O presente estudo avaliou o papel do receptor AT1 de Angiotensina II no desenvolvimento da hipertrofia dos cardiomiócitos promovida pelo T3, bem como a participação dos mecanismos intracelulares deflagrados pelo receptor AT1 neste modelo de hipertrofia cardíaca. O silenciamento do receptor AT1 com RNA de interferência preveniu totalmente o desenvolvimento da hipertrofia dos cardiomiócitos induzida pelo T3. Os cardiomiócitos tratados com T3 demonstraram uma rápida ativação da via da Akt/GSK-3/mTOR, a qual foi atenuada ou prevenida pelo silenciamento do receptor AT1. Ainda, a expressão de Angiotensina I/II no lisado celular e a expressão do receptor AT1 foram rapidamente aumentados pelo T3. Esses dados demonstram pela primeira vez que o receptor AT1 é um mediador crítico da hipertrofia dos cardiomiócitos induzida pelo T3, bem como para a ativação da via da Akt, sugerindo que a via Ang I/II-AT1-Akt/GSK-3/mTOR corresponde a um potencial mediador dos efeitos tróficos exercidos pelo T3 nessas células. / The present study investigated the role of Angiotensin type 1 receptor (AT1R) in T3-induced cardiomyocyte hypertrophy, as well as the participation of the intracellular mechanisms mediated by AT1R in this cardiac hypertrophy model. The AT1R silencing using small interfering RNA totally prevented the development of T3-induced cardiomyocyte hypertrophy. The cardiomyocytes treated with T3 demonstrated a rapid activation of Akt/GSK-3/mTOR signaling pathway, which was attenuated or prevented by the AT1R silencing. In addition, local Angiotensin I/II (Ang I/II) levels and the AT1R expression were rapidly increased by T3 treatment. These data demonstrate for the first time that the AT1R is a critical mediator to the T3-induced cardiomyocyte hypertrophy, as well as to the activation of the Akt signaling, suggesting that the Ang I/II-AT1R-Akt/GSK-3/mTOR pathway corresponds to a potential mediator of the trophic effect exerted by T3 in cardiomyocytes.

Quinze dias após a lesão por cateter balão, observou-se que o efeito máximo da Ang II na artéria contralateral à lesão está aumentado em relação aos valores obtidos em artérias de animais intactos. Esse aumento do Emax da Ang II não é modificado na ausência do endotélio. A lesão por cateter balão não acarreta alterações morfológicas e morfométricas da artéria contralateral à lesão quando comparadas àquelas observadas na artéria de animais controle. A desenervação simpática com 6-hidrodopamina e a desnervação sensorial com capsaicina revertem o aumento do Emax da Ang II na artéria contralateral à lesão por cateter balão. As curvas concentração-efeito para o angiotensinogênio e para Ang I apresentam o mesmo perfil na artéria contralateral à lesão por cateter balão e na artéria de animais controle. Na presença do endotélio, o losartan (antagonista do receptor AT1) e PD 123,319 (antagonista do receptor AT2) antagonizaram de forma não-superável os efeitos contráteis da Ang II em artérias de animais controle e contralateral à lesão. Observou-se, ainda, que o efeito vasorelaxante de altas concentrações de Ang II é revertido para efeitos vasoconstrictores na presença dos antagonistas seletivos dos receptores AT1, Mas e B2, tanto em artérias de animais controle quanto em artérias contralaterais à lesão. Entretanto, o Emax da Ang II nessas condições é maior na artéria contralateral à lesão. Em artéria contralateral à lesão observou-se aumento na expressão dos receptores AT2 e Mas, enquanto receptores AT1 apresenta o mesmo perfil de expressão daquele observado em artéria de animais controle. A Ang (1-7) induz relaxamento em artérias com e sem endotélio. O parâmetro de Emax da Ang (1-7) está significativamente aumentado na artéria contralateral na presença e ausência de endotélio. O Emax da Ang II, em artérias controle com endotélio, na presença de inibidores da enzima NOS, está aumentada, enquanto que na artéria contralateral este parâmetro não sofre alteração. A produção dos metabólitos do óxido nítrico (nitrito e nitrato) está reduzida na artéria contralateral à lesão quando comparado ao observado em artérias de animais controle, bem como a expressão de todas as isoformas da NOS. A lesão por cateter balão promove aumento na formação de EROs na artéria contralateral à lesão, que desaparece na presença de tiron (seqüestrador de EROs). A lesão também induz aumento na expressão da enzima p22phox, subunidade do sistema NADPH oxidase. O Emax da Ang II em artéria contralateral à lesão na presença de Tiron é semelhante ao observado em artérias de animais controle na ausência do seqüestrador. Em conclusão, a lesão por cateter balão promove respostas neurocompensatórias e aumento do estresse oxidativo em artéria contralateral à lesão. Estas alterações podem influenciar a expressão do receptor AT2 e Mas, e também mecanismos intracelulares desencadeados pela ativação de receptores AT1 e Mas. / Fifteen days after balloon catheter injury Emax of Ang II was increased in the contralateral artery as compared to values obtained in arteries from intact animals. This increase in Ang II Emax was not modified in the absence of the endothelium. The morphological and morphometric characteristics in the contralateral artery were not altered as compared to control animals. The sympathetic desnervation and sensory desnervation abolished the increase Emax of Ang II in the contralateral artery. The concentration-effect curves to angiotensinogen and Ang I were similar in contralateral arteries and in control arteries. In the presence of endothelium, losartan (AT1 antagonist receptor) and PD 123,319 (AT2 antagonist receptor) showed noncompetitive antagonistic characteristics in control arteries and contralateral artery. It was also observed that vasorelaxant effect of high concentrations of Ang II was reversed to vasoconstrictors effects in the presence of selective antagonists of AT1 receptors, Mas receptors and B2 receptors in the control arteries and contraalteral arteries. However, Emax of Ang II in these conditions was greater in contralateral artery. Contralateral artery showed increased expression of AT2 and Mas receptors, while AT1 have the same expression when compared to control arteries. Ang (1-7) triggered concentration response curves in arteries with and without endothelium. However, was observed Emax Ang (1-7) values was significantly increased in the contralateral artery in presence or absence of endothelium. Emax of Ang II in control arteries with endothelium in the presence of NOS isoforms inhibitors was increased, whereas the contralateral artery this parameter was the same. Nitrite and nitrate production was reduced in the contralateral artery when compared to control artery. NOS isoforms expression were reduced in contralateral artery. Balloon catheter injury increased ROS formation in contralateral artery, which abolished in the presence of tiron (ROS scavenger). The injury also induced increased p22phox enzyme expression, subunit of the NADPH oxidase system. Ang II Emax in the contralateral artery in the presence of tiron was similar as obtained in control arteries without tiron. In conclusion, the balloon catheter injury promoted neurocompensatory responses and increased oxidative stress in the contralateral artery. These changes increased AT2 and Mas receptor expression and also intracellular mechanisms triggered by activation of AT1 receptors.

O sistema renina-angiotensina (SRA) circulante é um sistema endócrino que promove a produção de angiotensina (Ang) II, a qual exerce seus efeitos pela interação com receptores específicos. O conceito clássico do SRA circulante está sendo modificado, pois tem sido demonstrada a existência de sistemas locais capazes de gerar angiotensinas de forma independente do SRA circulante em vários tecidos e órgãos. Trabalhos recentes sugerem a existência de alguns componentes do SRA em tecido gengival e fibroblastos gengivais de diferentes espécies. Porém, não são encontrados na literatura achados inequívocos sobre a presença de importantes componentes do SRA, tais como renina e angiotensinogênio, no tecido gengival de rato. Portanto, os objetivos do presente trabalho foram: 1) estudar a expressão e localização de componentes do SRA no tecido gengival de rato e 2) estudar in vitro a funcionalidade do SRA local em homogenato de tecido gengival de rato quanto à formação de Ang II e outros peptídeos vasoativos a partir de precursores de Ang II. Transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RTPCR) foi utilizada para avaliar a expressão de RNAm. Análise imunohistoquímica foi utilizada para detecção e localização de renina no tecido gengival de rato. Um método fluorimétrico padronizado com o tripeptídeo Hipuril-Histidina-Leucina (Hip-His-Leu) foi usado para medir a atividade da ECA em homogenatos de tecido gengival de rato. A técnica de cromatografia líqüida de alto desempenho (HPLC) foi usada para analisar os produtos formados após a incubação de homogenatos de tecido gengival de rato com Ang I ou tetradecapeptídeo substrato de renina (TDP). RT-PCR revelou a expressão de RNAm para renina, angiotensinogênio, ECA e receptores de Ang II (AT1a, AT1b e AT2) em tecido gengival; em fibroblastos cultivados de tecido gengival foi observada expressão de RNAm para renina, angiotensinogênio e receptor AT1a. A técnica de imunohistoquímica demonstrou a existência de renina em vasos de tecido gengival de rato. Atividade da ECA foi detectada por meio do ensaio fluorimétrico (4,95±0,89 nmol His-Leu/g.min). Quando Ang I foi usada como substrato, análises de HPLC mostraram a formação de Ang 1-9 (0,576±0,128 nmol/mg.min), Ang II (0,066±0,008 nmol/mg.min) e Ang 1-7 (0,111±0,017 nmol/mg.min), enquanto que os mesmos peptídeos (0,139±0,031; 0,206±0,046 e 0,039±0,007 nmol/mg.min, respectivamente) e Ang I (0,973±0,139 nmol/mg.min) foram formados quando TDP foi usado como substrato. Adicionalmente, análises de HPLC revelaram a ausência de enzimas que degradam Ang II em homogenatos de tecido gengival de rato. Em conclusão, os resultados apresentados neste trabalho mostram claramente a existência de um SRA local em tecido gengival de rato, que é capaz de gerar Ang II e outros peptídeos vasoativos in vitro. Estudos adicionais são necessários para elucidar o papel deste sistema local no tecido gengival de rato. / Systemic renin-angiotensin system (RAS) promotes the plasmatic production of angiotensin (Ang) II, which acts through the interaction with specific receptors. The concept of this classic circulating RAS has been modified since there is growing evidence that local systems in various tissues and organs are capable of generating angiotensins independently of the circulating RAS. Recent works suggest the existence of some RAS components in the gingival tissue and cultured gingival fibroblasts of different species, but there is paucity of data in the literature regarding the unequivocal existence of crucial RAS components, such as renin and angiotensinogen, in the rat gingival tissue. Therefore, the aims of the present work were to: 1) study the expression and localization of RAS components in the rat gingival tissue and 2) evaluate the in vitro production of Ang II and other peptides catalyzed by rat gingival tissue homogenates incubated with different precursors of Ang II. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to assess mRNA expression. Immunohistochemical (IHC) analysis aimed to detect and localize renin in the rat gingival tissue. A standardized fluorimetric method with the tripeptide Hippuryl-Histidyl-Leucine (Hip-His-Leu) was used to measure tissue ACE activity in rat gingival tissue homogenates. High performance liquid chromatography (HLPC) was used to analyze the products formed after the incubation of rat gingival tissue homogenates with Ang I or tetradecapeptide renin substrate (TDP). RT-PCR revealed the mRNA expression for renin, angiotensinogen, ACE and Ang II receptors (AT1a, AT1b and AT2) in the rat gingival tissue; cultured gingival fibroblasts expressed renin, angiotensinogen and AT1a receptor. IHC demonstrated the existence of renin in vessels of the rat gingival tissue. ACE activity was detected by the fluorimetric assay (4.95±0.89 nmol His-Leu/g.min). When Ang I was used as the substrate, HPLC analyses showed the formation of Ang 1-9 (0.576±0.128 nmol/mg.min), Ang II (0.066±0.008 nmol/mg.min) and Ang 1-7 (0.111±0.017 nmol/mg.min) whereas these same peptides (0.139±0.031; 0.206±0.046 and 0.039±0.007 nmol/mg.min, respectively) and Ang I (0.973±0.139 nmol/mg.min) were formed when TDP was the substrate. Additionally, HPLC revealed absence of Ang II degrading enzymes in rat gingival tissue homogenates. In conclusion, the results presented here clearly show the existence of a local RAS in the rat gingival tissue, which is capable of generating Ang II and other vasoactive peptides in vitro. Further studies are required to elucidate the role of this system in the rat gingival tissue.

Quinze dias após a lesão por cateter balão, observou-se que o efeito máximo da Ang II na artéria contralateral à lesão está aumentado em relação aos valores obtidos em artérias de animais intactos. Esse aumento do Emax da Ang II não é modificado na ausência do endotélio. A lesão por cateter balão não acarreta alterações morfológicas e morfométricas da artéria contralateral à lesão quando comparadas àquelas observadas na artéria de animais controle. A desenervação simpática com 6-hidrodopamina e a desnervação sensorial com capsaicina revertem o aumento do Emax da Ang II na artéria contralateral à lesão por cateter balão. As curvas concentração-efeito para o angiotensinogênio e para Ang I apresentam o mesmo perfil na artéria contralateral à lesão por cateter balão e na artéria de animais controle. Na presença do endotélio, o losartan (antagonista do receptor AT1) e PD 123,319 (antagonista do receptor AT2) antagonizaram de forma não-superável os efeitos contráteis da Ang II em artérias de animais controle e contralateral à lesão. Observou-se, ainda, que o efeito vasorelaxante de altas concentrações de Ang II é revertido para efeitos vasoconstrictores na presença dos antagonistas seletivos dos receptores AT1, Mas e B2, tanto em artérias de animais controle quanto em artérias contralaterais à lesão. Entretanto, o Emax da Ang II nessas condições é maior na artéria contralateral à lesão. Em artéria contralateral à lesão observou-se aumento na expressão dos receptores AT2 e Mas, enquanto receptores AT1 apresenta o mesmo perfil de expressão daquele observado em artéria de animais controle. A Ang (1-7) induz relaxamento em artérias com e sem endotélio. O parâmetro de Emax da Ang (1-7) está significativamente aumentado na artéria contralateral na presença e ausência de endotélio. O Emax da Ang II, em artérias controle com endotélio, na presença de inibidores da enzima NOS, está aumentada, enquanto que na artéria contralateral este parâmetro não sofre alteração. A produção dos metabólitos do óxido nítrico (nitrito e nitrato) está reduzida na artéria contralateral à lesão quando comparado ao observado em artérias de animais controle, bem como a expressão de todas as isoformas da NOS. A lesão por cateter balão promove aumento na formação de EROs na artéria contralateral à lesão, que desaparece na presença de tiron (seqüestrador de EROs). A lesão também induz aumento na expressão da enzima p22phox, subunidade do sistema NADPH oxidase. O Emax da Ang II em artéria contralateral à lesão na presença de Tiron é semelhante ao observado em artérias de animais controle na ausência do seqüestrador. Em conclusão, a lesão por cateter balão promove respostas neurocompensatórias e aumento do estresse oxidativo em artéria contralateral à lesão. Estas alterações podem influenciar a expressão do receptor AT2 e Mas, e também mecanismos intracelulares desencadeados pela ativação de receptores AT1 e Mas. / Fifteen days after balloon catheter injury Emax of Ang II was increased in the contralateral artery as compared to values obtained in arteries from intact animals. This increase in Ang II Emax was not modified in the absence of the endothelium. The morphological and morphometric characteristics in the contralateral artery were not altered as compared to control animals. The sympathetic desnervation and sensory desnervation abolished the increase Emax of Ang II in the contralateral artery. The concentration-effect curves to angiotensinogen and Ang I were similar in contralateral arteries and in control arteries. In the presence of endothelium, losartan (AT1 antagonist receptor) and PD 123,319 (AT2 antagonist receptor) showed noncompetitive antagonistic characteristics in control arteries and contralateral artery. It was also observed that vasorelaxant effect of high concentrations of Ang II was reversed to vasoconstrictors effects in the presence of selective antagonists of AT1 receptors, Mas receptors and B2 receptors in the control arteries and contraalteral arteries. However, Emax of Ang II in these conditions was greater in contralateral artery. Contralateral artery showed increased expression of AT2 and Mas receptors, while AT1 have the same expression when compared to control arteries. Ang (1-7) triggered concentration response curves in arteries with and without endothelium. However, was observed Emax Ang (1-7) values was significantly increased in the contralateral artery in presence or absence of endothelium. Emax of Ang II in control arteries with endothelium in the presence of NOS isoforms inhibitors was increased, whereas the contralateral artery this parameter was the same. Nitrite and nitrate production was reduced in the contralateral artery when compared to control artery. NOS isoforms expression were reduced in contralateral artery. Balloon catheter injury increased ROS formation in contralateral artery, which abolished in the presence of tiron (ROS scavenger). The injury also induced increased p22phox enzyme expression, subunit of the NADPH oxidase system. Ang II Emax in the contralateral artery in the presence of tiron was similar as obtained in control arteries without tiron. In conclusion, the balloon catheter injury promoted neurocompensatory responses and increased oxidative stress in the contralateral artery. These changes increased AT2 and Mas receptor expression and also intracellular mechanisms triggered by activation of AT1 receptors.

O sistema renina-angiotensina (SRA) circulante é um sistema endócrino que promove a produção de angiotensina (Ang) II, a qual exerce seus efeitos pela interação com receptores específicos. O conceito clássico do SRA circulante está sendo modificado, pois tem sido demonstrada a existência de sistemas locais capazes de gerar angiotensinas de forma independente do SRA circulante em vários tecidos e órgãos. Trabalhos recentes sugerem a existência de alguns componentes do SRA em tecido gengival e fibroblastos gengivais de diferentes espécies. Porém, não são encontrados na literatura achados inequívocos sobre a presença de importantes componentes do SRA, tais como renina e angiotensinogênio, no tecido gengival de rato. Portanto, os objetivos do presente trabalho foram: 1) estudar a expressão e localização de componentes do SRA no tecido gengival de rato e 2) estudar in vitro a funcionalidade do SRA local em homogenato de tecido gengival de rato quanto à formação de Ang II e outros peptídeos vasoativos a partir de precursores de Ang II. Transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RTPCR) foi utilizada para avaliar a expressão de RNAm. Análise imunohistoquímica foi utilizada para detecção e localização de renina no tecido gengival de rato. Um método fluorimétrico padronizado com o tripeptídeo Hipuril-Histidina-Leucina (Hip-His-Leu) foi usado para medir a atividade da ECA em homogenatos de tecido gengival de rato. A técnica de cromatografia líqüida de alto desempenho (HPLC) foi usada para analisar os produtos formados após a incubação de homogenatos de tecido gengival de rato com Ang I ou tetradecapeptídeo substrato de renina (TDP). RT-PCR revelou a expressão de RNAm para renina, angiotensinogênio, ECA e receptores de Ang II (AT1a, AT1b e AT2) em tecido gengival; em fibroblastos cultivados de tecido gengival foi observada expressão de RNAm para renina, angiotensinogênio e receptor AT1a. A técnica de imunohistoquímica demonstrou a existência de renina em vasos de tecido gengival de rato. Atividade da ECA foi detectada por meio do ensaio fluorimétrico (4,95±0,89 nmol His-Leu/g.min). Quando Ang I foi usada como substrato, análises de HPLC mostraram a formação de Ang 1-9 (0,576±0,128 nmol/mg.min), Ang II (0,066±0,008 nmol/mg.min) e Ang 1-7 (0,111±0,017 nmol/mg.min), enquanto que os mesmos peptídeos (0,139±0,031; 0,206±0,046 e 0,039±0,007 nmol/mg.min, respectivamente) e Ang I (0,973±0,139 nmol/mg.min) foram formados quando TDP foi usado como substrato. Adicionalmente, análises de HPLC revelaram a ausência de enzimas que degradam Ang II em homogenatos de tecido gengival de rato. Em conclusão, os resultados apresentados neste trabalho mostram claramente a existência de um SRA local em tecido gengival de rato, que é capaz de gerar Ang II e outros peptídeos vasoativos in vitro. Estudos adicionais são necessários para elucidar o papel deste sistema local no tecido gengival de rato. / Systemic renin-angiotensin system (RAS) promotes the plasmatic production of angiotensin (Ang) II, which acts through the interaction with specific receptors. The concept of this classic circulating RAS has been modified since there is growing evidence that local systems in various tissues and organs are capable of generating angiotensins independently of the circulating RAS. Recent works suggest the existence of some RAS components in the gingival tissue and cultured gingival fibroblasts of different species, but there is paucity of data in the literature regarding the unequivocal existence of crucial RAS components, such as renin and angiotensinogen, in the rat gingival tissue. Therefore, the aims of the present work were to: 1) study the expression and localization of RAS components in the rat gingival tissue and 2) evaluate the in vitro production of Ang II and other peptides catalyzed by rat gingival tissue homogenates incubated with different precursors of Ang II. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to assess mRNA expression. Immunohistochemical (IHC) analysis aimed to detect and localize renin in the rat gingival tissue. A standardized fluorimetric method with the tripeptide Hippuryl-Histidyl-Leucine (Hip-His-Leu) was used to measure tissue ACE activity in rat gingival tissue homogenates. High performance liquid chromatography (HLPC) was used to analyze the products formed after the incubation of rat gingival tissue homogenates with Ang I or tetradecapeptide renin substrate (TDP). RT-PCR revealed the mRNA expression for renin, angiotensinogen, ACE and Ang II receptors (AT1a, AT1b and AT2) in the rat gingival tissue; cultured gingival fibroblasts expressed renin, angiotensinogen and AT1a receptor. IHC demonstrated the existence of renin in vessels of the rat gingival tissue. ACE activity was detected by the fluorimetric assay (4.95±0.89 nmol His-Leu/g.min). When Ang I was used as the substrate, HPLC analyses showed the formation of Ang 1-9 (0.576±0.128 nmol/mg.min), Ang II (0.066±0.008 nmol/mg.min) and Ang 1-7 (0.111±0.017 nmol/mg.min) whereas these same peptides (0.139±0.031; 0.206±0.046 and 0.039±0.007 nmol/mg.min, respectively) and Ang I (0.973±0.139 nmol/mg.min) were formed when TDP was the substrate. Additionally, HPLC revealed absence of Ang II degrading enzymes in rat gingival tissue homogenates. In conclusion, the results presented here clearly show the existence of a local RAS in the rat gingival tissue, which is capable of generating Ang II and other vasoactive peptides in vitro. Further studies are required to elucidate the role of this system in the rat gingival tissue.

O presente estudo avaliou o papel do receptor AT1 de Angiotensina II no desenvolvimento da hipertrofia dos cardiomiócitos promovida pelo T3, bem como a participação dos mecanismos intracelulares deflagrados pelo receptor AT1 neste modelo de hipertrofia cardíaca. O silenciamento do receptor AT1 com RNA de interferência preveniu totalmente o desenvolvimento da hipertrofia dos cardiomiócitos induzida pelo T3. Os cardiomiócitos tratados com T3 demonstraram uma rápida ativação da via da Akt/GSK-3/mTOR, a qual foi atenuada ou prevenida pelo silenciamento do receptor AT1. Ainda, a expressão de Angiotensina I/II no lisado celular e a expressão do receptor AT1 foram rapidamente aumentados pelo T3. Esses dados demonstram pela primeira vez que o receptor AT1 é um mediador crítico da hipertrofia dos cardiomiócitos induzida pelo T3, bem como para a ativação da via da Akt, sugerindo que a via Ang I/II-AT1-Akt/GSK-3/mTOR corresponde a um potencial mediador dos efeitos tróficos exercidos pelo T3 nessas células. / The present study investigated the role of Angiotensin type 1 receptor (AT1R) in T3-induced cardiomyocyte hypertrophy, as well as the participation of the intracellular mechanisms mediated by AT1R in this cardiac hypertrophy model. The AT1R silencing using small interfering RNA totally prevented the development of T3-induced cardiomyocyte hypertrophy. The cardiomyocytes treated with T3 demonstrated a rapid activation of Akt/GSK-3/mTOR signaling pathway, which was attenuated or prevented by the AT1R silencing. In addition, local Angiotensin I/II (Ang I/II) levels and the AT1R expression were rapidly increased by T3 treatment. These data demonstrate for the first time that the AT1R is a critical mediator to the T3-induced cardiomyocyte hypertrophy, as well as to the activation of the Akt signaling, suggesting that the Ang I/II-AT1R-Akt/GSK-3/mTOR pathway corresponds to a potential mediator of the trophic effect exerted by T3 in cardiomyocytes.