Made available in DSpace on 2014-12-05T18:41:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) carla_freitas_ioc_dout_2014.pdf: 2452947 bytes, checksum: a652971a9d288c473c5d3b704f051ada (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Corpúsculos lipídicos (CLs) são organelas citoplasmáticas altamente associadas à resposta inflamatória. Eles estão presentes em diversos tipos celulares e podem aumentar em número e/ou tamanho frente à situações infecciosas. Também altamente envolvidos com os fenômenos inflamatórios estão os inflamassomos. Classicamente, esses complexos moleculares são formados por um tipo de receptor tipo Nod (NLR), uma proteína adaptadora (geralmente ASC) e a enzima caspase-1 ativada. A reunião destas proteínas e a ativação de caspase-1 levam à clivagem das pro-formas de IL-1\03B2 e de IL-18 em suas formas maduras prontas para liberação. Apesar do avanço no conhecimento da biologia destas duas estruturas, corpúsculos lipídicos e inflamassomos, nada foi descrito sobre uma possível interação entre elas. Utilizando um modelo de estudo em macrófagos derivados de medula óssea de camundongos C57Bl/6 e infecção com Mycobacterium bovis BCG buscamos pesquisar se existe essa interação e de que maneira isso ocorreria. Num primeiro momento, pesquisamos a influência de receptores tipo nod e proteínas relacionadas, na biogêsene de CLs, na liberação de IL-1\03B2 e de eicosanóides. Observamos que a infecção dos macrófagos com BCG é capaz de induzir liberação de IL-1\03B2 e ativação de caspase-1, caracterizando ativação de inflamassomos. Vimos que a ausência de Nod1, Nod2, Rip2, IL-1R1 e IL-18R não interfere na biogênese de CL, nem na liberação de IL-1\03B2 e de PGE2 e LTB4. A ausência de ASC, caspase-1 e o bloqueio de NLRP3 e P2X7 potencializam a formação de corpúsculos lipídicos induzida por BCG A ausência de ASC e caspase-1 não altera a liberação de eicosanóides e o bloqueio de NLRP3 reduz a liberação de IL-1\03B2 e de PGE2. Vimos que ATP é capaz de induzir a biogênese de corpúsculos lipídicos de maneira dependente de P2X7. Concluimos que a presença de proteínas envolvidas na via dos inflamassomos regula negativamente a biogênese de corpúsculo lipídicos. Corpúsculos lipídicos são conhecidos por compartimentalizar diversas proteínas envolvidas em importantes fenômenos celulares, dependendo do tipo celular e do estímulo. Sendo assim, no segundo bloco, avaliamos se os corpúsculos gerados pela infecção com BCG seriam capazes de armazenar NLRs e proteínas associadas. Também avaliamos se a inibição da formação de corpúsculos lipídicos teria impacto sobre a ativação de inflamassomos e liberação de mediadores inflamatórios. Observamos a presença de NLRP3, caspase-1, IL-1\03B2, Nod1, Nod2 e Rip2, mas não de ASC, nos corpúsculos lipídicos. Também vimos que a redução da formação de CL induzida por BCG leva à redução da liberação e da síntese de IL-1\03B2, mas não interfere na atividade de caspase-1. Diminui também a liberação de citocinas pro e anti-inflamatórias, além de PGE2. Baseado em nossos resultados, concluimos que existe sim uma relação entre CLs e inflamassomos, onde o segundo pode regular negativamente o primeiro e CLs podem servir de plataforma, pelo menos transitória, para a localização de proteínas da via dos NLRs. O avanço no entendimento das funções de inflamassomos e corpúsculos lipídicos pode colaborar para a geração de estratégias de combate às patologias associadas à estas duas estruturas / Pathogen - triggered dysregulation of host - cell lipid metabolism is emerging as a key feature in the pathogenesis of mycobacterial infection. Accumulating evidence suggests that modulation of host lipid metabolism through mycobacteria - induced lipid body (LB) formation is an important mechanism for mycobacterial survival and growth. However the mechanisms involved in lipid body biogenesis are still not completely understood. Mycobacterial - induced inflammasome activation of caspase - 1 and consequent secretion of IL - 1β and IL - 18 in macrophages has been demonstrated as a host - defense mechanism. In the present study we investigated the participation of inflammasomes in lipid body biogenesis and function during infection with Mycobacterium bovis BCG in macrophages. W e observed IL - 1 β release and caspase - 1 activation in bone marrow macrophage, featuring inflammasome activation induced by BCG. Nod1, Nod2, Rip2, IL - 1R1 and IL - 18R doesn't influence lipid bodies biogenesis, neither IL - 1 β nor PGE 2 and LTB 4 release induced by BCG . ASC and caspase - 1 absence and the block of NLRP3 and P2X 7 leads to increase lipid bodies number induced by BCG . The absence of caspase - 1 and ASC inhibited the release of IL - 1β induced by BCG , but does not alter the release of eicosanoids. Blocking NLRP3 reduces the release of both, IL - 1β and PGE 2 . Using an activator of inflam ma somes , ATP, we observed an indu ce d lipid body biogenesis in a P2X 7 - depende nt manner . Activation of inflam m asome s by L PS and ATP leads to increased release of eicosanoids, besides the formati on of LB s. W e conclude that the presence of proteins involved in the pathway of inflamassom e s negatively regulate s biogenesis of lipid bodies. Lipid bodies are known to compartmentalize many different proteins associated with cell signaling , depending on t he cell type and stimulus. Thus , in the second block , we assessed whether the LBs generated by infection with BCG would be able to contain NLR s and associated proteins. We also evaluated whether the inhibition of lipid body for mation would impact inflam m asome s activation and re lease of inflammatory mediators. We observed NLRP3, caspase - 1 , IL - 1β, Nod1, Nod2 and RIP2 , but not ASC are associated wi th lipid bodies. Also , we have that the reduction in the formation of LC induced by BCG leads to reduced synthesis and release of IL - 1β but did not interf ere in the activity of caspase - 1. It also reduces the release of cytokines , in addition to PGE 2 . Base d o n our results , we conclude that inflam m asome s activation could negatively regulate the lipid bodies biogenesis . Moreover, lipid bodies could be site of localization to NLRs and associated - protein , but they doesn't interfere in inflammasomes activation, although the IL - 1β release is reduced by lipid bobies numbers decreased. The knowledge of inflammasome and lipid bodies biology could be useful to generate new approaches to diseases associated with these structures

Candida albicans (C. albicans) constitui um fungo comum nas mucosas do trato gastrointestinal, incluindo cavidade bucal, que pode ocasionar candidose local ou invasiva, principalmente em estados de imunossupressão. Os mecanismos de defesa contra este fungo podem ser desencadeados pela ligação dos receptores de reconhecimento de padrões, TLR2 e dectina-1, aos seus ligantes, como a fosfolipomanana e os -glucanos encontrados na parede celular de C. albicans. Os mastócitos possuem estes receptores em sua membrana celular e residem nas interfaces com o ambiente, podendo constituir umas das primeiras linhas de defesa. Seus mecanismos imunes incluem síntese e secreção de mediadores, apresentação de antígenos, bem como atividades fagocitária e microbicida. Todos estes mecanismos de defesa podem ser desencadeados de forma independente ou cooperativa entre os receptores TLR2 e dectina-1. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro a ocorrência de fagocitose, a geração de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio pelos mastócitos desafiados ou não com C. albicans, e a participação do TLR2 e dectina-1 nesses eventos. Para isto, mastócitos, diferenciados da medula óssea (BMMCs) de camundongos selvagens (BMMCs Wt) ou TLR2-/- (BMMCs TLR2-/-) foram desafiados com C. albicans. Células eram também bloqueadas in vitro com anticorpos específicos anti-dectina-1(BMMCs BD-1 e BMMCs TLR2-/-/BD-1). Os eventos foram analisados por meio de ensaio fluorescente de fagocitose, método colorimétrico de Griess e pelos kits DAF-FM diacetato, Cell Rox Deep e Amplex Red. Os resultados foram expressos através de porcentagem, valores médios e desvios padrão, obtidos a partir de pelo menos três experimentos independentes. As análises estatísticas foram realizadas através do teste ANOVA fatorial, seguido de Fischer. Entre os BMMCs Wt, houve maior taxa de fagocitose com uma maior produção intracelular de NO aos 60 minutos em comparação aos outros tempos. A liberação extracelular de NO foi maior aos 120 minutos em relação aos outros tempos. O número de leveduras fagocitadas aumentou com o tempo, porém com diferença significante somente entre os tempos de 30 e 120 minutos. Entre os BMMCs TLR2-/-, houve maior número de leveduras fagocitadas aos 60 minutos em comparação aos 120 minutos. Porém, a liberação extracelular de NO foi menor aos 60 minutos em relação aos outros tempos. Comparando-se com os BMMCs Wt, os BMMCs TLR2-/- apresentaram uma redução na taxa de fagocitose, aos 60 minutos, menor liberação de NO extracelular, em todos os tempos, e menor número de leveduras fagocitadas aos 120 minutos. Comparando-se com os BMMCs Wt, os BMMCs BD-1 e os BMMCs TLR2-/-/BD-1 apresentaram uma redução na taxa de fagocitose com uma menor produção intracelular de NO, aos 60 minutos, e menor liberação de NO extracelular, aos 60 e 120 minutos. Comparando-se com os BMMCs Wt, os BMMCs TLR2-/-/BD-1 apresentaram uma maior produção de NO intracelular, aos 30 minutos, e menor número de leveduras fagocitadas aos 60 e 120 minutos. Sendo assim, concluímos que os mastócitos são capazes de fagocitar C. albicans com concomitante produção de substâncias potencialmente candidacidas. Concluímos também que estes mecanismos envolvem o reconhecimento do fungo via TLR2 e dectina-1, principalmente de forma sinérgica. / Candida albicans (C. albicans) is a common fungus present in gastrointestinal tract mucosa including oral cavity, which may cause local or invasive candidiasis, especially in immunosuppression. The mechanisms of defense against this fungus may be triggered by the binding of the pattern recognition receptors TLR2 and dectin-1 to its ligands, such as phospholipomannan and -glucans found in the cell wall of C. albicans. Mast cells express these receptors on cell membrane and reside in the interfaces with the environment, and may be one of the first lines of defense. Their immune mechanisms include synthesis and secretion of mediators, antigen presentation, as well as phagocytic and microbicidal activities. These mechanisms can be triggered independently or cooperatively by TLR2 and dectin-1. Therefore, the aim of the study was to evaluate in vitro the phagocytosis, the generation of nitric oxide and hydrogen peroxide by mast cells challenged or not with C. albicans, and the involvement of TLR2 and dectin-1 receptors in these mechanisms. Bone marrow-derived mast cell (BMMCs) from wild type mice (BMMCs Wt) or TLR2-/- (BMMCs TLR2-/-) was challenge with C. albicans. Cells were also in vitro blocked with specific anti-dectin-1 antibodies (BMMCs BD-1 and BMMCs TLR2-/-BD-1). The mechanisms were analyzed using fluorescent phagocytosis assay, Griess colorimetric method and by DAF-FM diacetate, CellRox® Deep Reagent and Amplex® Red enzyme assays. Results were expressed by percentage, mean and standard deviations obtained from the least three independent experiments. Statistic was performed using factorial ANOVA and Fischer. Among BMMCs Wt, there was higher phagocytosis rate associated with increased intracellular NO production at 60 minutes, comparing to other periods. The extracellular release of NO was higher at 120 minutes comparing to other periods. The number of phagocytized yeasts increased over time, however with significant difference only among the 30 and 120 minutes. Among BMMCs TLR2-/-, there was higher number of phagocytized yeast at 60 minutes compared to 120 minutes. However, the extracellular release of NO at 60 minutes was lower comparing to other periods. In comparison to BMMCs Wt, the BMMCs TLR2-/- showed a reduction in the phagocytosis rate, at 60 minutes, lower release of extracellular NO, at all times, and fewer numbers of phagocytized yeast at 120 minutes. Compared to BMMCs Wt, the BMMCs BD-1 and BMMCs TLR2-/-/BD-1 showed a reduction in the phagocytosis rate with lower intracellular NO production, at 60 minutes, and decrease of extracellular NO release, at 60 and 120 minutes. Comparing to BMMCs Wt, the BMMCs TLR2-/-/BD-1 showed increased production of intracellular NO, after 30 minutes, and fewer phagocytized yeast, at 60 and 120 minutes. Therefore, we conclude that mast cells are able to phagocytose C. albicans with concomitant production of the potentially microbicidal substances. Also conclude that these mechanisms involve the fungal recognition via TLR2 and dectin-1, especially by means of synergistic way.

Candida albicans (C. albicans) constitui um fungo comum nas mucosas do trato gastrointestinal, incluindo cavidade bucal, que pode ocasionar candidose local ou invasiva, principalmente em estados de imunossupressão. Os mecanismos de defesa contra este fungo podem ser desencadeados pela ligação dos receptores de reconhecimento de padrões, TLR2 e dectina-1, aos seus ligantes, como a fosfolipomanana e os -glucanos encontrados na parede celular de C. albicans. Os mastócitos possuem estes receptores em sua membrana celular e residem nas interfaces com o ambiente, podendo constituir umas das primeiras linhas de defesa. Seus mecanismos imunes incluem síntese e secreção de mediadores, apresentação de antígenos, bem como atividades fagocitária e microbicida. Todos estes mecanismos de defesa podem ser desencadeados de forma independente ou cooperativa entre os receptores TLR2 e dectina-1. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro a ocorrência de fagocitose, a geração de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio pelos mastócitos desafiados ou não com C. albicans, e a participação do TLR2 e dectina-1 nesses eventos. Para isto, mastócitos, diferenciados da medula óssea (BMMCs) de camundongos selvagens (BMMCs Wt) ou TLR2-/- (BMMCs TLR2-/-) foram desafiados com C. albicans. Células eram também bloqueadas in vitro com anticorpos específicos anti-dectina-1(BMMCs BD-1 e BMMCs TLR2-/-/BD-1). Os eventos foram analisados por meio de ensaio fluorescente de fagocitose, método colorimétrico de Griess e pelos kits DAF-FM diacetato, Cell Rox Deep e Amplex Red. Os resultados foram expressos através de porcentagem, valores médios e desvios padrão, obtidos a partir de pelo menos três experimentos independentes. As análises estatísticas foram realizadas através do teste ANOVA fatorial, seguido de Fischer. Entre os BMMCs Wt, houve maior taxa de fagocitose com uma maior produção intracelular de NO aos 60 minutos em comparação aos outros tempos. A liberação extracelular de NO foi maior aos 120 minutos em relação aos outros tempos. O número de leveduras fagocitadas aumentou com o tempo, porém com diferença significante somente entre os tempos de 30 e 120 minutos. Entre os BMMCs TLR2-/-, houve maior número de leveduras fagocitadas aos 60 minutos em comparação aos 120 minutos. Porém, a liberação extracelular de NO foi menor aos 60 minutos em relação aos outros tempos. Comparando-se com os BMMCs Wt, os BMMCs TLR2-/- apresentaram uma redução na taxa de fagocitose, aos 60 minutos, menor liberação de NO extracelular, em todos os tempos, e menor número de leveduras fagocitadas aos 120 minutos. Comparando-se com os BMMCs Wt, os BMMCs BD-1 e os BMMCs TLR2-/-/BD-1 apresentaram uma redução na taxa de fagocitose com uma menor produção intracelular de NO, aos 60 minutos, e menor liberação de NO extracelular, aos 60 e 120 minutos. Comparando-se com os BMMCs Wt, os BMMCs TLR2-/-/BD-1 apresentaram uma maior produção de NO intracelular, aos 30 minutos, e menor número de leveduras fagocitadas aos 60 e 120 minutos. Sendo assim, concluímos que os mastócitos são capazes de fagocitar C. albicans com concomitante produção de substâncias potencialmente candidacidas. Concluímos também que estes mecanismos envolvem o reconhecimento do fungo via TLR2 e dectina-1, principalmente de forma sinérgica. / Candida albicans (C. albicans) is a common fungus present in gastrointestinal tract mucosa including oral cavity, which may cause local or invasive candidiasis, especially in immunosuppression. The mechanisms of defense against this fungus may be triggered by the binding of the pattern recognition receptors TLR2 and dectin-1 to its ligands, such as phospholipomannan and -glucans found in the cell wall of C. albicans. Mast cells express these receptors on cell membrane and reside in the interfaces with the environment, and may be one of the first lines of defense. Their immune mechanisms include synthesis and secretion of mediators, antigen presentation, as well as phagocytic and microbicidal activities. These mechanisms can be triggered independently or cooperatively by TLR2 and dectin-1. Therefore, the aim of the study was to evaluate in vitro the phagocytosis, the generation of nitric oxide and hydrogen peroxide by mast cells challenged or not with C. albicans, and the involvement of TLR2 and dectin-1 receptors in these mechanisms. Bone marrow-derived mast cell (BMMCs) from wild type mice (BMMCs Wt) or TLR2-/- (BMMCs TLR2-/-) was challenge with C. albicans. Cells were also in vitro blocked with specific anti-dectin-1 antibodies (BMMCs BD-1 and BMMCs TLR2-/-BD-1). The mechanisms were analyzed using fluorescent phagocytosis assay, Griess colorimetric method and by DAF-FM diacetate, CellRox® Deep Reagent and Amplex® Red enzyme assays. Results were expressed by percentage, mean and standard deviations obtained from the least three independent experiments. Statistic was performed using factorial ANOVA and Fischer. Among BMMCs Wt, there was higher phagocytosis rate associated with increased intracellular NO production at 60 minutes, comparing to other periods. The extracellular release of NO was higher at 120 minutes comparing to other periods. The number of phagocytized yeasts increased over time, however with significant difference only among the 30 and 120 minutes. Among BMMCs TLR2-/-, there was higher number of phagocytized yeast at 60 minutes compared to 120 minutes. However, the extracellular release of NO at 60 minutes was lower comparing to other periods. In comparison to BMMCs Wt, the BMMCs TLR2-/- showed a reduction in the phagocytosis rate, at 60 minutes, lower release of extracellular NO, at all times, and fewer numbers of phagocytized yeast at 120 minutes. Compared to BMMCs Wt, the BMMCs BD-1 and BMMCs TLR2-/-/BD-1 showed a reduction in the phagocytosis rate with lower intracellular NO production, at 60 minutes, and decrease of extracellular NO release, at 60 and 120 minutes. Comparing to BMMCs Wt, the BMMCs TLR2-/-/BD-1 showed increased production of intracellular NO, after 30 minutes, and fewer phagocytized yeast, at 60 and 120 minutes. Therefore, we conclude that mast cells are able to phagocytose C. albicans with concomitant production of the potentially microbicidal substances. Also conclude that these mechanisms involve the fungal recognition via TLR2 and dectin-1, especially by means of synergistic way.