor microenvironment and suppresses innate features that support the growth of tumors. The aim of this study is to prospectively analyze the use of metronomic chemotherapy with lomustine in patients with mast cell tumors, evaluate the therapeutic action and adverse effects and compare with the chemotherapy protocol with vinblastine and prednisone. For this, 40 neoplasms obtained from 32 dogs of both sexes and varied ages, with cytological and histopathological diagnosis of mast cell tumor, were divided into two groups in a randomized fashion. The VP group was treated with vinblastine at a dose of 2mg/m² and prednisone for 12 sessions and the LP group was treated with metronomic chemotherapy with lomustine at a dose of 2.84mg/m²/ VO for 4 months. Regarding the histopathological classification of the studied tumors, 67.5% (27/40) of the formations showed an intermediate degree, corresponding to grade II / low grade. Adverse effects were assessed according to the VCOG criteria. Of the patients belonging to the VP group 62.5% (5/16) presented some type of adverse effect, being the most frequent the effects under the gastrointestinal tract as: dysorexia, anorexia, emesis and diarrhea occurring in five patients (5/16), Followed by leukopenia in three animals (3/16). In the LP group 50% (8/16) of the patients had some type of adverse effect, the most common was emesis, and only one dog presented grade III adverse effect. The two chemotherapeutic protocols were well tolerated by the patients and there was no statistical significance regarding the adverse effects of both groups (p = 0.715). Thrombocytosis was the most observed paraneoplastic syndrome, affecting 25% of all animals (8/32), presenting statistical significance in relation to the overall survival rate (p = 0.000049). The mean survival time of the PV group was 404.25 days (104-815 days) while the LP group was 320.25 days (83-669). There was no statistical difference between the groups according to the survival time (p = 0.662) and the free time of recurrence (p = 1). Metronomic chemotherapy with lomustine was well accepted by animal owners, since it is administered orally and the adverse effects were tolerable and infrequent.

Noventa e três mastocitomas cutâneos caninos, presentes em 74 animais, tiveram seus históricos clínicos investigados. Destes, 25 casos foram submetidos à análise morfométrica nuclear em lâminas de citopatologia nas colorações Panótico rápido e H&E; e 28 casos à graduação histopatológica e à imunoistoquímica para detecção das expressões de KIT, BAX, Ki-67 e PCNA, de modo a identificar os melhores indicadores prognósticos para a neoplasia. Os parâmetros citomorfométricos nucleares investigados foram: área, diâmetro-médio e perímetro. Os tumores foram classificados em graus histopatológicos I (bem diferenciados), II (de diferenciação intermediária) ou III (pobremente diferenciados), segundo a proposta de Patnaik, Ehler e MacEwen (1984). Os resultados obtidos através dos indicadores investigados foram comparados às graduações oferecidas pelo exame histopatológico, bem como aos tempos de sobrevida pós-cirúrgica e à mortalidade em função da doença. A citomorfometria obteve correlação com a mortalidade e o tempo de sobrevida dos animais em ambas as colorações testadas. Entre os marcadores imunoistoquímicos, as expressões de Ki-67 e BAX mostraram-se eficientes na previsão da sobrevida e mortalidade para o tumor, enquanto que as de KIT e PCNA não foram indicadores prognósticos para a neoplasia. Quanto maiores os parâmetros citomorfométricos e as porcentagens de núcleos positivos para Ki-67 e BAX, maiores as taxas de mortalidade e menores os períodos de sobrevida pós-cirúrgica. Finalmente, a graduação histopatológica foi o método que obteve os resultados mais expressivos na histopatologia, demonstrando ainda ser o método mais confiável deste painel. Nossos resultados apresentam um novo método de classificação para os mastocitomas cutâneos caninos, a partir da análise morfométrica aliada ao exame citopatológico, e confirmam que as avaliações imunoistoquímicas de Ki-67 e BAX, podem auxiliar na graduação dos mastocitomas, contribuindo com o estabelecimento de prognósticos e tratamentos mais precisos. / Ninety-three canine cutaneous mast cell tumors, of 74 dogs, had their clinical history investigated. Among these, 25 cases were submitted to nuclear morphometric analysis on cytopathology slides stained by panoptic method and hematoxylin & eosin; and 28 cases were submitted to histopathologic grading and immunohistochemistry to evaluate KIT, BAX, Ki-67 e PCNA expressions, in order to identify the best prognostic indicators for this neoplasm. The nuclear cytomorphometric parameters used in the present study were: area, average-diameter and perimeter. The tumors were histologically classified as grades I (well differentiated), II (of intermediate differentiation) or III (poorly differentiated), as proposed by Patnaik, Ehler and MacEwen (1984). The results obtained by the indicators investigated were compared to the histopathologic grading, as well as to post-surgical survival times and mortality due to mast cell disease. Cytomorphometry was correlated with mortality and survival times in both staining methods. Among the immunohistochemical markers, Ki-67 and BAX expressions were efficient in predicting survival times and mortality due to mast cell tumors. KIT and PCNA expressions were not prognostic indicators for this tumor. The increases observed in the cytomorphometric parameters, and Ki-67 and BAX positive nuclei percentages were correlated with higher mortality rates and reduced post-surgical survival times. Finally, using the histopathologic grading system, we obtained the best results on histopathology, being this the most trustworhty method of this diagnostic panel. Our results presents a new grading system for canine cutaneous mast cell tumors, based on morphometric analysis on cytopathology slides, and confirm that immunohistochemical evaluation of Ki-67 and BAX expression may contribute to mast cell grading, leading to more accurate prognosis and treatment.

Noventa e três mastocitomas cutâneos caninos, presentes em 74 animais, tiveram seus históricos clínicos investigados. Destes, 25 casos foram submetidos à análise morfométrica nuclear em lâminas de citopatologia nas colorações Panótico rápido e H&E; e 28 casos à graduação histopatológica e à imunoistoquímica para detecção das expressões de KIT, BAX, Ki-67 e PCNA, de modo a identificar os melhores indicadores prognósticos para a neoplasia. Os parâmetros citomorfométricos nucleares investigados foram: área, diâmetro-médio e perímetro. Os tumores foram classificados em graus histopatológicos I (bem diferenciados), II (de diferenciação intermediária) ou III (pobremente diferenciados), segundo a proposta de Patnaik, Ehler e MacEwen (1984). Os resultados obtidos através dos indicadores investigados foram comparados às graduações oferecidas pelo exame histopatológico, bem como aos tempos de sobrevida pós-cirúrgica e à mortalidade em função da doença. A citomorfometria obteve correlação com a mortalidade e o tempo de sobrevida dos animais em ambas as colorações testadas. Entre os marcadores imunoistoquímicos, as expressões de Ki-67 e BAX mostraram-se eficientes na previsão da sobrevida e mortalidade para o tumor, enquanto que as de KIT e PCNA não foram indicadores prognósticos para a neoplasia. Quanto maiores os parâmetros citomorfométricos e as porcentagens de núcleos positivos para Ki-67 e BAX, maiores as taxas de mortalidade e menores os períodos de sobrevida pós-cirúrgica. Finalmente, a graduação histopatológica foi o método que obteve os resultados mais expressivos na histopatologia, demonstrando ainda ser o método mais confiável deste painel. Nossos resultados apresentam um novo método de classificação para os mastocitomas cutâneos caninos, a partir da análise morfométrica aliada ao exame citopatológico, e confirmam que as avaliações imunoistoquímicas de Ki-67 e BAX, podem auxiliar na graduação dos mastocitomas, contribuindo com o estabelecimento de prognósticos e tratamentos mais precisos. / Ninety-three canine cutaneous mast cell tumors, of 74 dogs, had their clinical history investigated. Among these, 25 cases were submitted to nuclear morphometric analysis on cytopathology slides stained by panoptic method and hematoxylin & eosin; and 28 cases were submitted to histopathologic grading and immunohistochemistry to evaluate KIT, BAX, Ki-67 e PCNA expressions, in order to identify the best prognostic indicators for this neoplasm. The nuclear cytomorphometric parameters used in the present study were: area, average-diameter and perimeter. The tumors were histologically classified as grades I (well differentiated), II (of intermediate differentiation) or III (poorly differentiated), as proposed by Patnaik, Ehler and MacEwen (1984). The results obtained by the indicators investigated were compared to the histopathologic grading, as well as to post-surgical survival times and mortality due to mast cell disease. Cytomorphometry was correlated with mortality and survival times in both staining methods. Among the immunohistochemical markers, Ki-67 and BAX expressions were efficient in predicting survival times and mortality due to mast cell tumors. KIT and PCNA expressions were not prognostic indicators for this tumor. The increases observed in the cytomorphometric parameters, and Ki-67 and BAX positive nuclei percentages were correlated with higher mortality rates and reduced post-surgical survival times. Finally, using the histopathologic grading system, we obtained the best results on histopathology, being this the most trustworhty method of this diagnostic panel. Our results presents a new grading system for canine cutaneous mast cell tumors, based on morphometric analysis on cytopathology slides, and confirm that immunohistochemical evaluation of Ki-67 and BAX expression may contribute to mast cell grading, leading to more accurate prognosis and treatment.

Nós humanos estamos inevitavelmente expostos a uma mistura de poluentes, e evidências nos mostram que estes poluentes aumentam a incidência de desordens reprodutivas. Já se sabe que camundongos cronicamente expostos a níveis de poluentes ambientais em São Paulo apresentam: mudanças no ciclo estral, alteração no número de folículos ovarianos, aumento das perdas embrionárias pós implantacionais e alterações na morfologia placentária. Nós hipotetizamos que as alterações na resposta uterina a implantação possa ser mediado por mastócitos e células NK uterinas levando ao aumento na incidência de perdas pós implntacionais associadas a poluição do ar. Para testar essa hipótese, camundongos foram expostos a níveis ambientais de poluentes até os 60 dias de vidas usando câmaras de exposição [uma câmara recebendo ar filtrado e a outra ar ambiente (poluído) não]. Ao atingir a idade reprodutiva os animais foram colocados para acasalar, os machos utilizados neste estudo não foram expostos aos poluentes, e no 6° e 8° dia pós-coito a gestação foi terminada. O desempenho reprodutivo foi avaliado e as fêmeas foram subdivididas em 4 grupos de acordo com a idade gestacional (6º ou 8º dpc) e exposição (ar filtrado ou ar não filtrado). Métodos estereológicos foram usados para avaliar o desenvolvimento dos sítios de implantação, contagem das células NK uterinas e mastócitos. A concentração de média de PM2.5 nas câmaras com o ar não filtrado foi de 27.5 g.m-3 e 6.5 g.m-3 na câmara com ar filtrado (P<0.001). A exposição a poluição do ar nos primeiros dias de gestação mostrou há diferenças no desenvolvimento dos compartimentos do sítio de implantação no 8° dia pós-coito: redução do volume endométrio e volume total do sítio.Quando nós avaliamos o número total de NK uterina o 8° dia pós-coito, observamos que há uma redução no número destas células nos animais expostos a poluição do ar. Os mastócitos no 6° dia gestacional também se mostram em menor número nos animais expostos a poluição, mas essa diferença desaparece com o avanço da gestação. Na avaliação histopatológica do endométrio, verificamos que há uma redução do volume de células deciduais, de trofoblasto, e um aumento do volume de glândulas nos sítios implantacionais no 8° dia pós-coito de animais expostos ao ar poluído. Nossos resultados confirmam os achados de estudos prévios que correlacionam a exposição a poluição do ar com aumento na incidência de falhas implantacionais e fertilidade diminuída. A avaliação da morfologia uterina e do número de células NK uterinas e mastócitos sugerem que os compostos presentes no ar interferem ou prejudicam o processo de implantação embrionária por alterações na resposta do sistema imunológico materno / Humans are inevitably exposed to mixtures of environmental contaminants, and a vast body of evidence now links exposure to these chemicals with an increased incidence of reproductive disorders. We have shown that mice chronically exposed to ambient levels of air pollution (AP) in São Paulo city have negative reproductive performance: resulting in changes in estrous cyclicity, number of follicles and increased post implantation loss rate as well defective placentation. We hypothesized that alterations in uterine response to implantation could be mediated by mast and uNKcells leading to increased incidence of pos implantation losses associated with exposure to air pollution. To test this female mice were exposed to ambient levels of AP from birth to 60 days of age using exposure chambers (receiving filtered air or non filtered situated near to a high traffic crossroad). On reaching the reproductive age, estrous cyclicity, was evaluated and females were allowed to mate to non exposed males and exposures continued until 6ºdpc or 8ºdpc when pregnancy was terminated. Reproductive performance was assessed and females, subdivided in to 4 groups according to gestational day (6ºdpc or 8ºdpc ) and exposure (filtered or non filtered air). Stereological methods and immunohistochemical techniques were used to evaluate implantation sites (IS) development, do cell identification (NK cells and Mast cells) and counts. Mean concentration of PM2.5 in the non-filtered chamber was 27.5 g.m-3 and 6.5 g.m-3; in the filtered chambers (P<0.001). Females exposed to air pollution previously and during the first days of pregnancy showed borderline differences in the development of the compartments of the IS on day 8 of gestation: volume of the endometrium is reduced as well as the IS total volume. When we evaluated the total number of uNk cells (8ºdpc), we observed that there is a decrease in those animals exposed to air pollution The number of mast cells (6º dpc) are also reduced when compared to females exposed to filtered air, but as pregnancy progress this differences in the number of mast cells disappear. The histopathological evaluation was observe the decrease in the volume occupied by decidual and trophoblast cells, and increased the volume of glands, showing development delay in implantation sites in 8dpc.Our data confirm results from previous studies that link exposure to AP and decreased fertility and increased implantation failure. Evaluation of the uterine morphology and the number of mast call and uNkcell suggests that components present in AP interfere or impair embryonic implantation trought changes in maternal immune system responses

Nós humanos estamos inevitavelmente expostos a uma mistura de poluentes, e evidências nos mostram que estes poluentes aumentam a incidência de desordens reprodutivas. Já se sabe que camundongos cronicamente expostos a níveis de poluentes ambientais em São Paulo apresentam: mudanças no ciclo estral, alteração no número de folículos ovarianos, aumento das perdas embrionárias pós implantacionais e alterações na morfologia placentária. Nós hipotetizamos que as alterações na resposta uterina a implantação possa ser mediado por mastócitos e células NK uterinas levando ao aumento na incidência de perdas pós implntacionais associadas a poluição do ar. Para testar essa hipótese, camundongos foram expostos a níveis ambientais de poluentes até os 60 dias de vidas usando câmaras de exposição [uma câmara recebendo ar filtrado e a outra ar ambiente (poluído) não]. Ao atingir a idade reprodutiva os animais foram colocados para acasalar, os machos utilizados neste estudo não foram expostos aos poluentes, e no 6° e 8° dia pós-coito a gestação foi terminada. O desempenho reprodutivo foi avaliado e as fêmeas foram subdivididas em 4 grupos de acordo com a idade gestacional (6º ou 8º dpc) e exposição (ar filtrado ou ar não filtrado). Métodos estereológicos foram usados para avaliar o desenvolvimento dos sítios de implantação, contagem das células NK uterinas e mastócitos. A concentração de média de PM2.5 nas câmaras com o ar não filtrado foi de 27.5 g.m-3 e 6.5 g.m-3 na câmara com ar filtrado (P<0.001). A exposição a poluição do ar nos primeiros dias de gestação mostrou há diferenças no desenvolvimento dos compartimentos do sítio de implantação no 8° dia pós-coito: redução do volume endométrio e volume total do sítio.Quando nós avaliamos o número total de NK uterina o 8° dia pós-coito, observamos que há uma redução no número destas células nos animais expostos a poluição do ar. Os mastócitos no 6° dia gestacional também se mostram em menor número nos animais expostos a poluição, mas essa diferença desaparece com o avanço da gestação. Na avaliação histopatológica do endométrio, verificamos que há uma redução do volume de células deciduais, de trofoblasto, e um aumento do volume de glândulas nos sítios implantacionais no 8° dia pós-coito de animais expostos ao ar poluído. Nossos resultados confirmam os achados de estudos prévios que correlacionam a exposição a poluição do ar com aumento na incidência de falhas implantacionais e fertilidade diminuída. A avaliação da morfologia uterina e do número de células NK uterinas e mastócitos sugerem que os compostos presentes no ar interferem ou prejudicam o processo de implantação embrionária por alterações na resposta do sistema imunológico materno / Humans are inevitably exposed to mixtures of environmental contaminants, and a vast body of evidence now links exposure to these chemicals with an increased incidence of reproductive disorders. We have shown that mice chronically exposed to ambient levels of air pollution (AP) in São Paulo city have negative reproductive performance: resulting in changes in estrous cyclicity, number of follicles and increased post implantation loss rate as well defective placentation. We hypothesized that alterations in uterine response to implantation could be mediated by mast and uNKcells leading to increased incidence of pos implantation losses associated with exposure to air pollution. To test this female mice were exposed to ambient levels of AP from birth to 60 days of age using exposure chambers (receiving filtered air or non filtered situated near to a high traffic crossroad). On reaching the reproductive age, estrous cyclicity, was evaluated and females were allowed to mate to non exposed males and exposures continued until 6ºdpc or 8ºdpc when pregnancy was terminated. Reproductive performance was assessed and females, subdivided in to 4 groups according to gestational day (6ºdpc or 8ºdpc ) and exposure (filtered or non filtered air). Stereological methods and immunohistochemical techniques were used to evaluate implantation sites (IS) development, do cell identification (NK cells and Mast cells) and counts. Mean concentration of PM2.5 in the non-filtered chamber was 27.5 g.m-3 and 6.5 g.m-3; in the filtered chambers (P<0.001). Females exposed to air pollution previously and during the first days of pregnancy showed borderline differences in the development of the compartments of the IS on day 8 of gestation: volume of the endometrium is reduced as well as the IS total volume. When we evaluated the total number of uNk cells (8ºdpc), we observed that there is a decrease in those animals exposed to air pollution The number of mast cells (6º dpc) are also reduced when compared to females exposed to filtered air, but as pregnancy progress this differences in the number of mast cells disappear. The histopathological evaluation was observe the decrease in the volume occupied by decidual and trophoblast cells, and increased the volume of glands, showing development delay in implantation sites in 8dpc.Our data confirm results from previous studies that link exposure to AP and decreased fertility and increased implantation failure. Evaluation of the uterine morphology and the number of mast call and uNkcell suggests that components present in AP interfere or impair embryonic implantation trought changes in maternal immune system responses

Submitted by Cristhiane Guerra (cristhiane.guerra@gmail.com) on 2017-02-03T15:23:14Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 940006 bytes, checksum: 7a3088e68d7479fcd18f7a8da0705ccc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-03T15:23:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 940006 bytes, checksum: 7a3088e68d7479fcd18f7a8da0705ccc (MD5) Previous issue date: 2016-02-15 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae) is a native plant of Paraiba region which is used in folk medicine to treat various inflammatory conditions such as asthma and rhinitis. This plant has several biologically active metabolites such as warifteine, methyl warifteine, milonine, among others. Preliminary data show that warifteine exhibits anti-inflammatory activity in a murine model of asthma. The aim of this study was to evaluate whether milonina, metabolite of Cissampelos sympodialis has acute anti-inflammatory activity. For this purpose, we used the model of paw edema induced by phlogistic agents, histological analysis, anaphylactic shock reaction, scratching behavior and antinociceptive activity tests such as writhing and hot plate. The pretreatment of animals with milonina was able to inhibit significantly (p <0.05) paw edema induced by carrageenan in the period between one and two hours while the challenge with compound 48/80, the milonia was capable of inhibiting (p <0.05) the edema at two times 30 and 60 min. The milonina at 2mg / kg was able to protect 75% of animals from death induced by compound 48/80 in anaphylactic shock test. The morphological analysis of the skin of animals subjected to the itch behavior induced by compound 48/80 showed preservation of epithelial structures. In addition, milonina was able to decrease significantly (p <0.05), nociception induced by acetic acid and hot plate a pattern of the inhibition of inflammatory pain. Thus, these data suggest that milonina has acute anti-inflammatory activity via inhibition of mast cell action. / A planta Cissampelos sympodialis EICHL. (Menispermaceae) é uma planta nativa da região paraibana a qual é utilizada na medicina popular para tratamento de diversas afecções inflamatórias, como asma e rinite. Essa planta apresenta vários metabólitos biologicamente ativos como a warifteína, metil-warifteína, milonina, entre outros. Dados preliminares mostram que metabólitos como wariftéina apresenta atividade anti-inflamatória em modelo murino de asma. O objetivo desse trabalho foi avaliar se a milonina, metabólito de Cissampelos sympodialis apresenta atividade anti-inflamatória aguda. Para isso, utilizou-se modelos animais de edema de pata induzido por agentes flogísticos, análise histológica, choque anafilático, scratching behaviour e testes de atividade antinociceptiva, tais como, contorções abdominais e da placa quente. O pré tratamento dos animais com milonina foi capaz de inibir de forma significativa (p<0,05) o edema de pata induzido por carragenina no período entre uma e duas horas enquanto que, no desafio com o composto 48/80, a milonia foi capaz de inibir (p<0,05) o edema nos dois tempos avaliados isto é 30 e 60 min. A milonina a 2mg/kg foi capaz de proteger em 75% os animais da morte induzida pelo composto 48/80 no teste de choque anafilático. Na análise morfológica da pele dos animais submetidos ao comportamento de coceira induzido pelo composto 48/80 observou-se a preservação das estruturas epiteliais. Em adição, a milonina foi capaz de diminuir de forma significativa (p<0,05), a nocicepção induzida por ácido acético e placa quente um padrão de inibição de dor inflamatória. Diante disso esses dados sugerem que a milonina apresenta atividade anti-inflamatória aguda via inibição da ação de mastócitos.

A galectina-1 (Gal-1) pertence à uma família de proteínas ligantes de ?-galactosídeos e participa de vários processos biológicos, tais como a modulação da resposta inflamatória. Os mastócitos desempenham um importante papel em eventos inflamatórios e alérgicos. Entretanto, o impacto da Gal-1 na biologia dos mastócitos é pouco conhecido. Neste trabalho, foram analisados os aspectos morfológicos e funcionais de células RBL-2H3 tratadas com Gal-1. Além disso, foi investigado o efeito da ausência de Gal-1 endógena sobre a desgranulação in vivo. A avaliação da interação de Gal-1Texas-Red com células RBL-2H3, por citometria de fluxo, indicou que esta lectina ligou-se às superfícies dessas células de modo dose-dependente. A Gal-1 foi capaz de promover a exposição de fosfatidilserina (FS, um marcador de apoptose) nas superfícies dessas células por meio de reconhecimento de carboidratos. Entretanto, as células RBL-2H3 tratadas com Gal-1 não apresentaram apoptose e/ou necrose, como indicado pelos resultados obtidos dos ensaios de TUNEL, DNA laddering, hipodiploidia, citotoxicidade e microscopia eletrônica de transmissão. As análises de microscopia eletrônica de varredura e Differential Interference Contrast (DIC) de células tratadas com Gal-1 (10 µM-1 hora) indicaram que essa lectina induziu ondulações apenas nas porções apicais das membranas plasmáticas de células RBL-2H3. Além disso, a Gal-1 modulou negativamente a formação de ondulações nas superfícies de células RBL-2H3 estimuladas via Fc?RI. A distribuição de componentes de Lipid Rafts relacionados ao processo de ativação celular via Fc?RI (Lyn, LAT e GD1b) foi modificada pelo tratamento dessas células com Gal-1 (10 µM), por 1 hora. As células RBL-2H3 tratadas com Gal-1(10µM-45 minutos) apresentaram níveis de liberação da enzima ?-hexosaminidase (?-HEX) semelhantes ao do controle negativo, sugerindo que essa lectina não promove a desgranulação de células RBL-2H3. Por outro lado, a Gal-1 inibiu a desgranulação de células RBL-2H3 ativadas via Fc?RI. O valor máximo de inibição (80%) da liberação de ?-HEX foi atingido quando as células foram tratadas com 10 µM de Gal-1 por 24 horas. Este efeito inibitório não foi detectado quando as células foram tratadas com Gal-1 na presença de ?-D-Tiogalactopiranosídeo (TDG), quando estimuladas com ionóforo de cálcio ou tratadas com a forma monomérica da Gal-1. Os dados de microscopia confocal mostraram que os grânulos secretórios de células submetidas ao procedimento de estimulação via Fc?RI, foram fracamente marcados com o anticorpo AD1 e apresentaram uma distribuição citoplasmática difusa. Entretanto, células tratadas com Gal-1 (10 µM - 24 horas) e estimuladas via Fc?RI foram intensamente marcadas com anticorpo AD1 e mostraram um padrão perinuclear, como detectado em células não estimuladas. De modo interessante, camundongos deficientes para o gene de Gal-1 quando submetidos ao ensaio de anafilaxia passiva cutânea (PCA) apresentaram uma reação significativamente maior que os animais selvagens. Com base no conjunto de resultados obtidos sugere-se que a Gal-1 pode participar da homeostase de mastóctios sem provocar apoptose e/ou necrose dessas células. Além disso, a Gal-1 pode modular o processo de exocitose de mastócitos por meio das propriedades lectínica e de dimerização dessa proteína e esse efeito modulatório parece estar associado a eventos de sinalização celular anteriores ao influxo de cálcio. / Galectin-1 (Gal-1) belongs to a family of ?-galactoside-binding proteins and is involved in several biological processes, including modulation of the inflammatory response. Mast cells play a critical role in allergic and inflammatory events, however, little is known about the impact of Gal-1 on mast cell biology. In this study, we examined the role of Gal-1 in mast cell function using RBL-2H3 (Rat Basophilic Leukemia) and galectin-1 deficient mice. We report that Gal-1 recognized glycoconjugates on mast cells and this interaction promotes phosphatidylserine (PS) exposure in the absence of cell death or apoptosis. Morphological analysis of Gal-1-treated RBL-2H3 cells, by scanning electron microscopy and Differential Interference Contrast (DIC), indicated that Gal-1 induces modifications on cell membranes and modulation of ruffles formation on cell surface of stimulated RBL-2H3 cells. Interesting, Gal-1 treatment of RBL-2H3 cells, with or without stimulation, promotes alterations in the distribution of the components (Lyn, LAT and GD1b) of Lipid Rafts. Gal-1 did not promote degranulation on RBL-2H3 with or without prior sensitization with IgE. However, Gal-1 treatment inhibits the cell degranulation mediated by via Fc?RI and this effect was time and dose-dependent. Also, this inhibition was related to carbohydrate recognition domain and required Gal-1 dimerization. Importantly, confocal microscopy analysis showed that Gal-1 was distributed in cytoplasm close to secretory granules stained AD-1 antibody on RBL-2H3 with or without prior stimulation with Fc?RI. In addition, we found significantly increased passive cutaneous anaphylaxis reaction in Gal-1 deficient mice. The results demonstrated that Gal-1 may participate of homeostasis and exocytose in mast cells suggesting that Gal-1 can have important role in allergic and inflammatory process.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Gout is characterized by the deposition of monosodium urate (MSU) crystals. Despite being one of the most painful forms of arthritis, gout and the mechanisms responsible for its acute attacks are poorly understood. In the present study, we found that MSU caused dose-related nociception (DE50=0.04 (0.01-0.11) mg/paw) and edema (DE50=0.08 (0.04-0.16) mg/paw) when injected into the hind paw of rats. Treatment with the selective TRPV1 receptor antagonist SB366791 largely inhibited nociceptive and edematogenic responses to MSU. Moreover, the desensitization of capsaicin-sensitive afferent fibers as well as the pretreatment with the tachykinin NK1 receptor antagonist RP 67580 also significantly reduced MSU-induced nociception and edema. Once MSU was found to induce mast cell stimulation, we investigated the participation of these cells on MSU effects. Prior degranulation of mast cells by repeat treatment with compound 48/80 decreased MSU-induced nociception and edema or histamine and serotonin levels in the injected tissue. Moreover, pretreatment with the mast cell membrane stabilizer cromolyn effectively inhibited nociceptive and edematogenic responses to MSU. MSU induced a release of histamine, serotonin and tryptase in the injected tissue, confirming mast cell degranulation Furthermore, the antagonism of histaminergic H1 and serotoninergic receptors decreased the edema, but not the nociception, of MSU. Finally, the inhibition of tryptase activity was capable of largely reducing either MSU-induced nociception or edema. Collectively, the present findings demonstrate that MSU produces a nociceptive and edematogenic response mediated by TRPV1 receptor activation and mast cell degranulation. / A gota é caracterizada pela deposição de cristais de urato monossódico (MSU) nas articulações. Apesar de ser um dos mais dolorosos tipos de artrite, os mecanismos responsáveis pela indução da dor durante os ataques agudos de gota são pouco entendidos. No presente estudo, objetivamos investigar o papel do receptor TRPV1 na nocicepção e edema induzidos por cristais de MSU em ratos. Assim, demonstramos que o MSU causa nocicepção (DE50=0.04 (0.01-0.11) mg/pata) e edema dependentes da dose (DE50=0.08 (0.04-0.16) mg/pata) quando injetado na pata dos ratos. O tratamento com o antagonista seletivo do receptor vanilóide TRPV1 SB 366791 inibiu significativamente as respostas nociceptiva e edematogênica causadas pelo MSU. De maneira semelhante, a dessensibilização de fibras aferentes sensíveis a capsaicina bem como o tratamento com o antagonista do receptor para taquicinina NK1 RP67580 também reduziram significativamente a nocicepção e o edema induzidos pelo MSU. Sabendo que estudos prévios demonstraram que MSU induz a estimulação de mastócitos, nós investigamos a participação destas células nos efeitos do MSU. A desgranulação prévia de mastócitos por tratamento repetido com o composto 48/80 reduziu a nocicepção e o edema induzidos pelo MSU assim como os níveis de histamina e serotonina no tecido injetado. Adicionalmente, o tratamento com o estabilizador de membrana de mastócitos cromolina, reduziu efetivamente as respostas nociceptivas e edematogênicas ao MSU. A administração de MSU induziu a liberação de histamina, serotonina e triptase no tecido injetado, confirmando a desgranulação mastocitária. Além disso, o antagonismo de receptores histaminérgicos H1 e serotoninérgicos, reduziram o edema, mas não a nocicepção causados pelo MSU. Finalmente, a inibição da atividade da triptase foi capaz de reduzir amplamente a nocicepção e o edema induzidos pelo MSU. Coletivamente, nossos resultados demonstram que o MSU produz uma resposta nociceptiva e edematogênica mediada pela ativação do receptor TRPV1 e pela desgranulação de mastócitos.