Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:45Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10833.pdf: 1360435 bytes, checksum: a345766b88aa33fb633cad88c29a3a08 (MD5) / Conselho Nacional para o Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Introducao: A hiper-producao de AmpC associada a impermeabilidade de membrana externa em Enterobacter spp. pode contribuir no fenotipo de resistencia a cefalosporinas de quarta geracao e aos carbapenemicos. O objetivo do estudo foi caracterizar os mecanismos de resistencia a cefepima e a ertapenem em 11 amostras de E. cloacae subespecie cloacae isoladas de hemoculturas no Hospital sao Paulo. Materiais e Metodos: O perfil de sensibilidade foi avaliado por disco difusao e pela tecnica de diluicao em agar, de acordo com o CLSI. A analise das proteinas de membrana externa (OMPs) foi realizada pela tecnica de SDS-PAGE. A similaridade genetica foi avaliada pela tecnica de PFGE e o coeficiente similaridade entre os padroes de PFGE obtidos foi calculado pelo programa Bionumerics. Os isolados foram tambem testados contra cefepima, ertapenem, imipenem e meropenem na presenca e na ausencia dos inibidores de bomba de efluxo PAƒÀN (25 ƒÊg/ml) e reserpina (20 ƒÊg/ml), pela tecnica de diluicao em agar. Foram realizados testes de hidrolise, disco-aproximacao para a deteccao fenotipica de ESƒÀL e testes de inducao para a deteccao de AmpC induzida. A presenca de genes codificadores de ESƒÀL, carbapenemases e AmpC plasmidiais foram avaliados pela tecnica de PCR e confirmadas por sequenciamento, bem como a presenca de integrons. Os niveis de expressao de ampC, ompC e ompF foram medidos pela PCR em tempo real. Resultados: Todos os isolados de E. cloacae subespecie cloacae foram resistentes as cefalosporinas, aztreonam, associacoes com inibidores de ƒÀ-lactamases, tetraciclina, ciprofloxacina e amicacina por disco difusao. A tecnica de diluicao em agar demonstrou altas CIMs para cefotaxima (CIM50, > 256 ƒÊg/mL), ceftazidima (CIM50, 256 ƒÊg/mL) e cefepima (CIM50, 256 ƒÊg/mL). Todos os isolados foram sensiveis a imipenem (CIM50, 0.25 ƒÊg/mL) e meropenem (CIM50, 0.25 ƒÊg/mL). Entretanto, 7 isolados apresentaram CIMs de 4 ƒÊg/ml para ertapenem, 3 isolados foram resistentes (CIMs de 8 ƒÊg/ml) e um isolado foi sensivel (CIM de 2 ƒÊg/ml). Quatro padroes de PFGE foram encontrados entre os isolados de E. cloacae subespecie cloacae multirresistentes. Pelo programa Bionumerics, 3 clusters foram observados com coeficiente de similaridade acima de 80%. Todas as amostras foram positivas para ESƒÀL no teste de hidrolise e no disco aproximacao. Os resultados da PCR apresentaram amplificacao para blaTEM e blaCTX-M. Hiperexpressao do gene ampC foi detectado em todos os isolados pela qRT-PCR. Somente uma amostra apresentou uma pequena diminuicao da expressao de OmpC. Atraves do gel de SDS-PAGE foi observado um perda de uma proteina de 43 kDa quando comparado ao controle sensivel. Nenhuma reducao significativa nas CIMs para ƒÀ-lactamicos foi observado na presenca dos inibidores de bomba de efluxo. Conclusoes: Os resultados mostraram que a hiper-producao de AmpC associada a producao de ESBL sao os responsaveis pelos altos niveis de resistencia a cefepima e a perda de uma proteina de 43 kDa associada a hiper-producao de AmpC provavelmente foram os responsaveis pela diminuicao da sensibilidade a ertapenem verificada entre os isolados de E. cloacae subespecie cloacae. / Background: The overproduction of AmpC in Enterobacter spp. can contribute to resistance phenotype to fourth-generation cephalosporins and to carbapenens. The mechanisms of resistance to cefepime and ertapenem were studied among 11 E. cloacae subespecie cloacae clinical isolates from blood cultures isolated at Sao Paulo Hospital. Methods: Susceptibility testing by disk diffusion and agar dilution techniques was performed according to CLSI. Analysis of outer membrane protein (OMP) was performed by SDS-PAGE. The genetic relatedness was evaluated by PFGE and the dendogram was obtained by Bionumerics program. The isolates were also tested against cefepime, ertapenem, imipenem and meropenem with and without of PAƒÀN (25 ƒÊg/ml) and reserpine (20 ƒÊg/ml), an efflux pump inhibitors by agar dilution. Genes for ESƒÀLs, carbapenemases and plamidial AmpCs were screened by PCR and confirmed by sequencing. The expression level of ampC, ompC and ompF genes was measured by real time PCR (qRT-PCR). Results: All isolates were resistant to cephalosporins, aztreonam, ƒÀ-lactamases association inhibitors, tetraciclin, ciprofloxacin and amikacin, by disk diffusion. All isolates showed high resistant phenotype to cefotaxime (MIC50, > 256 ƒÊg/mL), ceftazidime (MIC50, 256 ƒÊg/mL), and cefepime (MIC50, 256 ƒÊg/mL) but they were susceptible to imipenem (MIC50, 0.25 ƒÊg/mL) and meropenem (MIC50, 0.25 ƒÊg/mL). Seven isolates showed ertapenem MICs of 4 ƒÊg/ml, while other three isolates showed MICs of 8 ƒÊg/ml and one isolate showed MIC of 2 ƒÊg/ml. Four clusters were founded by the Bionumerics program. The PCR results showed amplification for blaTEM and blaCTX-M. Hyperexpression of ampC was detected in all isolates by qRT-PCR. Only one sample showed a decreased in the OmpC expression. The loss of an OMP of 43 kDa was observed for all isolates in the SDS-PAGE technicque compared to the susceptible control. No significant reduction for â-lactam’s MICs was observed in the presence of PAâN. Conclusions: The results showed that the hyperproduction of AmpC coupled with ESBL production were responsible for the high resistant rates to cefepime. The hyperproduction of AmpC coupled with the loss of an OMP of 43 kDa is likely to be responsible for the reduced susceptibility to ertapenem in the E. cloacae subespecie cloacae isolates, which seems not to be associated with efflux systems. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações