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Apesar dos avanços no tratamento dos diferentes subtipos moleculares do câncer de mama, diversos efeitos colaterais e resistência ao tratamento são observados. Nesse contexto, a busca por novos marcadores moleculares ainda é necessária. A família do coativador - 1 do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama-1 (PGC-1) exerce funções cruciais no metabolismo energético celular e alguns trabalhos na literatura mostram alterações de PGC-1 no desenvolvimento do câncer. Contudo, mecanismos envolvidos na proliferação celular do carcinoma de mama permanecem desconhecidos. O objetivo geral foi determinar os mecanismos pelos quais PGC-1 controla a proliferação de células tumorais de mama, com foco em vias metabólicas e de sinalização redox. Para alcançar os objetivos, foi determinada a expressão de PGC-1alfa e beta em células tumorais de mama dos subtipos moleculares luminal (MCF-7), HER2- superexpresso (SKBR3) e triplo negativo (MDAMB231) em relação a uma linhagem de mama não tumoral (MCF-10A). Foi encontrada maior expressão gênica e proteica de PGC-1beta na superexpressão de HER2, e maior taxa de crescimento para essa linhagem. Para investigar se PGC-1beta pode estar envolvido na proliferação dessas células, utilizamos sequências específicas de RNA de interferência para o knockdown de PGC-1beta nas células SKBR3. Após o tratamento houve diminuição de proliferação celular. Assim, investigamos os prováveis mecanismos pelos quais PGC-1beta diminui a proliferação celular. Nossos resultados mostram que o knockdown de PGC-1beta não influenciou a expressão de ciclinas (B, C, D e E) e não houve diferença na quantidade de DNA mitocondrial, fator de transcrição mitocondrial A (TFAM), fator de respiração nuclear (NRF) 1 e 2. Em seguida, mostramos que o knockdown de PGC-1beta diminuiu a produção de lactato intracelular e aumentou a atividade da enzima citrato sintase, e houve tendência a maior taxa de respiração celular. Detectamos maiores níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) após knockdown de PGC-1beta enquanto que a produção de nitrito e nitrato, não diferiu. Não houve alteração na atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, catalase e sistema glutationa. Os resultados revelam presença de despolarização mitocondrial quando PGC-1? é diminuído nas células HER2. Como os receptores relacionados a estrógeno (ERR) possuem conhecido papel na regulação do metabolismo energético, avaliamos se sua expressão é modulada por PGC-1?. A diminuição de PGC-1beta não influenciou a expressão gênica de ERRy e reduziu a expressão gênica de ERRalfa. Por fim, mostramos maior expressão de PGC-1beta proveniente de tumores de pacientes com câncer de mama HER2- superexpresso em relação aos diferentes subtipos moleculares. Conclui-se que a diminuição da sinalização por HER2/ PGC-1beta/ ERRalfa está envolvida com a diminuição da via glicolítica e aumento da via oxidativa com consequente aumento de EROs e perda do potencial de membrana mitocondrial, resultando em diminuição da proliferação celular. Espera-se que os resultados desse estudo ajudem na identificação de vias de sinalização importantes que controlam tanto o metabolismo energético quanto a proliferação de células tumorais, as quais poderão se tornar alvos terapêuticos no futuro / Despite a marked improvement in treatments for all breast cancer subtypes, several side-effects and resistance to therapy are noticed. In this context, the searching for new molecular targets for breast cancer treatment is still a challenge. Peroxisome proliferator-activated receptor- gamma coactivator 1 (PGC-1) is the main regulator of cell energy homeostasis and studies in the literature show alterations regarding PGC-1 in cancer development. However, mechanisms involved in cellular proliferation of breast cancer remain unknown. We aimed to determine the mechanisms by which PGC-1beta controls breast cancer cell proliferation, focusing on metabolic and redox signaling. To reach this goal, we determined PGC-1alfa and beta expression in breast cancer cell lines as luminal (MCF-7), HER2-overexpressed (SKBR3) and triple- negative (MDAMB231) as compared to a non-tumoral breast cell line (MCF-10A). We found increased gene and protein expression of PGC-1beta in HER2- overexpressed cells and increased cellular proliferation. To investigate whether PGC-1beta could be involved in the proliferation of those cells, we used specific sequences of silencing interfering RNA for knockdown of PGC-1beta in SKBR3 cells. After treatment we observed a decrease in cellular proliferation. Thus, we next investigated the probable mechanisms by which PGC-1beta could decrease cellular proliferation. Our results showed that knockdown of PGC-1beta did not influence on cyclin expression (B, C, D and E), mitochondrial DNA number, mitochondrial transcription factor - A (TFAM), nuclear receptor factor (NRF) 1 and 2 expression. We showed that knockdown of PGC-1beta induced a decrease intracellular lactate production, increase in citrate synthase activity and a trend to increase cellular respiration rate. Thereby, we detected greater amounts of reactive oxygen species (ROS) after knockdown of PGC-1beta, and no alterations was found for nitrite and nitrate levels. No alterations regarding antioxidant enzymes activities as superoxide dismutase, catalase, and glutathione system were found. Results revealed loss of mitochondrial membrane potential when PGC-1beta is decreased in HER2- overexpressed cells. As estrogen related receptors (ERR) have a recognized role in the regulation of energetic metabolism, we assessed whether their expression could be modulated by PGC-1beta. The decrease in PGC-1beta expression did not influence on ERRy expression, but it decreased the gene expression of ERRalfa. Finally, we demonstrated increased PGC-1beta expression in HER2- overexpressing tumors from breast cancer patients. Taken together, we conclude that decrease in HER2/ PGC-1beta/ ERRalfa signaling may be related to decrease in glycolytic pathway and increase in oxidative metabolism resulting in increased ROS production and loss of mitochondrial membrane potential, which can lead to decreased cellular proliferation. We hope that the findings may help in the identification of important cellular signaling that may control energetic metabolism regarding tumor cells proliferation, which can became future target therapies

A interação entre as vias de sinalização do ER, do IGF-I e da integrina 1 é essencial para a manutenção da homeostase da glândula mamária normal, e alterações nessas vias de sinalização estão associadas ao processo de tumorigênese da mama. Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar a influência e inter-relação entre as vias de sinalização do IGF-I, do ER e da integrina 1 na regulação da transcrição dos genes PHLDA1 e PAWR. Para isso, células MCF-7 foram tratadas, por diferentes tempos, com 10nM de 17- estradiol (E2), 12,5nM de IGF-I, 30M de LY294002 (inibidor da PI-3K), 30M de SB202190 (inibidor da p38MAPK) e 1M de ICI182780 (antagonista do ER), ou transfectadas com 40nM de siRNA para integrina 1. A expressão gênica foi avaliada por PCR em tempo real e a expressão protéica por Western Blot. A expressão do gene PHLDA1 aumentou após tratamento com E2 por 6h (p=0,05), e esse efeito foi inibido pelo tratamento com ICI (p<0,05). O tratamento com E2 por 24h inibiu a expressão do gene PAWR (p<0,05), e esse efeito foi dependente de ER, pois foi inibido pelo tratamento com ICI (p<0,05). O tratamento com IGF-I por 1,5h causou aumento na expressão do gene PHLDA1 (p<0,05); e o tratamento com IGF-I por 24h causou diminuição na expressão do gene PAWR (p<0,05). Foi observado aumento na expressão protéica de PHLDA1 após tratamento das MCF-7 com E2 ou IGF-I por 1:30h. A regulação da expressão do PAWR pelo IGF-I ocorreu através das vias da PI-3K e p38MAPK. O efeito do IGF-I sobre a expressão dos dois genes foi independente da ativação do ER, mas foi observado sinergismo entre E2 e IGFI na inibição da expressão dos transcritos do PAWR, com diminuição na expressão para nível menor do que o observado após tratamento com E2 ou IGF-I sozinhos (p<0,05). A repressão da expressão da integrina 1 resultou na diminuição dos níveis de expressão dos genes PHLDA1 e PAWR. Não foi observada interação entre o IGF-I e a integrina 1 na regulação dos genes PHLDA1 e PAWR. Portanto, o gene PHLDA1 é regulado positivamente pelo E2 e pelo IGF-I, mas não existe interação entre as vias. O gene PAWR é regulado negativamente pelo E2 e pelo IGF-I; o efeito do IGF-I é dependente da ativação da PI3-K e da p38MAPK, mas não do ER; e existe sinergismo entre E2 e IGF-I na regulação do PAWR / The interactions among ER, IGF-I and 1 integrin signaling pathways are essential for the maintenance of normal mammary gland homeostasis, and alterations in these pathways have been associated with mammary tumorigenesis. Therefore, the goal of this work was to investigate the influence and interaction among IGF-I, ER and 1 integrin signaling pathways on the regulation of PHLDA1 and PAWR transcription regulation. To accomplish that, MCF-7 cells were treated with 10nM 17-estradiol (E2), 12.5nM IGF-I, 30M LY294002 (a PI3-K inhibitor), 30M SB202190 (a p38MAPK inhibitor) and 1M ICI182,780 (ICI an ER antagonist), or transfected with 40nM siRNA aiming 1 integrin. Real time PCR and western blot were used to evaluate gene and protein expression, respectively. PHLDA1 mRNA expression increased after 6h of treatment with E2 (p=0.05), and this effect was inhibited by ICI (p<0.05). Treatment with E2 for 24h repressed PAWR gene expression (p<0.05) and this effect was dependent on ER, since treatment with ICI inhibited it (p<0.05). Treatment with IGF-I for 1.5h resulted in increased PHLDA1 gene expression (p<0,05) and also PHLDA1 protein expression; and treatment with IGF-I for 24h inhibited PAWR mRNA expression (p<0.05). IGF-I regulation of PAWR expression was dependent on PI3-K and p38MAPK activation. The regulation of both genes by IGF-I was independent of ER activation; however, IGF-I acted in synergism with E2 on PAWR expression resulting in lower PAWR expression than the observed after the treatments alone (p<0.05). Repression of 1 integrin expression resulted in downregulation of PHLDA1 and PAWR expression levels. No interaction was observed between IGF-I and 1 integrin on PHLDA1 and PAWR gene expression. In conclusion, PHLDA1 is positively regulated by E2 and IGF-I, but there is no interaction between them on PHLDA1 regulation. On the other hand, PAWR is negatively regulated by E2 and IGF-I; IGF-I effect is dependent on PI3-K and p38MAPK, but not on ER activation; E2 and IGF-I act synergistically on PAWR gene expression regulation

Po Lai See. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2002. / Includes bibliographical references (leaves 142-152). / Abstracts in English and Chinese. / TITLE PAGE --- p.p.1 / ACKNOWLEGDEMENTS --- p.p.2 / ABSTRACT --- p.p.3 / 摘要 --- p.p.6 / TABLE OF CONTENTS --- p.p.9 / LIST OF FIGURES AND TABLES --- p.p.16 / Chapter CHAPTER 1 --- GENERAL INTRODUCTION / Chapter 1.1 --- Estrogen and Estrogen Receptors and its Action --- p.p.18 / Chapter 1.1.1 --- Estrogen --- p.p.19 / Chapter 1.1.2 --- Estrogen Receptors --- p.p.19 / Chapter 1.1.3 --- Structural Differences between ERa and ERp --- p.p.21 / Chapter 1.1.4 --- Functional Differences --- p.p.22 / Chapter 1.1.5 --- Effects of Selective Estrogen Receptor Modulators --- p.p.22 / Chapter 1.1.6 --- Estrogen works --- p.p.23 / Chapter 1.1.7 --- Estrogen Receptors and Breast Cancer --- p.p.24 / Chapter 1.2 --- Flavonoids： Properties and Biological Activities --- p.p.25 / Chapter 1.2.1 --- Chemical Structure and Classification of flavonoids --- p.p.25 / Chapter 1.2.2 --- Biological Properties and Action Mechanism of Flavonoids… --- p.p.27 / Chapter 1.2.3 --- Flavonoids and breast cancer prevention --- p.p.27 / Chapter 1.3 --- Aims and Scopes of Investigation --- p.p.29 / Chapter CHAPTER 2 --- MATERIALS AND METHODS / Chapter 2.1 --- Chemicals --- p.p.30 / Chapter 2.1.1 --- Flavonoids --- p.p.30 / Chapter 2.1.2 --- Plasmids --- p.p.30 / Chapter 2.2 --- Mammalian cell culture --- p.p.31 / Chapter 2.2.1 --- Maintenance of cells --- p.p.31 / Chapter 2.2.2 --- Preparation of cell stock --- p.p.32 / Chapter 2.2.3 --- Cell recovery from liquid nitrogen stock --- p.p.32 / Chapter 2.3 --- Identification of estrogenic activity in flavonoids --- p.p.33 / Chapter 2.3.1 --- Steady Glo Luciferase Assay --- p.p.33 / Chapter 2.3.2 --- The Biorad Protein Assay kit (a modified Bradford method). --- p.p.33 / Chapter 2.4 --- Viability Assay --- p.p.34 / Chapter 2.5 --- ERE Luciferase reporter gene assay --- p.p.35 / Chapter 2.5.1 --- Transient transfect ion of cell using lipofectamine PLUS reagent --- p.p.36 / Chapter 2.5.2 --- Dual Luciferase Assay --- p.p.37 / Chapter 2.6 --- ERα competitive binding ASSAY --- p.p.37 / Chapter 2.7 --- Apoptotic death assay --- p.p.38 / Chapter 2.8 --- Semi-quantitative RT-PCR Assay --- p.p.40 / Chapter 2.8.1 --- "Isolation of RNA using TRIzol® Reagent (Life Technology,USA) " --- p.p.40 / Chapter 2.8.2 --- Quantitation of RNA --- p.p.41 / Chapter 2.8.3 --- First strand cDNA synthesis --- p.p.41 / Chapter 2.8.4 --- PCR reactions --- p.p.43 / Chapter 2.9 --- Flow Cytometry Analysis --- p.p.43 / Chapter 2.10 --- Total triglyceride and cholesterol measurement --- p.p.44 / Chapter 2.10.1 --- Determination of the total cholesterol --- p.p.45 / Chapter 2.10.2 --- Determination of the total triglyceride --- p.p.46 / Chapter 2.11 --- Manipulation of DNA and RNA --- p.p.46 / Chapter 2.11.1 --- Transformation of DH5α --- p.p.46 / Chapter 2.11.2 --- Mini preparation of plasmid DNA --- p.p.47 / Chapter 2.11.3 --- Preparation of plasmid DNA using QIAGEN-tip 100 midi-prep kit --- p.p.48 / Chapter 2.11.4 --- Preparation of plasmid DNA using QIAGEN-tip 10000 Giga-prep kit --- p.p.49 / Chapter 2.11.5 --- Ethanol preparation of DNA and RNA --- p.p.50 / Chapter 2.11.6 --- Agarose gel electrophoresis of DNA --- p.p.51 / Chapter 2.12 --- Statistical methods --- p.p.52 / Chapter CHAPTER 3 --- Estrogenic and antiproliferative activities on MCF-7 breast cancer cells by flavonoids / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.p.53 / Chapter 3.2 --- Results --- p.p.56 / Screening of phytoestrogens for estrogenic activities on MELN cells --- p.p.56 / Cell proliferation activity of phytoestrogens on MCF-7 and MDA-MA231 cells --- p.p.59 / Estrogenic and antiestrogenic activity of phytoestrogens on ERα or erβ transfected hepg2 cells --- p.p.64 / Chapter 3.3 --- Discussion --- p.p.73 / Chapter Chapter 4 --- interaction of baicalein with estrogen receptors / Chapter 4.1 --- Introduction --- p.p.76 / Chapter 4.2 --- Results --- p.p.78 / Estrogen receptor competition assay --- p.p.78 / ERE-Luciferase gene reporter assay --- p.p.82 / Chapter 4.3 --- Discussion --- p.p.88 / Chapter Chapter 5 --- baicalein and genistein display differential actions on er transactivation / Chapter 5.1 --- Introduction --- p.p.90 / Chapter 5.2 --- Results --- p.p.92 / Estrogenic and antiestrogenic activities of genistein and baicalein on ER transactivation --- p.p.92 / Chapter 5.3 --- Discussion --- p.p.105 / Chapter CHAPTER 6 --- APOPTOTIC EFFECTS OF BAICALEIN ON MCF-7 AND MDA-MB-231 CELL LINES / Chapter 6.1 --- Introduction --- p.p.107 / Chapter 6.2 --- Results --- p.p.111 / ER POSITIVE MCF-7 AND ER NEGATIVE MDA-MB-231 cell death assay --- p.p.111 / "Bcl-2, Bax and PS2 mRNA expression " --- p.p.116 / Arrest at sub G1 phase of MCF-7 by baicalein --- p.p.124 / Chapter 6.3 --- Discussion --- p.p.127 / Chapter CHAPTER 7 --- BAICALEIN CAN REDUCE INTRACELLULAR cholesterol and triglceride / Chapter 5.1 --- Introduction --- p.p.129 / Chapter 5.2 --- Results --- p.p.130 / Baicalein has beneficial effect on lipid metabolism --- p.p.130 / Chapter 5.3 --- Discussion --- p.p.139 / Chapter chapter 8 --- Summary --- p.p.140 / BIBLIOGRAPHY --- p.p.142 / APPENDIX 1 ABBREVIATIONS --- p.p.153 / APPENDIX 2 PRIMER LISTS --- p.p.156 / APPENDIX 3 REAGENTS AND BUFFERS --- p.p.157

Diss. (sammanfattning) Linköping : Linköpings universitet, 2009. / Härtill 4 uppsatser.

Apesar dos avanços no tratamento dos diferentes subtipos moleculares do câncer de mama, diversos efeitos colaterais e resistência ao tratamento são observados. Nesse contexto, a busca por novos marcadores moleculares ainda é necessária. A família do coativador - 1 do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama-1 (PGC-1) exerce funções cruciais no metabolismo energético celular e alguns trabalhos na literatura mostram alterações de PGC-1 no desenvolvimento do câncer. Contudo, mecanismos envolvidos na proliferação celular do carcinoma de mama permanecem desconhecidos. O objetivo geral foi determinar os mecanismos pelos quais PGC-1 controla a proliferação de células tumorais de mama, com foco em vias metabólicas e de sinalização redox. Para alcançar os objetivos, foi determinada a expressão de PGC-1alfa e beta em células tumorais de mama dos subtipos moleculares luminal (MCF-7), HER2- superexpresso (SKBR3) e triplo negativo (MDAMB231) em relação a uma linhagem de mama não tumoral (MCF-10A). Foi encontrada maior expressão gênica e proteica de PGC-1beta na superexpressão de HER2, e maior taxa de crescimento para essa linhagem. Para investigar se PGC-1beta pode estar envolvido na proliferação dessas células, utilizamos sequências específicas de RNA de interferência para o knockdown de PGC-1beta nas células SKBR3. Após o tratamento houve diminuição de proliferação celular. Assim, investigamos os prováveis mecanismos pelos quais PGC-1beta diminui a proliferação celular. Nossos resultados mostram que o knockdown de PGC-1beta não influenciou a expressão de ciclinas (B, C, D e E) e não houve diferença na quantidade de DNA mitocondrial, fator de transcrição mitocondrial A (TFAM), fator de respiração nuclear (NRF) 1 e 2. Em seguida, mostramos que o knockdown de PGC-1beta diminuiu a produção de lactato intracelular e aumentou a atividade da enzima citrato sintase, e houve tendência a maior taxa de respiração celular. Detectamos maiores níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) após knockdown de PGC-1beta enquanto que a produção de nitrito e nitrato, não diferiu. Não houve alteração na atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, catalase e sistema glutationa. Os resultados revelam presença de despolarização mitocondrial quando PGC-1? é diminuído nas células HER2. Como os receptores relacionados a estrógeno (ERR) possuem conhecido papel na regulação do metabolismo energético, avaliamos se sua expressão é modulada por PGC-1?. A diminuição de PGC-1beta não influenciou a expressão gênica de ERRy e reduziu a expressão gênica de ERRalfa. Por fim, mostramos maior expressão de PGC-1beta proveniente de tumores de pacientes com câncer de mama HER2- superexpresso em relação aos diferentes subtipos moleculares. Conclui-se que a diminuição da sinalização por HER2/ PGC-1beta/ ERRalfa está envolvida com a diminuição da via glicolítica e aumento da via oxidativa com consequente aumento de EROs e perda do potencial de membrana mitocondrial, resultando em diminuição da proliferação celular. Espera-se que os resultados desse estudo ajudem na identificação de vias de sinalização importantes que controlam tanto o metabolismo energético quanto a proliferação de células tumorais, as quais poderão se tornar alvos terapêuticos no futuro / Despite a marked improvement in treatments for all breast cancer subtypes, several side-effects and resistance to therapy are noticed. In this context, the searching for new molecular targets for breast cancer treatment is still a challenge. Peroxisome proliferator-activated receptor- gamma coactivator 1 (PGC-1) is the main regulator of cell energy homeostasis and studies in the literature show alterations regarding PGC-1 in cancer development. However, mechanisms involved in cellular proliferation of breast cancer remain unknown. We aimed to determine the mechanisms by which PGC-1beta controls breast cancer cell proliferation, focusing on metabolic and redox signaling. To reach this goal, we determined PGC-1alfa and beta expression in breast cancer cell lines as luminal (MCF-7), HER2-overexpressed (SKBR3) and triple- negative (MDAMB231) as compared to a non-tumoral breast cell line (MCF-10A). We found increased gene and protein expression of PGC-1beta in HER2- overexpressed cells and increased cellular proliferation. To investigate whether PGC-1beta could be involved in the proliferation of those cells, we used specific sequences of silencing interfering RNA for knockdown of PGC-1beta in SKBR3 cells. After treatment we observed a decrease in cellular proliferation. Thus, we next investigated the probable mechanisms by which PGC-1beta could decrease cellular proliferation. Our results showed that knockdown of PGC-1beta did not influence on cyclin expression (B, C, D and E), mitochondrial DNA number, mitochondrial transcription factor - A (TFAM), nuclear receptor factor (NRF) 1 and 2 expression. We showed that knockdown of PGC-1beta induced a decrease intracellular lactate production, increase in citrate synthase activity and a trend to increase cellular respiration rate. Thereby, we detected greater amounts of reactive oxygen species (ROS) after knockdown of PGC-1beta, and no alterations was found for nitrite and nitrate levels. No alterations regarding antioxidant enzymes activities as superoxide dismutase, catalase, and glutathione system were found. Results revealed loss of mitochondrial membrane potential when PGC-1beta is decreased in HER2- overexpressed cells. As estrogen related receptors (ERR) have a recognized role in the regulation of energetic metabolism, we assessed whether their expression could be modulated by PGC-1beta. The decrease in PGC-1beta expression did not influence on ERRy expression, but it decreased the gene expression of ERRalfa. Finally, we demonstrated increased PGC-1beta expression in HER2- overexpressing tumors from breast cancer patients. Taken together, we conclude that decrease in HER2/ PGC-1beta/ ERRalfa signaling may be related to decrease in glycolytic pathway and increase in oxidative metabolism resulting in increased ROS production and loss of mitochondrial membrane potential, which can lead to decreased cellular proliferation. We hope that the findings may help in the identification of important cellular signaling that may control energetic metabolism regarding tumor cells proliferation, which can became future target therapies

A interação entre as vias de sinalização do ER, do IGF-I e da integrina 1 é essencial para a manutenção da homeostase da glândula mamária normal, e alterações nessas vias de sinalização estão associadas ao processo de tumorigênese da mama. Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar a influência e inter-relação entre as vias de sinalização do IGF-I, do ER e da integrina 1 na regulação da transcrição dos genes PHLDA1 e PAWR. Para isso, células MCF-7 foram tratadas, por diferentes tempos, com 10nM de 17- estradiol (E2), 12,5nM de IGF-I, 30M de LY294002 (inibidor da PI-3K), 30M de SB202190 (inibidor da p38MAPK) e 1M de ICI182780 (antagonista do ER), ou transfectadas com 40nM de siRNA para integrina 1. A expressão gênica foi avaliada por PCR em tempo real e a expressão protéica por Western Blot. A expressão do gene PHLDA1 aumentou após tratamento com E2 por 6h (p=0,05), e esse efeito foi inibido pelo tratamento com ICI (p<0,05). O tratamento com E2 por 24h inibiu a expressão do gene PAWR (p<0,05), e esse efeito foi dependente de ER, pois foi inibido pelo tratamento com ICI (p<0,05). O tratamento com IGF-I por 1,5h causou aumento na expressão do gene PHLDA1 (p<0,05); e o tratamento com IGF-I por 24h causou diminuição na expressão do gene PAWR (p<0,05). Foi observado aumento na expressão protéica de PHLDA1 após tratamento das MCF-7 com E2 ou IGF-I por 1:30h. A regulação da expressão do PAWR pelo IGF-I ocorreu através das vias da PI-3K e p38MAPK. O efeito do IGF-I sobre a expressão dos dois genes foi independente da ativação do ER, mas foi observado sinergismo entre E2 e IGFI na inibição da expressão dos transcritos do PAWR, com diminuição na expressão para nível menor do que o observado após tratamento com E2 ou IGF-I sozinhos (p<0,05). A repressão da expressão da integrina 1 resultou na diminuição dos níveis de expressão dos genes PHLDA1 e PAWR. Não foi observada interação entre o IGF-I e a integrina 1 na regulação dos genes PHLDA1 e PAWR. Portanto, o gene PHLDA1 é regulado positivamente pelo E2 e pelo IGF-I, mas não existe interação entre as vias. O gene PAWR é regulado negativamente pelo E2 e pelo IGF-I; o efeito do IGF-I é dependente da ativação da PI3-K e da p38MAPK, mas não do ER; e existe sinergismo entre E2 e IGF-I na regulação do PAWR / The interactions among ER, IGF-I and 1 integrin signaling pathways are essential for the maintenance of normal mammary gland homeostasis, and alterations in these pathways have been associated with mammary tumorigenesis. Therefore, the goal of this work was to investigate the influence and interaction among IGF-I, ER and 1 integrin signaling pathways on the regulation of PHLDA1 and PAWR transcription regulation. To accomplish that, MCF-7 cells were treated with 10nM 17-estradiol (E2), 12.5nM IGF-I, 30M LY294002 (a PI3-K inhibitor), 30M SB202190 (a p38MAPK inhibitor) and 1M ICI182,780 (ICI an ER antagonist), or transfected with 40nM siRNA aiming 1 integrin. Real time PCR and western blot were used to evaluate gene and protein expression, respectively. PHLDA1 mRNA expression increased after 6h of treatment with E2 (p=0.05), and this effect was inhibited by ICI (p<0.05). Treatment with E2 for 24h repressed PAWR gene expression (p<0.05) and this effect was dependent on ER, since treatment with ICI inhibited it (p<0.05). Treatment with IGF-I for 1.5h resulted in increased PHLDA1 gene expression (p<0,05) and also PHLDA1 protein expression; and treatment with IGF-I for 24h inhibited PAWR mRNA expression (p<0.05). IGF-I regulation of PAWR expression was dependent on PI3-K and p38MAPK activation. The regulation of both genes by IGF-I was independent of ER activation; however, IGF-I acted in synergism with E2 on PAWR expression resulting in lower PAWR expression than the observed after the treatments alone (p<0.05). Repression of 1 integrin expression resulted in downregulation of PHLDA1 and PAWR expression levels. No interaction was observed between IGF-I and 1 integrin on PHLDA1 and PAWR gene expression. In conclusion, PHLDA1 is positively regulated by E2 and IGF-I, but there is no interaction between them on PHLDA1 regulation. On the other hand, PAWR is negatively regulated by E2 and IGF-I; IGF-I effect is dependent on PI3-K and p38MAPK, but not on ER activation; E2 and IGF-I act synergistically on PAWR gene expression regulation

<p>Glavni problem u lečenju karcinoma dojke je kako na osnovu kliničke klasifikacije i morfolo&scaron;kih osobina tumora predvideti njegovo dalje pona&scaron;anje. Vrlo često ni kombinacija standardnih prognostičkih faktora ne daje odgovor o potrebi davanja adjuvantne hemioterapije. U cilju sprovođenja adekvatne dalje terapije karcinoma dojke i otkrivanja agresivnih tipova tumora, a nakon hirur&scaron;kog lečenja, postoji stalna potreba za pronalaženjem novih pokazatelja pomoću kojih bi se identifikovale bolesnice koje imaju povećan rizik od razvoja relapsa bolesti. Ciljevi ove studije su bili da se odredi učestalost ekspresije androgenih receptora (AR) u infiltrativnom duktalnom karcinomu dojke. Da se utvrdi povezanost ekspresije AR i kliničko-patolo&scaron;kih prognostičkih faktora u infiltrativnom duktalnom karcinomu dojke. Odnos ekspresije AR i ekspresije estrogen receptora (ER), progesteron receptora (PR) i humanog epidermalnog faktora rasta (HER-2). Da se proceni povezanosti pozitivne ekspresije AR, kao i odnosa AR/ER, sa odgovorom na primenjenu hormonsku terapiju kod ER pozitivnih bolesnica. Da se proceni povezanost ekspresije AR, kao i odnosa AR/ER, sa kliničkim tokom bolesti: pojavom recidiva, metastaza, kao i smrtnim ishodom u toku petogodi&scaron;njeg perioda praćenja pacijentkinja. Istraživanjem je obuhvaćeno oko 200 pacijentkinja obolelih od infiltrativnog duktalnog karcinoma dojke, koje su operisane na Institutu za onkologiju Vojvodine u periodu 2010-2012. godine. Pacijentkinje su odabrane metodom slučajnog izbora. Ne postoji statistički značajna razlika između kliničko patololo&scaron;kih faktora i ekspresije androgenih receptora. Kod pacijentkinja sa infiltrativnim duktalnih karcinomom dojke koje su ER-/AR+ nije pokazana statistički značajna razlika u HER2 proteinskoj ekspresiji. Učestalost receptora za progesteron, estrogen, HER2, Ki-67, tripl negativne ćelija ne karakteri&scaron;u prisustvo androgenskih receptora Nije dokazana statistička značajnost za prvi i drugi stadijum bolesti duktalnog invazivnog karcinoma dojke kada se uzme u obzir kraće vreme preživljavanja kod pacijentkinja koje su primale hormonoterapiju. Statistički značajno kraće vreme preživljavanja pokazano je za treći stadijum bolesti kod pacijentkinja koje su AR i ER (&ge; 2) u odnosu na pacijentkinje kod kojih je odnos AR/ER &lt; 2, čime je za treći stadijum bolesti dokazana inicijalna hipoteza . Analize u prikazanom istraživanju nisu pokazale statističku značajnost kada se porede učestalost relapsa i smrtnog ishoda kada se posmatraju pacijentkinje sa AR pozitivnim i AR negativnim infiltrativnim duktalnim karcinomom dojke. Pokazana je statistički značajna razlika u učestalosti smrtnog ishoda između pacijenatkinja koje su lečene i inhibitorima aromataze i tamoksifenom. Zaključci ove studije bi mogli biti osnova za preporuku da se utvrđivanje ekspresije AR kod karcinoma dojke uvrsti u rutinsku praksu i sadržaj patohistolo&scaron;kog nalaza. Određivanje odnosa ekspresije AR i ER u grupi ER pozitivnih bolesnica moglo bi poslužiti kao vodič za primenu konvencionalne hormonske terapije ili, s druge strane, preporuka za terapiju antiandrogenima, sa ciljem da se izborom novih terapijskih modaliteta pobolj&scaron;a efikasnost lečenja bolesnica sa karcinomom dojke.</p> / <p>The main problem in the treatment of breast cancer is how to predict its future behavior based on the clinical classification and morphological characteristics of the tumor. Very often even a combination of standard prognostic factors does not answer the need for adjuvant chemotherapy. In order to conduct adequate further breast cancer therapy and to detect aggressive tumor types, and following surgical treatment, there is a continuing need to find new indicators to identify patients at increased risk of relapse. The objectives of this study were to determine the frequency of androgen receptor (AR) expression in infiltrative ductal breast cancer. To determine the association between AR expression and clinical-pathological prognostic factors in infiltrative ductal breast cancer. Relationship between AR expression and expression of estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), and human epidermal growth factor (HER-2). To evaluate the association of positive AR expression, as well as the AR / ER ratio, with response to hormone therapy in ER positive patients. To evaluate the association of AR expression, as well as the relationship of AR / ER, with the clinical course of the disease: onset of relapse, metastasis, as well as fatal outcome during the 5-year follow-up period. The study included about 200 patients suffering from infiltrative ductal breast cancer, operated on at the Institute of Oncology of Vojvodina in the period 2010-2012. years. Patients were selected by random selection. The results there is no statistically significant difference between clinically pathologic factors and androgen receptor expression. No statistically significant difference in HER2 protein expression was shown in patients with infiltrative ductal breast cancer who are ER- / AR +. The frequency of progesterone receptors, estrogen, HER2, Ki-67, tripl negative cells do not characterize the presence of androgen receptors. No statistical significance was demonstrated for the first and second stages of ductal invasive breast cancer when considering shorter survival times in patients receiving hormone therapy. A statistically significant shorter survival time was shown for the third stage of disease in patients with AR and ER (&ge; 2) compared to patients with an AR / ER ratio of &lt;2, thus proving an initial hypothesis for the third stage of disease. The analyzes in the study presented showed no statistical significance when comparing the incidence of relapse and death when looking at patients with AR positive and AR negative infiltrative ductal breast cancer. There was a statistically significant difference in the incidence of death between patients treated with both aromatase inhibitors and tamoxifen. Conclusions of this study could be the basis for recommending that the determination of AR expression in breast cancer be incorporated into the routine practice and content of pathohistological findings. Determining the ratio of AR and ER expression in a group of ER-positive patients could serve as a guide for the administration of conventional hormone therapy or, on the other hand, a recommendation for anti-androgen therapy, with the aim of improving the effectiveness of breast cancer treatment in the choice of new therapeutic modalities.</p>

Introdução: Receptores hormonais modulam a resposta dos tecidos ao estímulo humoral. Evidências epidemiológicas mostram que as variações dos genes que regulam a biossíntese e metabolização dos receptores estrogênicos (RE) causam alterações no efeito dos estrógenos no tecido mamário, podendo explicar as variações individuais da densidade mamográfica. A alta densidade mamográfica é um fator de risco importante para o câncer de mama.Objetivo: Avaliar a associação das características clínicas e dos polimorfismos do gene do REalfa (XBal, Pvull e (GT)n) com a densidade mamográfica em mulheres após a menopausa. Casuística e métodos: Avaliaram-se prospectivamente 463 mulheres após a menopausa, sendo que 308 mulheres com mamas densas e 155 com mamas não densas, segundo os critérios do ACR-BIRADS (2003) por avaliação objetiva computadorizada, com idade de 45 a 60 anos, não usuárias de terapia hormonal nos últimos 12 meses e sem antecedentes pessoais de câncer de mama. Amostras de sangue periférico foram obtidas para extração de DNA e análise dos polimorfismos presente no íntron 1 e região promotora (Xbal, Pvull e (GT)n) do gene do RE?. Resutados: Dos fatores considerados de risco para o câncer de mama, houve associação com a densidade mamográfica: idade (p=0,005); medida da cintura abdominal (p=0,001); número de gravidezes (p=0,007); idade ao ter o 1º filho (p=0,035); antecedentes familiares (p=0,035); tempo decorrido deste a data da última menstruação (p=0,007) e índice de massa corpórea (p=0,022). Foi verificada diferença significante entre os grupos de mama densa e não densa para distribuição do genótipo do polimorfismo Pvull (p=0,024). Xbal (p=0,362) e, para o polimorfismo de repetição (GT)n (p=0,151) a associação não foi significante. Conclusão: Apenas o polimorfismo Pvull e os fatores clínicos: idade, cintura abdominal, número de gravidezes, idade ao ter o primeiro filho, antecedentes familiares de câncer de mama, tempo decorrido desde a data da última menstruação e o índice de massa corpórea mostraram-se associados com a densidade mamográfica após a menopausa / Introduction: The hormone receptors modulate the tissue response to hormonal stimulation. Epidemiological evidences show that the variations in genes that regulate the biosynthesis and metabolism of estrogen receptors (ER) cause changes in the effect of estrogen in breast tissue, which may explain individual variations of the mammographic density. High mammographic density is an important risk factor for the breast cancer. Objective: Evaluating the association of clinical characteristics and polymorphisms of the gene ERalfa [XbaI, PvuII and (GT)n] and mammographic density in postmenopausal women. Methods: It was prospectively evaluated 463 postmenopausal women - 308 women with high mammographic density (HMD) and 155 controls (to 50% density or less), according to the criteria of the ACR - BIRADS (2003 ) computed objective assessment , aged 45 to 60 , nonusers of hormone therapy in the past 12 months and with no personal history of breast cancer. Peripheral blood samples were obtained for DNA extraction and analysis of this polymorphism in intron 1 and promoter [XbaI, PvuII and (GT) n)] of the ERalfa gene region. Results: Among the risk factors for breast cancer there was an association with mammographic density: age (p = 0.005), waist circumference (p = 0.001), number of pregnancies (p = 0.007), age of first birth ( p = 0.035 ), family history (p = 0.035), time after menopause (p = 0.007 ) and body mass index (p = 0.022). Significant difference was observed between the groups of HMD and control only for the distribution of the polymorphism PvuII (p = 0.024 ). XbaI (p = 0.362 ) and for repeat polymorphism (GT) n (p = 0.151) the association was not significant. Conclusion: Only the PvuII polymorphism and clinical factors: age, waist circumference, number of pregnancies, age of first birth, family history of breast cancer, time after menopause and body mass index proved to be associated with high mammographic density after menopause

A idade normal para início da puberdade em meninas varia bastante, de 8 a 13 anos, e os genes envolvidos nesse controle são parcialmente conhecidos. Fatores ambientais, como alimentação e exposição a disruptores endócrinos, contribuem para essa variabilidade, de modo que genes modulados epigeneticamente podem justificar parte da complexidade desse processo. O termo epigenética se refere às modificações na expressão gênica que não são causadas por alterações na sequência do DNA. A metilação do DNA é o mecanismo epigenético mais bem estudado. Na última década surgiram evidências demonstrando a relação entre metilação do DNA e desenvolvimento puberal. Em fêmeas de roedores, a hipermetilação do DNA levou à puberdade precoce. Em humanos, a puberdade precoce central (PPC) familial causada por mutações nos genes MKRN3 e DLK1 é considerada um defeito do imprinting, fenômeno epigenético no qual apenas um dos alelos parentais é expresso, estando o outro metilado e inativo. Além disso, um conceito atual propõe que o início da puberdade requer a repressão epigenética de fatores inibidores do eixo gonadotrófico. Recentemente, genes zinc finger (ZNF) foram relacionados ao processo puberal, e muitos deles codificam repressores transcricionais. Neste trabalho, estudamos a metilação do DNA do sangue periférico de 10 pacientes do sexo feminino com PPC familial (casos índices) e 33 meninas com desenvolvimento puberal normal (15 pré-púberes e 18 púberes), usando a plataforma Human Methylation 450 BeadChip. Duas pacientes tinham PPC de causa genética (uma com mutação no MKRN3 e outra com deleção no DLK1) e oito tinham PPC idiopática, sem mutações identificadas pelo sequenciamento exômico global. Cento e vinte regiões diferencialmente metiladas foram identificadas entre as meninas saudáveis pré-púberes e púberes, estando 74% delas no cromossomo X. Apenas uma região mostrou-se hipometilada no grupo púbere e, de maneira importante, contém a região promotora do ZFP57, fator necessário para manutenção do imprinting. Uma vez que a hipermetilação nas regiões promotoras dos genes é relacionada à inibição transcricional, o achado de hipermetilação global do DNA na puberdade sugere que haja inibição de fatores inibidores do eixo gonadotrófico, o que resultaria no início do processo puberal. O receptor estrogênico destacou-se como um fator transcricional que se liga a sete genes diferencialmente metilados entre os controles pré-púberes e púberes. As pacientes com PPC apresentaram mais sítios CpG hipermetilados tanto na comparação com as meninas pré-púberes (81%) quanto púberes (89%). Há doze genes ZNF contendo sítios CpG hipermetilados na PPC. Não foram encontradas anormalidades de metilação nos genes MKRN3 e DLK1 nem em suas regiões regulatórias. Em conclusão, este estudo evidenciou hipermetilação global do DNA em meninas com puberdade normal e precoce, sugerindo que esse padrão é uma marca epigenética da puberdade. Pela primeira vez, mudanças no metiloma de pacientes com PPC foram descritas. Modificações na metilação de vários genes ZNF parecem compor a complexa rede de mecanismos que leva ao início da puberdade humana / Normal puberty initiation varies greatly among girls, from 8 to 13 years, and the genetic basis for its control is partially known. Environmental factors, such as nutrition and exposure to endocrine disruptors, contribute to this variance, and epigenetically modulated genes may justify some of the complexity observed in this process. Epigenetics refers to alterations in gene expression that are not caused by changes in DNA sequence itself. DNA methylation is the best studied epigenetic mechanism. In the last decade, evidence has emerged showing the relationship between DNA methylation and pubertal development. In female mice, DNA hypermethylation led to precocious puberty. In humans, familial central precocious puberty (CPP) caused by mutations in the MKRN3 and DLK1 genes is considered a disorder of imprinting, an epigenetic phenomenon in which only one parental allele is expressed, and the other allele is methylated and inactive. In addition, animal studies indicated that pubertal timing requires epigenetic repression of inhibitory factors of the gonadotrophic axis. Recently, zinc finger genes (ZNF) were related to pubertal development, many of which encode transcriptional repressors. In the present study, we analyzed the DNA methylation of peripheral blood samples from 10 female patients with familial CPP (index cases) and 33 girls with normal pubertal development (15 pre-pubertal and 18 pubertal), using the Human Methylation 450 BeadChip assay. Genetic CPP was diagnosed in two patients (one with a MKRN3 mutation and the other with a DLK1 deletion). The remaining eight cases with idiopathic CPP were previously evaluated by whole exome sequencing and no causative mutations were identified so far. We evidenced 120 differentially methylated regions between pre-pubertal and pubertal healthy girls, and 74% of them were located at the X chromosome. Only one genomic region was hypomethylated in the pubertal group. Of note, it contains the promoter region of ZFP57, an important factor for imprinting maintenance. As DNA hypermethylation in gene promoters is related to gene silencing, the finding of global DNA hypermethylation in puberty suggests inhibition of inhibitory factors of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis that results in puberty onset. Importantly, the estrogen receptor was identified as a transcriptional factor that binds to seven differentially methylated genes associated with pubertal process. Patients with CPP exhibited more hypermethylated CpG sites compared to both pre-pubertal (81%) and pubertal (89%) controls. Twelve ZNF genes were recognized as having hypermethylated CpG sites in CPP. The methylation analyses of MKRN3 and DLK1 genes showed no abnormalities. In conclusion, this study revealed a widespread DNA hypermethylation in girls with normal and precocious puberty, suggesting that this pattern can be an epigenetic signature of puberty. For the first time, changes in the methylome of patients with CPP were described. We highlight that alterations in methylation levels of several ZNF genes may impact the onset of human puberty