Nesta dissertação consideramos um o modelo para um gene como sendo um sistema de dois estados, tipo spin, e apresentamos um modelo estocástico para a expressão gênica. As soluções estacionárias e, também, as dependentes do tempo, para o processo de transcrição, são obtidas e as distribuições de probabilidade, que descrevem o estado funcional do gene, são calculadas analiticamente. O valor médio e o ruído transcricional na população de mRNA são analisados. O efeito do ruído transcricional na síntese proteica é contemplado acoplando-se os processo de transcrição e tradução. / In this dissertation we present a two state stochastic model, spin-like, for gene expression. The steady-state solutions and also the time-dependente solutions for the transcription are probed and the probability distribution functions, which describe the functional state of the gene, are exactly calculated. The mean value and the transcriptional noise in the mRNA population are analyzed. The effects of the transcriptional noise in the protein synthesis are contemplated by coupling the transcription and the translation.

Nesta tese desenvolvemos um modelo estocástico para a transcrição do gene even-skipped de Drosophila melanogaster no qual a variável estocástica é o número de moléculas de mRNA transcritas. Nesse modelo, consideramos um gene com dois níveis de ativação sendo regulado externamente. As probabilidades de se encontrar o gene ligado ou desligado e com determinado número de moléculas de mRNA transcritas obedecem equações lineares dadas por processos markovianos de nascimento-e-morte (taxas de produção e degradação) e termos de chaveamento entre os níveis cujas dependências temporais são dadas por funções de Heaviside. Notamos que tal dependência é suficiente para garantir uma atividade transcricional inicial intensa seguida de uma súbita interrupção, conforme sugerem os dados experimentais. Desconsiderando efeitos difusivos e fenômenos de transporte, estendemos esse constructo às outras regiões do embrião, permitindo dependências espaciais apenas às termos de chaveamento, e o resultado gerado descreve os dados experimentais com boa concordância, indicando também que o aspecto binário do gene é suficiente para uma descrição semiquantitativa do fenômeno. Notavelmente, na região onde a listra se forma e concomitantemente a sua formação, o modelo prevê a redução do desvio quadrático (flutuação) e do ruído. Calculando a distribuição de probabilidade, verificamos que o regime estacionário é atingido antes da listra começar a desaparecer. Também estudamos uma conexão entre parâmetros do modelo e as proteínas envolvidas na regulação e, baseado em resultados da literatura, obtemos uma função com aproximadamente o mesmo efeito regulatório considerando gradientes de seis fatores de transcrição (Bcd, Hb, Gt, Kr, Kni e Tll) e apenas quatro sítios de ligação, o que sugere que a informação transcricional pode estar concentrada na regulação de poucos sítios. / In this thesis we develop a stochastic model to transcription of Drosophila melanogaster even-skipped gene in which the stochastic variable is the number of mRNA molecules transcribed. In this model we considered a gene with two activation levels being regulated externally. The probabilities of gene being on or off when there is a certain number of transcripts obey linear equations given by Markovian birth-and-death processes (production and degradation rates) and terms of switch between levels whose time-dependence is given by Heaviside functions. We note that is sufficient to ensure a strong transcriptional activity followed by a sudden disruption, as suggested by the experimental data. Disregarding diffusion effects and transport phenomena, we extend this construct to the others regions ot the embryo, allowing space-dependence only to terms of switch, and the results describe the experimental data with good agreement, indicating also that binary character of gene is sufficient to a semiquantitative description of the phenomenon. Notably, in the region where the stripe 2 is formed and simultaneously with its formation, the model predicts the reduction in standard deviation (fluctuation) and noise. By calculating the probability distribution, we find that stationary state is reached before stripe 2 starts to fade. We also study a connection between the parameters of the model and proteins involved in regulation and, based on results from the literature, we obtain a function with approximately the same regulatory effect considering six transcription factors (Bcd, Hb, Gt, Kr, Kni e Tll) and only four binding sites, suggesting that transcriptional information may be concentrated in regulation of few sites.

Nesta tese desenvolvemos um modelo estocástico para a transcrição do gene even-skipped de Drosophila melanogaster no qual a variável estocástica é o número de moléculas de mRNA transcritas. Nesse modelo, consideramos um gene com dois níveis de ativação sendo regulado externamente. As probabilidades de se encontrar o gene ligado ou desligado e com determinado número de moléculas de mRNA transcritas obedecem equações lineares dadas por processos markovianos de nascimento-e-morte (taxas de produção e degradação) e termos de chaveamento entre os níveis cujas dependências temporais são dadas por funções de Heaviside. Notamos que tal dependência é suficiente para garantir uma atividade transcricional inicial intensa seguida de uma súbita interrupção, conforme sugerem os dados experimentais. Desconsiderando efeitos difusivos e fenômenos de transporte, estendemos esse constructo às outras regiões do embrião, permitindo dependências espaciais apenas às termos de chaveamento, e o resultado gerado descreve os dados experimentais com boa concordância, indicando também que o aspecto binário do gene é suficiente para uma descrição semiquantitativa do fenômeno. Notavelmente, na região onde a listra se forma e concomitantemente a sua formação, o modelo prevê a redução do desvio quadrático (flutuação) e do ruído. Calculando a distribuição de probabilidade, verificamos que o regime estacionário é atingido antes da listra começar a desaparecer. Também estudamos uma conexão entre parâmetros do modelo e as proteínas envolvidas na regulação e, baseado em resultados da literatura, obtemos uma função com aproximadamente o mesmo efeito regulatório considerando gradientes de seis fatores de transcrição (Bcd, Hb, Gt, Kr, Kni e Tll) e apenas quatro sítios de ligação, o que sugere que a informação transcricional pode estar concentrada na regulação de poucos sítios. / In this thesis we develop a stochastic model to transcription of Drosophila melanogaster even-skipped gene in which the stochastic variable is the number of mRNA molecules transcribed. In this model we considered a gene with two activation levels being regulated externally. The probabilities of gene being on or off when there is a certain number of transcripts obey linear equations given by Markovian birth-and-death processes (production and degradation rates) and terms of switch between levels whose time-dependence is given by Heaviside functions. We note that is sufficient to ensure a strong transcriptional activity followed by a sudden disruption, as suggested by the experimental data. Disregarding diffusion effects and transport phenomena, we extend this construct to the others regions ot the embryo, allowing space-dependence only to terms of switch, and the results describe the experimental data with good agreement, indicating also that binary character of gene is sufficient to a semiquantitative description of the phenomenon. Notably, in the region where the stripe 2 is formed and simultaneously with its formation, the model predicts the reduction in standard deviation (fluctuation) and noise. By calculating the probability distribution, we find that stationary state is reached before stripe 2 starts to fade. We also study a connection between the parameters of the model and proteins involved in regulation and, based on results from the literature, we obtain a function with approximately the same regulatory effect considering six transcription factors (Bcd, Hb, Gt, Kr, Kni e Tll) and only four binding sites, suggesting that transcriptional information may be concentrated in regulation of few sites.

Nesta dissertação consideramos um o modelo para um gene como sendo um sistema de dois estados, tipo spin, e apresentamos um modelo estocástico para a expressão gênica. As soluções estacionárias e, também, as dependentes do tempo, para o processo de transcrição, são obtidas e as distribuições de probabilidade, que descrevem o estado funcional do gene, são calculadas analiticamente. O valor médio e o ruído transcricional na população de mRNA são analisados. O efeito do ruído transcricional na síntese proteica é contemplado acoplando-se os processo de transcrição e tradução. / In this dissertation we present a two state stochastic model, spin-like, for gene expression. The steady-state solutions and also the time-dependente solutions for the transcription are probed and the probability distribution functions, which describe the functional state of the gene, are exactly calculated. The mean value and the transcriptional noise in the mRNA population are analyzed. The effects of the transcriptional noise in the protein synthesis are contemplated by coupling the transcription and the translation.

A fim de contornar a problemática imposta pela recalcitrância da parede celular à hidrólise, o processo de produção de etanol a partir de biomassa vegetal requer um passo denominado de pré-tratamento, que consiste em tornar a biomassa mais acessível à ação de glicosil hidrolases que atacam a parede celular. O melhor conhecimento de processos de degradação de parede operados pela própria planta tem o potencial de direcionar as pesquisas em bioernegia, indicando quais os mecanismos mais eficientes para desmontar o complexo de polímeros da parede celular. Cunhado pré-tratamento biológico, este consiste na hidrólise de polissacarídeos estruturais empregando mecanismos e elementos chave de processos de degradação de parede celular que ocorrem na própria planta. Um exemplo de evento com esta característica é a formação de aerênquima lisígeno, que consiste na abertura de espaços de gás em tecidos parenquimáticos. A formação do aerênquima em cana-de-açúcar se dá de forma modular, sendo o processo constituído por seis etapas: 1) percepção do sinal inicial; 2) separação celular: 3) expansão celular; 4) morte celular programada; 5) hidrólise de hemiceluloses e 6) hidrólise de celulose. O presente trabalho teve como principal foco estudar a regulação das duas etapas iniciais, visando obter conhecimentos que possibilitem para tornar a biomassa de cana de açúcar menos resistente à penetração de enzimas. O aerênquima ocorre na raiz de cana-de-açúcar por um processo constitutivo. Sua independência de um indutor externo foi corroborada mediante tratamento com nutrientes e inibidor da percepção por etileno (1-MCP) pela análise dos cinco centímetros mais apicais da raiz. O atraso na formação do aerênquima após tratamento com nutrientes levou à expressão diferencial de genes relacionados à degradação de parede celular, morte celular programada e sinalização por etileno. Por outro lado, o 1-MCP não afetou visivelmente a formação do aerênquima, porém alterou o balanço hormonal na raiz. O padrão transcricional das raízes tratadas com 1-MCP revelou aumento da expressão de genes relacionados à expansão celular e estresse oxidativo. Tais padrões são discutidos à luz da regulação hormonal da formação do aerênquima através do estabelecimento de um balanço hormonal definido entre auxina e etileno. Ambos os experimentos levaram à seleção de quatro genes candidatos: dois fatores de transcrição (ScRAV1 e ScERF1) e duas glicosil hidrolases (ScEPG1 e ScARA1), sequenciados e analisados quanto à diversidade hom(e)óloga, sequências promotoras e estrutura gênica em comparação a S. bicolor. A topologia das reconstruções filogenéticas e a distribuição diferencial de sítios para RAV e ERF nos promotores de ScEPG1 e ScARA1 não parece refletir padrões de expressão distintos, visto que os diferentes hom(e)ólogos demonstraram ser igualmente expressos. Em sistema heterólogo, o fator de transcrição RAV apresentou atividade repressora sobre o promotor de ScEPG1. Tal papel de RAV sugere regulação negativa sobre a degradação da lamela média e sobre o processo de perda de adesão e separação celular. A identificação de reguladores-chave da formação do aerênquima consiste em importante elo entre a sinalização hormonal e a degradação de parede celular, possibilitando a melhor compreensão dos mecanismos de controle da degradação endógena de parede celular. Os dados produzidos possibilitam a aplicação biotecnológica dos genes sequenciados, além de consistirem em significativo avanço no conhecimento sobre a fisiologia do processo estudado e na dinâmica da regulação da expressão gênica acoplada a aspectos filogenéticos das sequências alvo. / In order to circumvent the problems imposed by the cell wall recalcitrance to hydrolysis, the process underlying biofuel production requires a step called pretreatment, aimed at making biomass more accessible to the action of glycosil hydrolases that attack the cell wall. The increased knowledge of wall degradation processes operated by the plant itself has the potential to influence research in the bioernergy field, pointing out the most efficient mechanisms to disassemble the cell wall complex polymeric structure. The term coined biological pretreatment means taking advantage of key elements and mechanisms of cell wall degradation processes occurring in the plant itself in order to disassemble the entangled polysaccharide structure. One example of endogenous cell wall degradation process is the lysigenous aerenchyma formation, which consists in the opening of gas spaces in parenchyma tissue. The aerenchyma formation in sugarcane is thought to be a modular process that occurs in six steps: 1) target cells perception; 2) cell separation; 3) cell expansion; 4) programmed cell death; 5) hemicellulose hydrolysis and 6) cellulose hydrolysis. This work has as the main objective to study the regulation of the two initial steps, aiming at acquiring knowledge that would afford to turn biomass less resistant to enzyme penetration. The aerenchyma develops within the roots of sugarcane as a constitutive process. Its independence from an external inducer was corroborated in this work by subjecting sugarcane plants to treatment with nutrients and one inhibitor of ethylene perception (1-MCP) when the five more apical centimeters of the root were analyzed. After treatment with nutrients, the delayed aerenchyma formation led to differential expression of cell wall degradation-, programmed cell death- and ethylene signalling-related genes. Under visual inspection, 1-MCP did not show effect on aerenchyma development. Instead, it changed the hormone balance mainly in the two most apical root segments. The transcriptional pattern of 1-MCP treated roots revealed increased expression of cell expansion- and oxidative stress-related genes. Such patterns are discussed in the light of the hormone regulation of the aerenchyma development through the establishment of a balance between auxin and ethylene within root segments. Both experiments led to the selection of four two candidate genes, two transcription factors (ScRAV1 and ScERF1) and two glycosil hydrolases (ScEPG1 and ScARA1), that were sequenced and analyzed regarding homEURologous diversity, promoter sequences and gene structure compared to S. bicolor. The topology of the phylogenetic reconstructions and the differential distribution of sites for RAV and ERF within ScEPG1 and ScARA1 promoters did not reflect distinct expression patterns. Different hom(e)ologous of each target gene were equally expressed. In an heterologous system, RAV transcription factor interacted with ScEPG1 promoter, reducing the activity encoded by the reporter gene. This suggests the repressive role of RAV on pectin degradation within the middle lamella, leading to reduced cell adhesion and cell separation, possibly regulated by this glycosyl hydrolase. The identification of key regulators of the aerenchyma formation is an important link between hormone signaling and the wall degradation within the sugarcane roots. It enables a better understanding of control mechanisms underlying wall modifications when performed by the plant itself. Altogether, the data produced in this work allows biotechnological application of sequenced genes. Moreover, the produced data unveil key aspects regarding physiologycal aspects of aerenchyma development and highlights features related to the dynamics of gene expression in sugarcane coupled to the phylogenetic aspects of the four target sequences.

Nesta tese propomos um modelo estocástico multimodal para regulação da expressão gênica em nível de transcrição. A definição de um espaço de parâmetros que contém o conteúdo biológico do sistema aliada à escolha apropriada de uma base para construir a matriz de acoplamento entre os estados do sistema levaram à obtenção de soluções exatas do modelo. Tais soluções são obtidas transformando as equações mestras em equações diferenciais parciais usando a técnica das funções geradoras e escrevendo os coeficientes das equações parciais em termos dos parâmetros biológicos do modelo. No regime estacionário obtivemos uma relação de recorrência para os coeficientes das séries de potências que definem as funções geradoras e a especificação das configurações de equilíbrio do sistema permite que estas séries sejam calculadas exatamente. Com as soluções exatas calculadas não só as distribuições de probabilidade foram obtidas como os momentos das distribuições. As distribuições de probabilidade de equilíbrio apresentam estruturas multimodais com vários picos e a análise do ruído (flutuação) mostra que a existência de um estado intermediário de eficiência transcricional leva a redução do ruído global do sistema. A inspeção dos autovalores da matriz de acoplamento mostrou que existem regiões onde a dinâmica dos momentos é de caráter oscilatória com amortecimento. Diferentes esquemas de acoplamento levam à diferentes regimes transientes, tal característica revela que o sistema multimodal apresentam maior flexibilidade adaptativa quando comparado com sistemas de um ou dois estados. / In this thesis we propose a stochastic model for multimodal regulation of gene expression at the transcriptional level. The definition of a parameter space that contains the contents of the biological system coupled with the appropriate choice of a base to build the coupling matrix between the states of the system led to the exact solutions of the model. Such solutions are obtained by transforming master equations in partial differential equations using the technique of generating functions and writing the coefficients of partial equations in terms of biological parameters of the model. In the steady a recurrence relation for the coefficients of power series defining the generating functions was obtained and specification of the equilibrium configurations of the system allows the exact calculation of these series. With the exact solutions calculated not only the probability distributions were obtained but also the moments of the distributions. The equilibrium distributions probability is multimodal and presents several peaks. Analysis of the noise (fluctuation) shows that the existence of an state with intermediate transcriptional efficiency leads to a reduction of the overall system noise. Inspection of the eigenvalues of the coupling matrix showed that there are regions where the dynamics of the moments is damped oscillating. Different coupling schemes lead to different transient regimes, this feature reveals that the multimodal system have greater adaptive flexibility when compared to systems of one or two states.

Nesta tese propomos um modelo estocástico multimodal para regulação da expressão gênica em nível de transcrição. A definição de um espaço de parâmetros que contém o conteúdo biológico do sistema aliada à escolha apropriada de uma base para construir a matriz de acoplamento entre os estados do sistema levaram à obtenção de soluções exatas do modelo. Tais soluções são obtidas transformando as equações mestras em equações diferenciais parciais usando a técnica das funções geradoras e escrevendo os coeficientes das equações parciais em termos dos parâmetros biológicos do modelo. No regime estacionário obtivemos uma relação de recorrência para os coeficientes das séries de potências que definem as funções geradoras e a especificação das configurações de equilíbrio do sistema permite que estas séries sejam calculadas exatamente. Com as soluções exatas calculadas não só as distribuições de probabilidade foram obtidas como os momentos das distribuições. As distribuições de probabilidade de equilíbrio apresentam estruturas multimodais com vários picos e a análise do ruído (flutuação) mostra que a existência de um estado intermediário de eficiência transcricional leva a redução do ruído global do sistema. A inspeção dos autovalores da matriz de acoplamento mostrou que existem regiões onde a dinâmica dos momentos é de caráter oscilatória com amortecimento. Diferentes esquemas de acoplamento levam à diferentes regimes transientes, tal característica revela que o sistema multimodal apresentam maior flexibilidade adaptativa quando comparado com sistemas de um ou dois estados. / In this thesis we propose a stochastic model for multimodal regulation of gene expression at the transcriptional level. The definition of a parameter space that contains the contents of the biological system coupled with the appropriate choice of a base to build the coupling matrix between the states of the system led to the exact solutions of the model. Such solutions are obtained by transforming master equations in partial differential equations using the technique of generating functions and writing the coefficients of partial equations in terms of biological parameters of the model. In the steady a recurrence relation for the coefficients of power series defining the generating functions was obtained and specification of the equilibrium configurations of the system allows the exact calculation of these series. With the exact solutions calculated not only the probability distributions were obtained but also the moments of the distributions. The equilibrium distributions probability is multimodal and presents several peaks. Analysis of the noise (fluctuation) shows that the existence of an state with intermediate transcriptional efficiency leads to a reduction of the overall system noise. Inspection of the eigenvalues of the coupling matrix showed that there are regions where the dynamics of the moments is damped oscillating. Different coupling schemes lead to different transient regimes, this feature reveals that the multimodal system have greater adaptive flexibility when compared to systems of one or two states.

A fim de contornar a problemática imposta pela recalcitrância da parede celular à hidrólise, o processo de produção de etanol a partir de biomassa vegetal requer um passo denominado de pré-tratamento, que consiste em tornar a biomassa mais acessível à ação de glicosil hidrolases que atacam a parede celular. O melhor conhecimento de processos de degradação de parede operados pela própria planta tem o potencial de direcionar as pesquisas em bioernegia, indicando quais os mecanismos mais eficientes para desmontar o complexo de polímeros da parede celular. Cunhado pré-tratamento biológico, este consiste na hidrólise de polissacarídeos estruturais empregando mecanismos e elementos chave de processos de degradação de parede celular que ocorrem na própria planta. Um exemplo de evento com esta característica é a formação de aerênquima lisígeno, que consiste na abertura de espaços de gás em tecidos parenquimáticos. A formação do aerênquima em cana-de-açúcar se dá de forma modular, sendo o processo constituído por seis etapas: 1) percepção do sinal inicial; 2) separação celular: 3) expansão celular; 4) morte celular programada; 5) hidrólise de hemiceluloses e 6) hidrólise de celulose. O presente trabalho teve como principal foco estudar a regulação das duas etapas iniciais, visando obter conhecimentos que possibilitem para tornar a biomassa de cana de açúcar menos resistente à penetração de enzimas. O aerênquima ocorre na raiz de cana-de-açúcar por um processo constitutivo. Sua independência de um indutor externo foi corroborada mediante tratamento com nutrientes e inibidor da percepção por etileno (1-MCP) pela análise dos cinco centímetros mais apicais da raiz. O atraso na formação do aerênquima após tratamento com nutrientes levou à expressão diferencial de genes relacionados à degradação de parede celular, morte celular programada e sinalização por etileno. Por outro lado, o 1-MCP não afetou visivelmente a formação do aerênquima, porém alterou o balanço hormonal na raiz. O padrão transcricional das raízes tratadas com 1-MCP revelou aumento da expressão de genes relacionados à expansão celular e estresse oxidativo. Tais padrões são discutidos à luz da regulação hormonal da formação do aerênquima através do estabelecimento de um balanço hormonal definido entre auxina e etileno. Ambos os experimentos levaram à seleção de quatro genes candidatos: dois fatores de transcrição (ScRAV1 e ScERF1) e duas glicosil hidrolases (ScEPG1 e ScARA1), sequenciados e analisados quanto à diversidade hom(e)óloga, sequências promotoras e estrutura gênica em comparação a S. bicolor. A topologia das reconstruções filogenéticas e a distribuição diferencial de sítios para RAV e ERF nos promotores de ScEPG1 e ScARA1 não parece refletir padrões de expressão distintos, visto que os diferentes hom(e)ólogos demonstraram ser igualmente expressos. Em sistema heterólogo, o fator de transcrição RAV apresentou atividade repressora sobre o promotor de ScEPG1. Tal papel de RAV sugere regulação negativa sobre a degradação da lamela média e sobre o processo de perda de adesão e separação celular. A identificação de reguladores-chave da formação do aerênquima consiste em importante elo entre a sinalização hormonal e a degradação de parede celular, possibilitando a melhor compreensão dos mecanismos de controle da degradação endógena de parede celular. Os dados produzidos possibilitam a aplicação biotecnológica dos genes sequenciados, além de consistirem em significativo avanço no conhecimento sobre a fisiologia do processo estudado e na dinâmica da regulação da expressão gênica acoplada a aspectos filogenéticos das sequências alvo. / In order to circumvent the problems imposed by the cell wall recalcitrance to hydrolysis, the process underlying biofuel production requires a step called pretreatment, aimed at making biomass more accessible to the action of glycosil hydrolases that attack the cell wall. The increased knowledge of wall degradation processes operated by the plant itself has the potential to influence research in the bioernergy field, pointing out the most efficient mechanisms to disassemble the cell wall complex polymeric structure. The term coined biological pretreatment means taking advantage of key elements and mechanisms of cell wall degradation processes occurring in the plant itself in order to disassemble the entangled polysaccharide structure. One example of endogenous cell wall degradation process is the lysigenous aerenchyma formation, which consists in the opening of gas spaces in parenchyma tissue. The aerenchyma formation in sugarcane is thought to be a modular process that occurs in six steps: 1) target cells perception; 2) cell separation; 3) cell expansion; 4) programmed cell death; 5) hemicellulose hydrolysis and 6) cellulose hydrolysis. This work has as the main objective to study the regulation of the two initial steps, aiming at acquiring knowledge that would afford to turn biomass less resistant to enzyme penetration. The aerenchyma develops within the roots of sugarcane as a constitutive process. Its independence from an external inducer was corroborated in this work by subjecting sugarcane plants to treatment with nutrients and one inhibitor of ethylene perception (1-MCP) when the five more apical centimeters of the root were analyzed. After treatment with nutrients, the delayed aerenchyma formation led to differential expression of cell wall degradation-, programmed cell death- and ethylene signalling-related genes. Under visual inspection, 1-MCP did not show effect on aerenchyma development. Instead, it changed the hormone balance mainly in the two most apical root segments. The transcriptional pattern of 1-MCP treated roots revealed increased expression of cell expansion- and oxidative stress-related genes. Such patterns are discussed in the light of the hormone regulation of the aerenchyma development through the establishment of a balance between auxin and ethylene within root segments. Both experiments led to the selection of four two candidate genes, two transcription factors (ScRAV1 and ScERF1) and two glycosil hydrolases (ScEPG1 and ScARA1), that were sequenced and analyzed regarding homEURologous diversity, promoter sequences and gene structure compared to S. bicolor. The topology of the phylogenetic reconstructions and the differential distribution of sites for RAV and ERF within ScEPG1 and ScARA1 promoters did not reflect distinct expression patterns. Different hom(e)ologous of each target gene were equally expressed. In an heterologous system, RAV transcription factor interacted with ScEPG1 promoter, reducing the activity encoded by the reporter gene. This suggests the repressive role of RAV on pectin degradation within the middle lamella, leading to reduced cell adhesion and cell separation, possibly regulated by this glycosyl hydrolase. The identification of key regulators of the aerenchyma formation is an important link between hormone signaling and the wall degradation within the sugarcane roots. It enables a better understanding of control mechanisms underlying wall modifications when performed by the plant itself. Altogether, the data produced in this work allows biotechnological application of sequenced genes. Moreover, the produced data unveil key aspects regarding physiologycal aspects of aerenchyma development and highlights features related to the dynamics of gene expression in sugarcane coupled to the phylogenetic aspects of the four target sequences.

A expressão do gene RECK é ubíqua em tecidos normais e não detectável nas linhagens celulares tumorais testadas e em fibroblastos transformados por diversos oncogenes. Inicialmente isolado como um gene indutor da reversão fenotípica tumoral→normal em fibroblastos transformados por v-Ki-ras, o gene RECK codifica uma glicoproteína de membrana que suprime a invasão tumoral e metástase através da regulação da metaloprotease de matriz-9. Para entender os mecanismos de inibição da expressão do gene RECK, mediada por oncogenes, isolou-se e caracterizou-se a região 5\'- flanqueadora do gene RECK de camundongo (mRECK). Ensaios de atividade promotora utilizando mutantes de deleção da região 5\' - flanqueadora e o gene repórter luciferase, revelaram que a sequência de 52 pb, imediatamente \"upstream\" ao gene, possui uma atividade promotora que é suprimida pelo produto do oncogene Ha-ras (V12). Esta sequência contém dois sítios de ligação a Sp1 (SplA e SplB), um sítio de ligação a cEBPb e um CAAT box. EMSAs e ensaios de atividade promotora, utilizando mutantes pontuais nestes sítios, revelaram que as proteínas Spl e Sp3 se ligam a ambos os sítios Spl, e que a resposta a Ras é mediada apenas pelo sítio SplB. Análise por Southern blot utilizando uma enzima de restrição sensível à metilação e por Northern blot de mRNA extraído de células tratadas com um agente desmetilante, sugeriram que o mecanismo de metilação de DNA não está envolvido na regulação transcricional do gene RECK. O envolvimento de RECK em diversos sistemas de proliferação, invasão e reversão celular foi analisado através de Northern blot. Os resultados sugerem que a expressão de RECK é regulada por soro na linhagem A3l de fibroblastos normais de camundongo. / The RECK gene is ubiquitously expressed in normal human tissues, but is downregulated both in tumor cell lines and in oncogenically transformed fibroblasts. Initially isolated as a tumor→normal phenotypic reversioninducing gene in v-ki-ras-transformed fibroblast, RECK encodes a membrane-anchored glycoprotein that suppresses tumor invasion and metastasis by regulating the matrix metalloproteinase-9. In order to understand the mechanism of oncogene-mediated suppression of RECK gene expression, we have isolated and characterized the 5\'-flanking region of the mouse RECK gene (mRECK). Deletion mutants constructs of this 5\' -flanking region with the luciferase reporter gene, revealed that the 52 base pairs upstream displays promoter activity which is suppressed by the Ha-ras (V12) oncogene. This region contains two Spl-binding motifs (SplA and SplB), one cEBPb-binding motif, and one CAAT box. Gel shift analysis and reporter gene assays, in combination with site-directed point mutations in these elements, revealed that both Spl sites associate with Spl as well as Sp3 proteins, although Ras- responsiveness seems to be mediated only by the downstream Spl site (SplB). Southern blot analysis using a methylation-sensitive restriction enzyme and Northern blot analysis with mRNA extracted from cells treated with a demethylating agent, indicated that the mechanism of DNA methylation is not involved in the regulation of RECK gene transcription. The role of RECK in several systems of cell proliferation, invasion and reversion, analysed by Northern blot, suggested that RECK expression is cell cycle regulated by serum in normal A3l mouse fibroblast cell line.

Este trabalho mostra o envolvimento do gene RECK no processo de progressão do ciclo celular. Foi verificado que a expressão endógena de RECK é modulada durante a progressão do ciclo celular. A superexpressão de RECK em fibroblastos normais de camundongo promove uma diminuição da capacidade proliferativa das células e um retardo da transição das fases G0/G1-S do ciclo celular. Além disso, os resultados sugerem que um dos possíveis mecanismos de ação de RECK, que promovem este processo, envolve a indução da expressão de um inibidor de CDK, especificamente de p21, e retardo da fosforilação de pRb. Os resultados indicam, ainda, que durante a progressão do ciclo celular a expressão do gene RECK apresenta uma correlação inversa com a expressão do proto-oncogene c-myc. Estes dados corroboram os dados da literatura que mostram RECK como um alvo para o produto de diversos oncogenes, como ras e c-myc. A caracterização da repressão de RECK por c-Myc mostrou que a mesma ocorre ao nível transcricional e que sítios Sp1, presentes no promotor de RECK, são essenciais para a ação de Myc. Dados adicionais sugerem que a repressão de RECK por c-Myc parece envolver mecanismos de desacetilação de histonas. A modulação da expressão de RECK também foi avaliada durante a progressão maligna de tumores do sistema nervoso central (especificamente, gliomas). Foi verificado que a expressão de RECK não é alterada com a progressão deste tipo de tumor. Porém, foi verificado que os pacientes que manifestaram um maior tempo de sobrevida apresentaram tumores com uma significativa maior expressão do gene RECK. Estes dados sugerem que RECK possa ser um possível marcador prognóstico. A caracterização da regulação da expressão de RECK, tanto em células normais como em diferentes tipos de tumores, assim como os alvos moleculares da sua ação, são pontos muito importantes para o entendimento dos mecanismos que controlam a proliferação celular e podem contribuir para o desenvolvimento de novas formas de terapia anti-tumoral. / This work shows, for the fIrst time, the involvement of the RECK gene in cell cycle progression. Our data shows that the RECK gene product regulates cell cycle progression by altering the G1 to S transition. Also, we show that RECK is able to induce p21 expression and, consequently, lead to hypophosphorylation of the Rb protein, revealing at least one molecular mechanism through which RECK modulates the cell cycle progression. It has been described that induction of the c-Myc transcription factor promotes cell proliferation and cell transformation by regulating several genes that are involved in cell cycle progression. Here, we show that activation of a Mycestrogen receptor fusion protein with 4-hydroxytamoxifen in mouse fibroblasts was suffIcient to repress the expression of the RECK gene, by acting at the RECK promoter region. In addition, we show that Myc-responsiveness seems to be mediated by the upstream Sp1 sites and to be dependent on cromatin remodelling mechanisms. RECK gene expression was aIso evaluated during human glioma progression. Our results indicate that RECK gene expression is not altered during glioma progresslOn, but a correlation was found between the abundance of RECK expression in gliomas and patient survival. The levels of RECK expression can be considered a good prognostic indicator for glioma patients. Better understanding of RECK gene regulation may contribute to uncover the mechanisms of cell cycle and tumor progression, and to the development of new strategies for cancer prevention and therapeutic intervention.