DE LA TESI DOCTORAL: L'augment de la incidència de bacteris amb resistència als agents antimicrobians és deguda a les característiques intrínseques de les soques antimicrobianes, a una pressió selectiva per l'ús extensiu dels antibiòtics i a uns canvis socials i tecnològics que ha facilitat la transmissió d'organismes resistents o de gens de resistència. Aquest constitueix un problema sanitari de primera magnitud. Els bacteris presenten característiques que poden influir poderosament en l'emergència i la transmissió dels gens que codifiquen per a la resistència als agents antimicrobians.Els mecanismes de resistència dels bacteris als antibiòtics poden ser diversos. Des de la inactivació enzimàtica de l'antibiòtic, la modificació de la diana de l'antibiòtic així com mecanismes de caire més generals com la disminució de la permeabilitat de la membrana, l'expressió de bombes de reflux i l'intercanvi de material genètic per transferència de plasmidis, transposons o integrons. Precisament aquests últims mecanismes són objecte de la present tesi doctoral.El nostre grup de recerca ha treballat durant anys sobre diferents mecanismes de resistència als antibiòtics en diferents espècies bacterianes, continuant a l'actualitat amb aquesta activitat investigadora.Com a objectiu general d'aquesta tesi ens plantegem la caracterització molecular i funcional dels mecanismes de resistència d'un bacteri Gram negatiu: Morganella morganii. I en concret s'ha centrat en els següents punts:1. Investigar la susceptibilitat antimicrobiana de diverses soques de Morganella morganii d'origen clínic. 2. Investigar la importància de la permeabilitat de les envoltes cel·lulars bacterianes de Morganella morganii a diferents antibiòtics.3. Realitzar experiments de transformació i conjugació amb les soques clíniques resistents.4. Obtenir la porina de Morganella morganii purificada i realitzar estudis físico-químics seguint la tècnica de lipid planar bylayer.5. Investigar sobre l'existència d'integrons en la soca de Morganella morganii resistent i obtenir les seqüències dels gens de resistència inserits en aquests integrons.6. Estudiar la possible funcionalitat de bombes de reflux que puguin expulsar els antibiòtics fora de la cèl·lula.

INTRODUCCIÓN:Tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo las Salmonellas son responsables de un alto nivel de morbilidad y mortalidad. Este problema es especialmente relevante en áreas en vías de desarrollo donde la carencia de fuentes económicas no permite disponer de un amplio potencial antibacteriano. Además, en algunas de estas áreas tanto la situación social como la presencia de otras enfermedades favorecen la infección por estos microorganismos. El género Salmonella está compuesto por 2501 serotipos con diferentes características fenotípicas y genotípicas y aunque usualmente produce una infección autolimitada, la duración o la severidad de los síntomas pueden requerir tratamiento antibiótico.Las especies de Salmonella disponen de altos niveles de resistencia natural a los agentes antimicrobianos más usados, sin embargo la aparición de cepas de Salmonella mostrando resistencia a uno o más agentes antibacterianos ha aumentado considerablemente probablemente debido a la continua presión antibiótica, lo cual constituye un importante problema para la salud pública. La resistencia a algunos antibióticos, tales como β-lactámicos, tetraciclina, cloranfenicol, o trimetoprim-sulfametoxazol está siendo reportada con alta frecuencia. Además se ha descrito el desarrollo de resistencia a quinolonas. Una eficiente ruta de adquisición de esta resistencia es a través de elementos genéticos tales como, plámidos, transposones e integrones.El principal objetivo de este estudio fue analizar la evolución de la resistencia en aislamientos de Salmonella de origen clínico, caracterizar los mecanismos de resistencia a diferentes agentes antimicrobianos y analizar el potencial de diseminación de clones resistentes.MATERIALES Y MÉTODOS:En este estudio se analizaron cepas (n=62) aisladas de muestras de heces procedentes de viajeros que padecían diarrea del viajero y cepas (n=34) aisladas de muestras de heces de pacientes con gastroenteritis aguda de diferentes regiones de Cuba. El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Microbiología Clínica del Hospital Clínic de Barcelona. Los patógenos diarreagénicos encontrados fueron identificados por métodos convencionales. El serotipo se determinó utilizando antisueros somáticos y flagelares. La fase flagelar fue determinada por el método de inversión de fase descrito por Kauffman y White y siguiendo las recomendaciones de Edward y Ewing. También se identificaron los fagotipos de los serotipos Enteritidis, Typhimurium, Hadar y Virchow. Se determinó la susceptibilidad antimicrobiana por el método de Kirby-Bauer a diferentes agentes antimicrobianos: ampicilina, amoxicilina-ácido clavulánico, ácido nalidíxico, tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxazol, cloranfenicol, gentamicina, amikacina, espectinomicina, imipenem, norfloxacino, ciprofloxacino y ceftazidima. La interpretación de los resultados se llevó a cabo según las normas del CLSI. Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 se utilizaron como cepas controles.Para determinar los mecanismos moleculares de resistencia a quinolonas se detectaron las mutaciones en los genes gyrA y parC mediante la técnica de PCR con iniciadores específicos. La presencia de los genes cmlA y floR asociados con la resistencia a cloranfenicol se determinó por PCR. La actividad cloranfenicol acetiltransferasa se determinó mediante un ensayo colorimétrico. La detección de los genes que codifican para beta-lactamasas (tipo tem, carb, shv, y oxa) así como la determinación de los mecanismos de resistencia a tetraciclina relacionados con la presencia de los genes tetA, tetB y tetG también fue determinada por PCR. Para determinar el mecanismo de resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol la presencia de dihidrofolato reductasas fue determinada con primers genéricos y análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción. La detección de integrones Clase 1 también se determinó utilizando primes específicos ya descritos.Los productos de las diferentes PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 2%. El producto de la PCR visualizado en el gel fue secuenciado y analizado en un secuenciador automático usando el kit de secuenciación Big Dye3.1.La clonalidad de los aislamientos se determinó mediante análisis del ADN cromosómico digerido con XbaI y separación en electroforesis en campo pulsante.RESULTADOS:Los serotipos más frecuentes fueron Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium. La mayoría de las cepas mostraron resistencia al menos a uno de los agentes antimicrobianos utilizados, encontrándose un alto porcentaje de multirresistencia. Los antibióticos frente a los cuales se observó mayor resistencia fueron: tetraciclina, ampicilina, cloranfenicol, ácido nalidíxico y trimetoprim-sulfametoxazol. Una simple sustitución de aminoácidos en las posiciones 83 y 87 del gen gyrA ha sido descrita con anterioridad como causa de resistencia frente al ácido nalidíxico, mientras que sustituciones en ambas posiciones más sustituciones en el gen parC confieren elevada resistencia a fluoroquinolonas. En nuestro estudio se encontró resistencia al ácido nalidíxico y sensibilidad disminuida a ciprofloxacino y norfloxacino. Destacándose como principal causa de esta resistencia mutaciones en el gen gyrA. No se encontraron mutaciones en el gen parC. Ocho aislamientos mostraron resistencia a ampicilina provocada por la presencia de beta-lactamasas tipo CARB, TEM y OXA. Es algunas cepas productoras de beta-lactamasas tipo TEM también se encontraron niveles intermedios de sensibilidad a amoxicilina-ácido clavulánico. Está demostrado que la sobreexpresión de estas enzimas provoca sensibilidad disminuida o resistencia frente a este antibiótico.El principal mecanismo de resistencia involucrado en la resistencia al trimetoprim-sulfametoxazol fue la presencia de dihidrofolato reductasas presentes en cuatro aislamientos, específicamente dfrA1, dfrA12, dfrA14 y dfrA17. La resistencia al cloranfenicol estuvo determinada por la presencia de los genes cmlA, floR y la actividad cloranfenicol acetil transferasa (CAT). De los aislamientos resistentes a tetraciclina, el gen tetA fue el principal responsable de la resistencia. Los genes de resistencia localizados en integrones fueron asociados con resistencia a aminoglucosidos, beta-lactamasas, trimetoprim y cloranfenicol. El campo pulsante reveló la existencia y diseminación de un clon resistente de Salmonella typhimurium en diferentes regiones de Cuba.CONCLUSIONES:Nuestros resultados muestran niveles importantes de resistencia en cepas de Salmonella, principalmente frente al ácido nalidíxico, además de una gran heterogeneidad de mecanismos moleculares de resistencia frente a antibióticos de primera línea. A nuestro parecer con nuestro estudio contribuimos a mantener la vigilancia de esos microorganismos y así tener información de los niveles de resistencia para mejorar el tratamiento y desarrollar estrategias en la prevención de la diseminación de la resistencia.