O 5-Fluorouracil (5-FU) é um agente antitumoral amplamente empregado no tratamento de diversos tipos de cânceres. Embora haja muitos trabalhos publicados com este antineoplásico, estudos sobre seus mecanismos de ação ainda tornam-se necessários a fim de se obter protocolos clínicos mais eficazes. Desta forma, novos aspectos sobre seu mecanismo de citotoxicidade foram investigados neste trabalho. Na primeira parte foram avaliadas as vias de reparação de DNA que participam em resposta a danos induzidos pelo 5-FU e seus efeitos comparados com o seu metabólito ativo FdUMP em Saccharomyces cerevisiae. Os resultados apontam que as lesões induzidas pelo 5-FU podem ser processadas pela vias de reparo por excisão de bases (BER), reparação de bases mal-emparelhadas (MMR), reparo pós-replicativo (PRR) e recombinação homóloga (HR), enquanto que os danos induzidos pelo FdUMP seriam reconhecidos e removidos apenas pelas vias BER e MMR. Estas diferenças no recrutamento das vias de reparo relacionam-se aos diferentes tipos de lesões que são geradas pelos antimetabólitos: o 5-FU induz quebras de fita simples (SSBs) e duplas (DSBs), enquanto que o FdUMP forma principalmente SSBs. Na segunda parte foi investigada a participação de modeladores da cromatina na citotoxicidade do 5-FU em S. cerevisiae. Os resultados em conjunto sugerem que os remodeladores da cromatina dependentes de ATP e algumas acetiltransferases de histona podem influenciar na citotoxicidade do agente 5-FU, possivelmente atuando no relaxamento da cromatina, e assim facilitando os processos de reparação de DNA por HR e PRR. Na terceira parte foi avaliada a resposta ao dano no DNA por ATR/Chk1 e ATM/Chk2 em células tumorais humanas. Os resultados mostraram que o 5-FU ativa principalmente a via ATR/Chk1. Ao se investigar os efeitos do 5-FU em combinação com o AZD7762, um inibidor de Chk1/2, observou-se aumento de sensibilidade ao agente antitumoral, diretamente relacionado ao aumento de células em sub-G1, diminuição em G2/M e indução de mitose prematura. Os resultados em conjunto obtidos neste trabalho nos permitem uma melhor compreensão destes mecanismos de ação do 5-FU, e fornece subsídios para melhora de protocolos terapêuticos. / 5-Fluorouracil (5-FU) is an antitumor drug employed in the treatment of several cancer types. Despite many studies have been conduced with this antineoplasic drug, investigations concerning on its action mechanism become necessary in order to obtain more efficient clinical protocols. Therefore, new aspects about its cytotoxicity mechanism were investigated in this work. First, DNA repair pathways involved in the repair of 5-FU-induced lesions were evaluated and compared to the effects of its active metabolite FdUMP in Saccharomyces cerevisiae. Our data showed that lesions induced by 5-FU may be processed by base excision repair (BER), mismatch repair (MMR), post-replication repair (PRR) and homologous recombination (HR), while FdUMP lesions are recognized and removed only by BER and MMR. These differences in repair pathways recruitment are related to the different lesion types induced by the antimetabolites: 5-FU induces single- and double stranded breaks (SSBs and DSBs), while FdUMP induces mainly SSBs. In the second part we investigated the participation of chromatin remodeling in the 5- FU cytotoxicity in S. cerevisiae. Together, our data suggest that ATP-dependent chromatin remodeling and some histone acetyltransferases may influence 5-FU cytotoxicity, probably acting in chromatin relaxation and facilitating DNA repair process by HR and PRR. In the third part, the DNA damage response by ATR/Chk1 and ATM/Chk2 were evaluated in human tumor cells. The data showed that 5-FU activates mainly ATR/Chk1 pathway. When we investigate the effects of 5-FU in combination with AZD7762, the Chk1/2 inhibitor, we observed increased sensitivity to this antitumor agent, directly related to enhanced number of sub-G1 cells, decrease in the G2/M cells, and premature mitose induction. Our data permit a better comprehension of 5-FU action mechanisms and provide clues to improve the current therapeutics protocols.

O 5-fluorouracil (5-FU) é um antineoplásico análogo pirimídico empregado no tratamento de muitos tipos de cânceres. Três diferentes mecanismos de citotoxicidade são atribuídos a este agente: incorporação de fluoronucleotídeos no DNA ou RNA e a inibição da enzima timidilato sintase. O 5-FU pode ser convertido ao seu metabólito ativo, o 5-fluoro-2´-deoxiuridina-5´-monofosfato (FdUMP), que por sua vez, pode inibir a enzima timidilato sintase (TS), responsável pela síntese de timidina monofosfato a partir de uridina monofosfato; a inibição de TS leva ao desbalanço do pool de nucleotídeos, diminuindo a concentração de dTTP, aumentando a de dUTP e, como conseqüência, levando à incorporação de uracil na cadeia de DNA. No presente estudo comparamos a atividade citotóxica de 5-FU e de seu metabólito FdUMP e as vias de reparação de DNA envolvidas na eliminação das lesões induzidas por estas substâncias. A atividade citotóxica foi avaliada em células de adenocarcinoma de cólon humano, linhagem SW620. As vias de reparação foram estudadas em linhagens de Saccharomyces cerevisiae deficientes em genes de reparo para excisão de bases (BER), excisão de nucleotídeos (NER), recombinação homóloga (HR), recombinação não-homóloga (NHEJ) e síntese translesão (TLS). Para se investigar a possível sobreposição das vias de reparo, foram empregados quádruplos mutantes em BER e NER, HR ou TLS. Os resultados em células tumorais humanas mostraram que tanto 5-FU, quanto FdUMP desencadeiam morte celular por apoptose. Ao avaliar a progressão do ciclo celular, observou-se que 5-FU leva a parada em G1, enquanto que FdUMP, parada em G2. Com a finalidade de se investigar se estas paradas de ciclo celular estariam relacionadas a quebras de DNA, foram empregados ensaios de fosforilação da histona H2AX e os testes de cometa alcalino e de micronúcleos. Observou-se que ambas as drogas induzem fragmentação no DNA, uma vez que foram observadas quebras de fita simples e formação de micronúcleos. Logo, a diferença na progressão do ciclo celular não está relacionada com a habilidade das drogas em induzir quebras. Desta forma, sugere-se que o efeito diferencial de 5-FU e FdUMP na progressão do ciclo celular depende do tipo de lesão induzida pelas drogas e as vias de reparação de DNA implicadas no reconhecimento das mesmas. Ao empregar linhagens de S. cerevisiae proficientes e deficientes em reparo tratadas com 5-FU e FdUMP, observou-se que a proteína Apn1 é de extrema importância no reparo das mesmas, uma vez que apn1Δ foi o mais sensível de todos mutantes e ntg1Δntg2Δapn1Δ apresentou grande sensibilidade aos tratamentos com ambas as drogas. As lesões causadas por 5-FU seriam reconhecidas principalmente pela Ntg2, o que resulta em significativa sensibilidade em ntg2Δ e ntg1Δntg2Δ. Entretanto, para o reconhecimento dos danos por FdUMP são necessárias a participação tanto de Ntg1 quanto Ntg2, como visto na elevada sensibilidade do duplo mutante ntg1Δntg2Δ. As deficiências em Ung1 e Rad27 não revelaram diferenças significativas em relação às linhagens selvagens, bem como nos mutantes em NER (rad1Δ e rad10Δ), HR (rad52Δ), NHEJ (rad50Δ) e TLS (rev1Δ e rev3Δ), para ambas as drogas. No emprego de quádruplos mutantes, verificou-se que ntg1Δntg2Δapn1Δrad52Δ mostrou uma acentuada sensibilidade quando tratado com 5-FU. Estes resultados sugerem que os danos gerados por 5-FU poderiam ser reconhecidos e removidos pela DNA glicosilase Ntg2 e AP endonucleases Apn1 do BER, levando a quebras de fita simples e dupla de DNA, que seriam reparadas por HR (Tipo RAD52). Entretanto, para o tratamento com FdUMP não foram observadas diferenças significativas quando comparado com a linhagem selvagem. Ao analisar a sensibilidade dos mutantes ntg1Δntg2Δapn1Δrad1Δ e ntg1Δntg2Δapn1Δrev3Δ, verificou-se que os mesmos não foram sensíveis ao tratamento com FdUMP, entretanto apresentaram moderada sensibilidade quando tratados com 5-FU. O conjunto desses resultados nos leva a sugerir que uma pequena parte dos sítios AP produzidos pelo tratamento com 5-FU poderia ser processada por NER e TLS, sendo a participação de HR a mais importante. As lesões geradas por FdUMP seriam reparadas principalmente por BER, com a participação de Ntg1, Ntg2 e Apn1, porém não pode ser descartado o possível envolvimento da reparação de bases mal-emparelhadas - MMR, uma vez que se observou previamente, uma parada no ciclo celular em G2 em células de adenocarcinoma de cólon humano SW620. / 5-fluorouracil (5-FU) is an antineoplastic drug pyrimidic analogue employed in the treatment of several cancers. Three different mechanisms of cytotoxicity are attributed to this agent: misincorporation of fluoronucleotides in DNA or RNA and inhibition of thymidilate sintase enzime. 5-FU could be converted to its active metabolite, 5-fluoro-2´-deoxiuridina-5´-monofosfato (FdUMP), that could inhibit the thymidilate sintase (TS), related to thymidine synthesis from uridine; TS inhibition leads to nucleotide pool imbalance, decreasing thymine concentration and increasing uracil, as consequence, it leads to uracil incorporation into DNA. The present study compared the cytotoxic activity of 5-FU and its active metabolite FdUMP, and the DNA repair pathways involved in removing lesions induced by these substances. Cytotoxicity was evaluated in human colon adenocarcinoma cells, SW620. DNA repair pathwayas were studied in Saccharomyces cerevisiae deficient in base excision repair (BER), nucleotide excision repair (NER), homologous recombination (HR), non-homologous end joining (NHEJ) and translesion synthesis (TLS). To investigate the overlapping of DNA repair pathways, we employed quadruple mutants in BER and NER, HR or TLS. Results in human tumor cells showed that both 5-FU and FdUMP induce cell death by apoptosis. When we investigated the cell cycle progression, we observed that 5-FU lead G1 arrest, while FdUMP induced G2 arrest. In order to investigate if these arrests would be related to DNA breaks, alkaline comet assay, fosforilation of H2AX histone and micronucleus assay were employed. We observed that both drugs induce DNA fragmentation, since single strand breaks and micronucleus were evidenced. Thus, the difference in cell cycle progression is not related to the ability of 5-FU and FdUMP in induce breaks. This way, we suggest that the differential effect of 5-FU and FdUMP in cell cycle progression depends on the type of lesion originated by drugs and the DNA repair pathways implicated in recognize them. By employing S. cerevisiae strains proficient and deficient in DNA repair treated with 5-FU and FdUMP, it was observed that Apn1 protein is extremely important in repairing these lesions, since apn1Δ was the most sensitive of all mutants employed and ntg1Δntg2Δapn1Δ showed high sensitivity to treatments with both drugs. Lesions caused by 5-FU would be recognized mainly by Ntg2, what results in significant sensitivity in ntg2Δ and ntg1Δntg2Δ. However, for recognition of FdUMP damage it is necessary the participation of both Ntg1 and Ntg2, as observed in high sensitivity of ntg1Δntg2Δ double mutant. Deficiencies in Ung1 and Rad27 did not reveal significant differences in relation to WT, as well as mutants in NER (rad1Δ e rad10Δ), HR (rad52Δ), NHEJ (rad50Δ) e TLS (rev1Δ e rev3Δ), for both drugs. When we employed quadruple mutants, we verified that ntg1Δntg2Δapn1Δrad52Δ showed higher sensitivity when treated with 5-FU. These data suggest that damage generated by 5-FU could be recognized and removed by DNA glycosylases Ntg2 and AP endonuclease Apn1 from BER, generating DNA single and double strand breaks, that could be repaired by HR (RAD52 Type). However, for FdUMP, we did not observe significant differences in comparison to WT. By investigating the sensitivity of ntg1Δntg2Δapn1Δrad1Δ and ntg1Δntg2Δapn1Δrev3Δ, we observed that they were not sensitized by FdUMP, however, they present a slight sensitivity when treated with 5-FU. These results lead us to suggest that a small part of AP sites generated by 5-FU could be processed by NER and TLS, and HR would be the most significant. Lesions by FdUMP would be repaired mainly by BER, with participation of Ntg1, Ntg2 and Apn1, however, we can not discharge the possible involvement of mismatch repair pathway - MMR, since we previous observed G2 arrest in SW620 human colon adenocarcinoma cells.

Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte. / Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death.

Interstrand DNA crosslinks (ICLs) são importantes lesões genotóxicas que podem causar morte celular se não for devidamente reparadas. Diversas drogas antitumorais atuam através da indução de ICLs no DNA, e a resistência a essas drogas está muitas vezes relacionada à maior capacidade de células tumorais para reparar tais lesões. As ICLs são lesões complexas que requerem o envolvimento de diferentes vias de reparação, tais como BER NER, TLS e vias de reparação de DSBs (RH e NHEJ). Além disso, foi demonstrado que Pso2p desempenha um papel importante na reparação de ICLs. Muitos estudos também apontam para as alterações epigenéticas como essenciais para a sobrevivência da célula em resposta ao dano genotóxico, através da indução de checkpoints de ciclo celular e da modulação da eficiência (e, possivelmente, da escolha) das vias de reparação de DNA. Assim, a primeira parte desta Tese apresenta uma revisão dos mecanismos envolvidos na citotoxicidade dos ICLs induzidos pela furocumarina bifuncional 8-metoxipsoraleno (8-MOP) em Saccharomyces cerevisiae. A abordagem adotada discute a ação integrada de proteínas que atuam em vias de reparação de DNA envolvidas na remoção de ICLs, em combinação com fatores envolvidos no remodelamento da cromatina dependente de ATP. A fim de investigar o papel do remodelamento da cromatina em resposta a danos ao DNA induzidos pelo tratamento com furocumarinas mono e bifuncionais fotoativadas e ditelureto de difenila (DTDF), foram utilizadas linhagens de S. cerevisiae deficientes em diferentes proteínas relacionadas com a reparação do DNA e o remodelamento da cromatina. DTDF é um composto organotelurado proposto como um protótipo potencial para o desenvolvimento de novas drogas antitumorais. A sensibilidade do mutante pso2Δ ao DTDF, semelhante à observada para o 8-MOP, indica que este composto pode induzir lesões capazes de bloquear a replicação do DNA, tais como ligações cruzadas ou DSBs hairpin capped. Os resultados obtidos mostraram que os duplos mutantes pso2Δswr1Δ e rad52Δswr1Δ não são mais sensíveis aos agentes testados, DTDF, 3-CPS e 8-MOP, do que o mais sensível dos simples mutantes (pso2Δ e rad52Δ, respectivamente). Tendo em mente que Rad52p e Pso2p não têm interação epistática (aditiva ou sinergística) na reparação das lesões fotoinduzidas por 3-CPS e 8-MOP, sugere-se que Pso2p pode fornecer substrato para vias de reparação diferentes de HR, que poderiam ser NHEJ canônica e/ou MMEJ. O fato de que swr1Δ (deficiente em NHEJ) não aumenta a sensibilidade dos duplos mutantes, além da baixa sensibilidade observada para o mutante yku80Δ ao DTDF e à fotoadição de psoralenos, sugere que as lesões induzidas podem ser direcionadas para as vias HR ou MMEJ, ao invéz de NHEJ canônica. O envolvimento da via MMEJ sujeita a erros na reparação de lesões induzidas por DTDF pode explicar a indução de mutação frameshift, observada para este agente. Além disso, investigou-se a citotoxicidade induzida pelas drogas antitumorais cisplatina (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU) e sua combinação, em S. cerevisiae. Os resultados obtidos com os mutantes de reparação do DNA mostraram que a sensibilidade à CDDP + 5-FU parece refletir a sensibilidade de linhagens específicas a cada droga utilizada individualmente. Este resultado sugere que o efeito intensificado do tratamento combinado na terapia do câncer pode ser devido à ação de cada agente isoladamente, conforme observado em clones diferentes da população heterogênea de células transformadas. Os resultados referentes aos mutantes em remodelamento da cromatina demonstraram que o tratamento com CDDP + 5-FU provoca uma resposta mais eficaz na indução de morte celular, nos mutantes deficientes em CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ e hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, e hst3Δ), HML (dot1Δ) e HMT (erg6Δ), enquanto CDDP induz sensibilidade em mutantes HAT, além do mutante de HDAC hos3Δ, e o tratamento com 5-FU induz sensibilidade em HAT (gcn5Δ) e HDAC (sin3Δ e hos3Δ). Esses resultados apontam para o envolvimento de proteínas de remodelamento da cromatina como importantes alvos terapêuticos em resposta a agentes genotóxicos. Portanto, os resultados obtidos podem abrir novas perspectivas para a compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta ao tratamento com CDDP + 5-FU, bem como auxiliar na escolha dos melhores protocolos terapêuticos. / Interstrand DNA crosslinks (ICLs) are important genotoxic lesions that can cause cell death if not properly repaired. Several antitumoral drugs act by inducing ICLs in DNA, and the resistance to these drugs is often related to an increased capacity of tumor cells to repair such lesions. The ICLs are complex lesions requiring involvement of different pathways for repair, such as BER, NER, TLS and DSB repair pathways (HR and NHEJ). In addition, Pso2p was shown to play an important role in ICLs repair. Many studies also point to the epigenetic changes as essential for cell survival in response to genotoxic damage, through induction of cell cycle checkpoints and modulating the efficiency (and possibly, the choice) of the DNA repair pathways. So, the first part of this Thesis gives a review of the mechanisms involved in the cytotoxicity of the ICLs induced by the bifunctional furocumarin 8-methoxypsoralen (8-MOP) in Saccharomyces cerevisiae. The adopted approach discusses the integrated action of proteins that work in the DNA repair pathways involved in ICLs removing in combination with factors involved in ATP-dependent chromatin remodeling. In order to investigate the role of the chromatin remodeling in response to DNA damage induced by treatment with mono- and bifunctional photoactivated furocumarins and diphenyl ditelluride (DPDT), we used S. cerevisiae strains deficient in different proteins related to DNA repair and chromatin remodeling. DPDT is organotellurium compound proposed as a potential prototype for development of new antitumoral drugs. The sensitivity of pso2Δ to DPDT, similar to that observed for 8-MOP, indicates that this compound could induce lesions able to block DNA replication, such as crosslinks or hairpin-capped DSBs. The obtained results showed that the double mutants pso2Δswr1Δ and rad52Δswr1Δ are not more sensitive to the tested DPDT, 3-CPS and 8-MOP agents than the more sensitive single mutant (pso2Δ and rad52Δ, respectively). Having in mind that Rad52p and Pso2p have non-epistatic interaction (additive or synergistic) in the repair of 3-CPS and 8-MOP photoinduced lesions, we suggest that Pso2p could provide substrate for repair pathway different from HR, which could be canonical NHEJ and/or MMEJ. The fact that swr1Δ (deficient in NHEJ) do not enhance the sensitivity of the double-mutants, in addition to the observed low sensitivity of the yku80Δ mutant to DPDT and psoralens photoaddition, suggests that the induced lesions could be directed to HR or MMEJ pathways rather than to canonical NHEJ. The involvement of the error-prone MMEJ in repair of DPDT-induced lesions could explain the observed frameshift mutation induction by this agent. Moreover, we investigated the cytotoxicity induced by the antitumoral drugs cisplatin (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU), and their combination in S. cerevisiae. The results obtained with DNA repair mutants showed that the sensitivity to cisplatin + 5-FU appears to reflect the sensitivity of the specific strains to each individual drug used. This finding suggests that the enhanced effect of the combined treatment in cancer therapy could be due to the action of each agent alone, as observed on different clones from the heterogeneous population of transformed cells. The results concerning chromatin remodeling mutants demonstrated that CDDP + 5-FU treatment causes a more effective response in the induction of cell death, in CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ and hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, and hst3Δ), HML (dot1Δ) and HMT (erg6Δ) mutants, while CDDP induces sensitivity in HAT mutants, besides the HDAC mutant hos3Δ, and 5-FU treatment induces sensitivity in HAT (gcn5Δ) and HDACs (sin3Δ and hos3Δ). These results point to involvement of chromatin remodeling proteins as important therapeutic targets in response to genotoxic agents. Therefore, our findings could provide new insights for understanding the mechanisms involved in the response to treatment with CDDP + 5-FU, as well as to help in the choice of optimal therapeutic protocols.

A Colômbia tem uma das maiores reservas de carvão do mundo, sendo o quinto exportador mundial do carvão de tipo térmico. Nos processos de extração de carvão a céu aberto uma grande quantidade de partículas de pó e metais pesados são liberados à atmosfera, onde podem formar misturas complexas, constituindo um risco significativo para a saúde dos trabalhadores ocupacionalmente expostos. Além disso, nas minas a céu aberto, o carvão extraído é armazenado na presença de luz solar, gerando incêndios espontâneos que constituem uma importante fonte de emissão de Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs) depois de sua combustão incompleta. O objetivo do presente estudo foi avaliar se polimorfismos nos genes do metabolismo de xenobióticos CYP1A1Msp1, GSTM1nulo, GSTT1nulo e de reparação do DNA XRCC1194Trp e OGG1326Cys podem modificar a suscetibilidade individual aos efeitos adversos causados pela exposição aos resíduos de mineração de carvão, considerando a formação de Micronúcleos (MN) e alguns parâmetros do Ensaio Cometa (Índice de Dano - DI, Frequência de dano - DF e porcentagem de DNA na cauda - Tail % DNA) como biomarcadores de mutagenicidade e genotoxicidade. A população de estudo foi formada por 100 trabalhadores de mineração de carvão a céu aberto ocupacionalmente expostos a resíduos de mineração e 100 controles não expostos. O estudo foi realizado na área mineira de “El Cerrejón”, a maior mina de carvão a céu aberto do mundo, localizada em Guajira, ao Norte da Colômbia. As análises dos valores do Ensaio Cometa demonstraram um incremento significativo no DI, DF e porcentagem de DNA na cauda (Tail % DNA) (p < 0,001) no grupo exposto, comparado com o grupo controle. Também houve um aumento significativo na frequência de MN em trabalhadores expostos, representado por um risco relativo (RR) de quase o triplo (2,88, 95% CI 2,525 – 3,284, p < 0,001) para a população exposta, representando um elevado risco de câncer em relação aos controles correspondentes. Apesar destes, os resultados demonstraram que os polimorfismos nos genes do metabolismo (CYP1A1Msp1, GSTM1nulo, GSTT1nulo) e nos genes de reparação do DNA (XRCC1194Trp e OGG1326Cys) não tiveram nenhum impacto sobre as frequências de MN em linfócitos periféricos dos trabalhadores expostos. Da mesma forma, polimorfismos em genes de metabolismo de xenobióticos (GSTM1nulo, GSTT1nulo e CYP1A1Msp1) não influenciaram os níveis de dano no DNA detectados pelo Ensaio cometa. O genótipo XRCC1194Trp/- apresentou uma tendência de proteção em indivíduos expostos, evidenciada em uma diminuição na frequência de MN, embora não tenha sido significante. A nosso conhecimento, este estudo fornece os primeiros dados para a Colômbia sobre o risco genotóxico associado à exposição os resíduos de mineração de carvão a céu aberto e contribui para estabelecer um mapa geral das frequências genotípicas representativas em populações Latino-Americanas, as quais apresentam uma alta complexidade devido ao elevado grau de mistura étnica. / Colombia has one of the world's largest coal reserves being the fifth biggest thermal coal exporter world-wide. In open-cast coal mining extraction, large amounts of dust particles and heavy metals are released into the atmosphere, where they can form complex mixtures, representing a significant health risks to occupationally exposed workers. In addition, in open-cast mines, extracted coal is stored under sunlight, causing spontaneous fires, being an important source of Polycyclic Hydrocarbons Aromatic (PHAs) emission after incomplete combustion. The aim of our study was to evaluate if polymorphisms in metabolisms genes CYP1A1Msp1, GSTM1null, GSTT1null and DNA repair XRCC1194Trp and OGG1326Cys could modify individual susceptibility to adverse coal exposure effects caused by the exposition to coal mining residues considering the Micronucleus formation (MN) and Comet Assay parameters (Damage Index (DI), Damage Frequency (DF) and Tail % DNA) as endpoint s for mutagenicity and genotoxicity. The study population comprised 100 open-cast coal mining workers occupationally exposed to coal residues and 100 non-exposed controls. The study was conducted in the coal mining area of “El Cerrejón”, the world’s largest open-cast coal mine, located in Guajira North Colombia. The analysis of Comet assay values indicated a significant increase in the DI, DF and Tail % DNA (p < 0.001) in the exposed group in comparison to the non-exposed control group. There was also a significant MN frequency increase in exposed workers, represented by a relative risk (RR) of almost the triple (2.88, 95% CI 2.525 – 3.284, p < 0.001) for the exposed population, representing a higher risk in relation to the matched non-exposed control. Despite of this, the results show that polymorphisms in the metabolism genes (CYP1A1Msp1,, GSTM1null, GSTT1null) and DNA repair genes (XRCC1194Trp and OGG1326Cys) had no impact on MN frequencies in peripheral lymphocytes of exposed workers. Similarly, polymorphisms in metabolism genes (CYP1A1Msp1,, GSTM1null, GSTT1null) did not influence levels of DNA damage detected by comet assay. XIV The XRCC1194Trp/- genotype shows a protective effect evidenced by a decreased MN frequency in exposed individuals, although with no statistics significance. To our knowledge, this study provides the first data in the country on a genotoxic hazard associated to exposure to coal residues by mining activities and contributes to establishing a general map of representative genotype frequencies in the Latin-American population, which is quite complex given the high degree of ethnic admixture and stratification.

A Colômbia tem uma das maiores reservas de carvão do mundo, sendo o quinto exportador mundial do carvão de tipo térmico. Nos processos de extração de carvão a céu aberto uma grande quantidade de partículas de pó e metais pesados são liberados à atmosfera, onde podem formar misturas complexas, constituindo um risco significativo para a saúde dos trabalhadores ocupacionalmente expostos. Além disso, nas minas a céu aberto, o carvão extraído é armazenado na presença de luz solar, gerando incêndios espontâneos que constituem uma importante fonte de emissão de Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs) depois de sua combustão incompleta. O objetivo do presente estudo foi avaliar se polimorfismos nos genes do metabolismo de xenobióticos CYP1A1Msp1, GSTM1nulo, GSTT1nulo e de reparação do DNA XRCC1194Trp e OGG1326Cys podem modificar a suscetibilidade individual aos efeitos adversos causados pela exposição aos resíduos de mineração de carvão, considerando a formação de Micronúcleos (MN) e alguns parâmetros do Ensaio Cometa (Índice de Dano - DI, Frequência de dano - DF e porcentagem de DNA na cauda - Tail % DNA) como biomarcadores de mutagenicidade e genotoxicidade. A população de estudo foi formada por 100 trabalhadores de mineração de carvão a céu aberto ocupacionalmente expostos a resíduos de mineração e 100 controles não expostos. O estudo foi realizado na área mineira de “El Cerrejón”, a maior mina de carvão a céu aberto do mundo, localizada em Guajira, ao Norte da Colômbia. As análises dos valores do Ensaio Cometa demonstraram um incremento significativo no DI, DF e porcentagem de DNA na cauda (Tail % DNA) (p < 0,001) no grupo exposto, comparado com o grupo controle. Também houve um aumento significativo na frequência de MN em trabalhadores expostos, representado por um risco relativo (RR) de quase o triplo (2,88, 95% CI 2,525 – 3,284, p < 0,001) para a população exposta, representando um elevado risco de câncer em relação aos controles correspondentes. Apesar destes, os resultados demonstraram que os polimorfismos nos genes do metabolismo (CYP1A1Msp1, GSTM1nulo, GSTT1nulo) e nos genes de reparação do DNA (XRCC1194Trp e OGG1326Cys) não tiveram nenhum impacto sobre as frequências de MN em linfócitos periféricos dos trabalhadores expostos. Da mesma forma, polimorfismos em genes de metabolismo de xenobióticos (GSTM1nulo, GSTT1nulo e CYP1A1Msp1) não influenciaram os níveis de dano no DNA detectados pelo Ensaio cometa. O genótipo XRCC1194Trp/- apresentou uma tendência de proteção em indivíduos expostos, evidenciada em uma diminuição na frequência de MN, embora não tenha sido significante. A nosso conhecimento, este estudo fornece os primeiros dados para a Colômbia sobre o risco genotóxico associado à exposição os resíduos de mineração de carvão a céu aberto e contribui para estabelecer um mapa geral das frequências genotípicas representativas em populações Latino-Americanas, as quais apresentam uma alta complexidade devido ao elevado grau de mistura étnica. / Colombia has one of the world's largest coal reserves being the fifth biggest thermal coal exporter world-wide. In open-cast coal mining extraction, large amounts of dust particles and heavy metals are released into the atmosphere, where they can form complex mixtures, representing a significant health risks to occupationally exposed workers. In addition, in open-cast mines, extracted coal is stored under sunlight, causing spontaneous fires, being an important source of Polycyclic Hydrocarbons Aromatic (PHAs) emission after incomplete combustion. The aim of our study was to evaluate if polymorphisms in metabolisms genes CYP1A1Msp1, GSTM1null, GSTT1null and DNA repair XRCC1194Trp and OGG1326Cys could modify individual susceptibility to adverse coal exposure effects caused by the exposition to coal mining residues considering the Micronucleus formation (MN) and Comet Assay parameters (Damage Index (DI), Damage Frequency (DF) and Tail % DNA) as endpoint s for mutagenicity and genotoxicity. The study population comprised 100 open-cast coal mining workers occupationally exposed to coal residues and 100 non-exposed controls. The study was conducted in the coal mining area of “El Cerrejón”, the world’s largest open-cast coal mine, located in Guajira North Colombia. The analysis of Comet assay values indicated a significant increase in the DI, DF and Tail % DNA (p < 0.001) in the exposed group in comparison to the non-exposed control group. There was also a significant MN frequency increase in exposed workers, represented by a relative risk (RR) of almost the triple (2.88, 95% CI 2.525 – 3.284, p < 0.001) for the exposed population, representing a higher risk in relation to the matched non-exposed control. Despite of this, the results show that polymorphisms in the metabolism genes (CYP1A1Msp1,, GSTM1null, GSTT1null) and DNA repair genes (XRCC1194Trp and OGG1326Cys) had no impact on MN frequencies in peripheral lymphocytes of exposed workers. Similarly, polymorphisms in metabolism genes (CYP1A1Msp1,, GSTM1null, GSTT1null) did not influence levels of DNA damage detected by comet assay. XIV The XRCC1194Trp/- genotype shows a protective effect evidenced by a decreased MN frequency in exposed individuals, although with no statistics significance. To our knowledge, this study provides the first data in the country on a genotoxic hazard associated to exposure to coal residues by mining activities and contributes to establishing a general map of representative genotype frequencies in the Latin-American population, which is quite complex given the high degree of ethnic admixture and stratification.

As células-tronco mesenquimais (MSC) foram originalmente isoladas da medula óssea, mas populações semelhantes foram isoladas do tecido adiposo e outros tecidos. A diferenciação das células-tronco derivadas do tecido adiposo (do inglês adipose derived stem cells; ADAS) para células neurais foram realizadas por vários grupos. Um aspecto muito importante relacionado com as células-tronco é a manutenção da integridade genômica durante o processo de diferenciação. Acredita-se que a manutenção da estabilidade genética por meio dos mecanismos de reparação do DNA devem ser particularmente rigorosos em células-tronco adultas, onde qualquer alteração genética pode comprometer a estabilidade genética e a funcionalidade destas células. O objetivo deste estudo foi observar a viabilidade e a integridade genética das células ADAS tratadas com o meio de indução neural, por meio do teste cometa, teste de micronúcleo e teste de viabilidade celular. Além disso, foi analisada a expressão de algumas proteínas relacionadas com a sinalização de danos no DNA, remodelagem de cromatina e proliferação. Os resultados obtidos no presente estudo claramente indicaram que o meio de indução neural pode ser genotóxico para as ADAS. O teste cometa revelou que a indução neural aumenta o índice e a freqüência de danos no DNA. A indução de micronúcleos não foi observada nas mesmas condições, indicando que o meio de indução neural não causa danos clastogênicos. Ao considerar a expressão de MCM3, TIP60, telomerase e a variação na expressão de marcadores neurais, o método de indução neural usada in vitro pode encaminhar a célula a uma transformação tumoral. Estes resultados alertam para a importância dos estudos relacionados com aos protocolos atualmente usados na diferenciação in vitro de células-tronco para fins terapêuticos. / Mesenchymal stem cells (MSC) were originally isolated from the bone marrow, although similar populations have been isolated from adipose and other tissues. The differentiation of ADAS (adipose derived stem cells) to neuronal cells has been accomplished by several groups. One important aspect related to stem cells is the maintenance of genomic integrity during the differentiation process. In this sense, the maintenance of genomic stability by DNA repair mechanisms in adult stem cells should be particularly stringent, where any genetic alteration can compromise the genomic stability and functionality of cell. Thus, the aim of this study was to observe the viability and integrity of ADAS cells treated with neural induction medium by using the comet, micronucleus, and cell viability assays. Moreover, the expression of some proteins and genes related to DNA damage signalling, chromatin remodeling, and cell proliferation was analyzed. The data obtained from the present study clearly indicate that the neuronal medium can be genotoxic to ADAS cells. Our results reveal that neuronal induction increases the damage frequency and damage index observed by comet assay. The induction of micronuclei was not observed for the same assay conditions, indicating that the neuronal induction medium does not cause chromosome loss and breakage. Considering the expression of MCM3, TIP60, telomerase and neuronal marker, it can be speculated that the neural induction conditions used in this work can drives ADAS cells to tumor transformation. These results call for the necessity of new studies related to in vitro stem cell differentiation protocols for therapeutical purposes.

Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte. / Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death.

As células-tronco mesenquimais (MSC) foram originalmente isoladas da medula óssea, mas populações semelhantes foram isoladas do tecido adiposo e outros tecidos. A diferenciação das células-tronco derivadas do tecido adiposo (do inglês adipose derived stem cells; ADAS) para células neurais foram realizadas por vários grupos. Um aspecto muito importante relacionado com as células-tronco é a manutenção da integridade genômica durante o processo de diferenciação. Acredita-se que a manutenção da estabilidade genética por meio dos mecanismos de reparação do DNA devem ser particularmente rigorosos em células-tronco adultas, onde qualquer alteração genética pode comprometer a estabilidade genética e a funcionalidade destas células. O objetivo deste estudo foi observar a viabilidade e a integridade genética das células ADAS tratadas com o meio de indução neural, por meio do teste cometa, teste de micronúcleo e teste de viabilidade celular. Além disso, foi analisada a expressão de algumas proteínas relacionadas com a sinalização de danos no DNA, remodelagem de cromatina e proliferação. Os resultados obtidos no presente estudo claramente indicaram que o meio de indução neural pode ser genotóxico para as ADAS. O teste cometa revelou que a indução neural aumenta o índice e a freqüência de danos no DNA. A indução de micronúcleos não foi observada nas mesmas condições, indicando que o meio de indução neural não causa danos clastogênicos. Ao considerar a expressão de MCM3, TIP60, telomerase e a variação na expressão de marcadores neurais, o método de indução neural usada in vitro pode encaminhar a célula a uma transformação tumoral. Estes resultados alertam para a importância dos estudos relacionados com aos protocolos atualmente usados na diferenciação in vitro de células-tronco para fins terapêuticos. / Mesenchymal stem cells (MSC) were originally isolated from the bone marrow, although similar populations have been isolated from adipose and other tissues. The differentiation of ADAS (adipose derived stem cells) to neuronal cells has been accomplished by several groups. One important aspect related to stem cells is the maintenance of genomic integrity during the differentiation process. In this sense, the maintenance of genomic stability by DNA repair mechanisms in adult stem cells should be particularly stringent, where any genetic alteration can compromise the genomic stability and functionality of cell. Thus, the aim of this study was to observe the viability and integrity of ADAS cells treated with neural induction medium by using the comet, micronucleus, and cell viability assays. Moreover, the expression of some proteins and genes related to DNA damage signalling, chromatin remodeling, and cell proliferation was analyzed. The data obtained from the present study clearly indicate that the neuronal medium can be genotoxic to ADAS cells. Our results reveal that neuronal induction increases the damage frequency and damage index observed by comet assay. The induction of micronuclei was not observed for the same assay conditions, indicating that the neuronal induction medium does not cause chromosome loss and breakage. Considering the expression of MCM3, TIP60, telomerase and neuronal marker, it can be speculated that the neural induction conditions used in this work can drives ADAS cells to tumor transformation. These results call for the necessity of new studies related to in vitro stem cell differentiation protocols for therapeutical purposes.

Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte. / Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death.