Defeitos peroxissomais estão associados a diversas doenças complexas. O peroxissomo é responsável pela beta-oxidação de ácidos graxos, quando é gerado peróxido de hidrogênio. A catalase A, de ocorrência peroxissomal, é frequentemente considerada a única defesa antioxidante dessa organela, porém, em diversos organismos, a ausência dessa enzima não acarreta uma alteração fenotípica clara. Em Saccharomyces cerevisiae, linhagens mutantes deficientes em catalase A (Δcta1) apresentam viabilidade muito similar à linhagem selvagem correspondente. Trabalhamos com a hipótese de que peroxidases baseadas em cisteína compensam a ausência de catalase A, contribuindo para a detoxificação de peróxidos provenientes do peroxissomo. De fato, linhagens com os genes para as peroxirredoxinas Ahp1 e Tsa1 nocauteados mostraram-se mais sensíveis a hidroperóxido de terc-butila (tBHP) em comparação a linhagem selvagem. A linhagem de levedura deficiente nas cinco peroxirredoxinas (prxΔ) mostrou-se ainda mais sensível a tBHP. Em relação ao estresse induzido por peróxido de hidrogênio, a prxΔ apresentou maior sensibilidade do que as linhagens selvagem e mutantes com deleções simples, apesar da presença de catalases (peroxissomal e citossólica). Esses dados estão de acordo com resultados obtidos no nosso grupo demonstrando um aumento da expressão de genes referentes às peroxirredoxinas Ahp1, Prx1 e Tsa2 em células Δ cta1 crescidas em condições de alta atividade peroxissomal (oleato), indicando uma cooperação entre catalase e peroxirredoxinas na proteção antioxidante. A peroxirredoxina Ahp1 pode apresentar localização organelar (possivelmente mitocondrial ou peroxissomal), o que sugere que Ahp1 pode ser um componente relevante da defesa contra oxidantes provenientes do peroxissomo. No entanto, a linhagem Δ ahp1, normalmente sensível a peróxido orgânico, apresentou ganho de resistência na ausência de atividade de catalase (com a adição de ATZ e na linhagem duplo-mutante Δcta1/ahp1), indicando a existência de uma via antioxidante compensatória induzida pela ausência de catalase A. A construção das linhagens duplo-mutantes Δcta1/ahp1, Δcta1/tsa1, Δcta1/tsa2, Δ cta1/prx1 e Δcta1/dot5 foi realizada com o objetivo de investigar mecanismos compensatórios entre enzimas que podem proteger a levedura contra os oxidantes provenientes do peroxissomo. Para tanto, foram realizados ensaios de viabilidade comparativa em condições de alta atividade peroxissomal. Além disso, os níveis comparativos de proteínas carboniladas foram analisados nessas linhagens. Os resultados indicaram maior sensibilidade a peróxido e maiores níveis de danos oxidativos na linhagem Δcta1/tsa2, apontando a peroxirredoxina Tsa2 como candidata a importante componente da via antioxidante de compensação à ausência de catalase A. Nesses ensaios, também foram utilizadas a linhagem quíntupla mutante (prxΔ) e uma linhagem deficiente nas cinco peroxirredoxinas e três glutationa peroxidases - deficiente em oito tiól-peroxidases baseadas em cisteína (Δ8). A comparação das linhagens prxΔ e Δ8 com as linhagens selvagem, simples-mutantes e duplo-mutantes evidenciou a importância das peroxirredoxinas na defesa antioxidante da célula e o fato das tiól-peroxidases serem imprescindíveis em condições de estresse oxidativo. Ao examinar a expressão gênica de TSA2 em células crescidas em oleato, foi verificada a indução do gene na ausência de catalase A, em condição basal. Os resultados obtidos indicam a existência de uma eficiente via de defesa antioxidante, na qual estão envolvidas tiól-peroxidases, que compensa a ausência de catalase A na célula e que protege leveduras contra estresse induzido tanto por peróxido de hidrogênio como peróxido orgânico. A peroxirredoxina Tsa2 parece estar envolvida na via compensatória à ausência de catalase peroxissomal através de um mecanismo ainda não esclarecido / Defects in peroxisomes are associated with several complex diseases. Beta-oxidation of fatty acids takes place in these organelles, with the concomitant generation of hydrogen peroxide. Generally, it is assumed that peroxisomal catalase is the enzyme responsible for degradation of hydrogen peroxide, but in several organisms, deletion of its gene results in no clear phenotype. In Saccharomyces cerevisiae, catalase A- null (Δcta1) mutant strains exhibit very similar viability levels when compared with the corresponding wild-type strain. We hypothesized here that Cys-based peroxidases compensate the absence of catalase A, contributing to the detoxification of peroxides derived from the peroxisome. Indeed, null mutante strains for the peroxiredoxins Ahp1 and Tsa1 displayed increased sensitivity for tert-butylhydroperoxide (tBHP) in comparison to the wild type strain. Furthermore, a mutant strain whose five genes for peroxiredoxins were interrupted (prxΔ) was even more sensitive to tBHP. In regards to hydrogen peroxide insult, the prxΔ strain was more susceptible to oxidative stress than the single mutant and wild-type strains, despite the activity of catalases. These data are in agreement with previous results from our group demonstrating increased expression of genes encoding the three peroxiredoxin enzymes: Ahp1, Prx1 and Tsa2 in Δcta1 cells at high peroxisomal activity (media containing oleate). Indeed, a yeast strain deleted of all five peroxiredoxin genes is more sensitive to peroxides than the corresponding wild type cells. These results indicated that catalase and peroxiredoxins cooperate to protect yeast in conditions of high fatty acid intake. There are evidences of an organellar location of Ahp1 (possible peroxisomal or mitochondrial), suggesting it could be a relevant component of antioxidant defense relative to the insult derived from the peroxisome. Nonetheless, the ahp1-null strain (Δahp1), which is usually sensitive to organic peroxide, displayed a gain of resistance in the absence of catalase activity (in the presence of ATZ and in the double-mutant strain Δcta1/ahp1), indicating the existance of a compensatory antioxidant pathway induced in the absence of catalase A. The double-mutant strains Δcta1/ahp1, Δcta1/tsa1, Δcta1/tsa2, Δcta1/prx1 and Δcta1/dot5 were developed in order to elucidate the identity of the enzymes that cooperate to protect yeast against oxidative insult derived from the peroxisome. To this end, comparative viability assays in conditions of high peroxisomal activity were realised, as well as assays in comparative total protein carbonyl levels. Among the double-mutant strains, Δcta1/tsa2 displayed higher sensibility to peroxide and higher levels of oxidative damage, suggesting that the peroxiredoxin Tsa2 may be an important component in the antioxidant pathway that compensates the lack of catalase A. In addition, a quintuple mutant strain, lacking all peroxiredoxins, and a mutant strain lacking all eight Cys-based, thiol peroxidases were used in these assays. The comparison of these strains with the wild-type, single-mutant and double-mutant strains demonstrated the importance of peroxiredoxins in the cellular antioxidant defence and that thiol-peroxidases are vital in conditions of oxidative stress. The expression of the TSA2 was induced in the absence of catalase A in cells grown in oleate and with no exogenous oxidants. The results suggest the existence of an efficient pathway of antioxidant defense, involving thiol-peroxidases, which compensates the absence of catalase A in the cell and protects yeast against oxidative stress induced by both hydrogen peroxide and organic peroxide. The peroxiredoxin Tsa2 may be involved in the antioxidant pathway that compensates the absence of peroxisomal catalase through an unknown mechanism.

Defeitos peroxissomais estão associados a diversas doenças complexas. O peroxissomo é responsável pela beta-oxidação de ácidos graxos, quando é gerado peróxido de hidrogênio. A catalase A, de ocorrência peroxissomal, é frequentemente considerada a única defesa antioxidante dessa organela, porém, em diversos organismos, a ausência dessa enzima não acarreta uma alteração fenotípica clara. Em Saccharomyces cerevisiae, linhagens mutantes deficientes em catalase A (Δcta1) apresentam viabilidade muito similar à linhagem selvagem correspondente. Trabalhamos com a hipótese de que peroxidases baseadas em cisteína compensam a ausência de catalase A, contribuindo para a detoxificação de peróxidos provenientes do peroxissomo. De fato, linhagens com os genes para as peroxirredoxinas Ahp1 e Tsa1 nocauteados mostraram-se mais sensíveis a hidroperóxido de terc-butila (tBHP) em comparação a linhagem selvagem. A linhagem de levedura deficiente nas cinco peroxirredoxinas (prxΔ) mostrou-se ainda mais sensível a tBHP. Em relação ao estresse induzido por peróxido de hidrogênio, a prxΔ apresentou maior sensibilidade do que as linhagens selvagem e mutantes com deleções simples, apesar da presença de catalases (peroxissomal e citossólica). Esses dados estão de acordo com resultados obtidos no nosso grupo demonstrando um aumento da expressão de genes referentes às peroxirredoxinas Ahp1, Prx1 e Tsa2 em células Δ cta1 crescidas em condições de alta atividade peroxissomal (oleato), indicando uma cooperação entre catalase e peroxirredoxinas na proteção antioxidante. A peroxirredoxina Ahp1 pode apresentar localização organelar (possivelmente mitocondrial ou peroxissomal), o que sugere que Ahp1 pode ser um componente relevante da defesa contra oxidantes provenientes do peroxissomo. No entanto, a linhagem Δ ahp1, normalmente sensível a peróxido orgânico, apresentou ganho de resistência na ausência de atividade de catalase (com a adição de ATZ e na linhagem duplo-mutante Δcta1/ahp1), indicando a existência de uma via antioxidante compensatória induzida pela ausência de catalase A. A construção das linhagens duplo-mutantes Δcta1/ahp1, Δcta1/tsa1, Δcta1/tsa2, Δ cta1/prx1 e Δcta1/dot5 foi realizada com o objetivo de investigar mecanismos compensatórios entre enzimas que podem proteger a levedura contra os oxidantes provenientes do peroxissomo. Para tanto, foram realizados ensaios de viabilidade comparativa em condições de alta atividade peroxissomal. Além disso, os níveis comparativos de proteínas carboniladas foram analisados nessas linhagens. Os resultados indicaram maior sensibilidade a peróxido e maiores níveis de danos oxidativos na linhagem Δcta1/tsa2, apontando a peroxirredoxina Tsa2 como candidata a importante componente da via antioxidante de compensação à ausência de catalase A. Nesses ensaios, também foram utilizadas a linhagem quíntupla mutante (prxΔ) e uma linhagem deficiente nas cinco peroxirredoxinas e três glutationa peroxidases - deficiente em oito tiól-peroxidases baseadas em cisteína (Δ8). A comparação das linhagens prxΔ e Δ8 com as linhagens selvagem, simples-mutantes e duplo-mutantes evidenciou a importância das peroxirredoxinas na defesa antioxidante da célula e o fato das tiól-peroxidases serem imprescindíveis em condições de estresse oxidativo. Ao examinar a expressão gênica de TSA2 em células crescidas em oleato, foi verificada a indução do gene na ausência de catalase A, em condição basal. Os resultados obtidos indicam a existência de uma eficiente via de defesa antioxidante, na qual estão envolvidas tiól-peroxidases, que compensa a ausência de catalase A na célula e que protege leveduras contra estresse induzido tanto por peróxido de hidrogênio como peróxido orgânico. A peroxirredoxina Tsa2 parece estar envolvida na via compensatória à ausência de catalase peroxissomal através de um mecanismo ainda não esclarecido / Defects in peroxisomes are associated with several complex diseases. Beta-oxidation of fatty acids takes place in these organelles, with the concomitant generation of hydrogen peroxide. Generally, it is assumed that peroxisomal catalase is the enzyme responsible for degradation of hydrogen peroxide, but in several organisms, deletion of its gene results in no clear phenotype. In Saccharomyces cerevisiae, catalase A- null (Δcta1) mutant strains exhibit very similar viability levels when compared with the corresponding wild-type strain. We hypothesized here that Cys-based peroxidases compensate the absence of catalase A, contributing to the detoxification of peroxides derived from the peroxisome. Indeed, null mutante strains for the peroxiredoxins Ahp1 and Tsa1 displayed increased sensitivity for tert-butylhydroperoxide (tBHP) in comparison to the wild type strain. Furthermore, a mutant strain whose five genes for peroxiredoxins were interrupted (prxΔ) was even more sensitive to tBHP. In regards to hydrogen peroxide insult, the prxΔ strain was more susceptible to oxidative stress than the single mutant and wild-type strains, despite the activity of catalases. These data are in agreement with previous results from our group demonstrating increased expression of genes encoding the three peroxiredoxin enzymes: Ahp1, Prx1 and Tsa2 in Δcta1 cells at high peroxisomal activity (media containing oleate). Indeed, a yeast strain deleted of all five peroxiredoxin genes is more sensitive to peroxides than the corresponding wild type cells. These results indicated that catalase and peroxiredoxins cooperate to protect yeast in conditions of high fatty acid intake. There are evidences of an organellar location of Ahp1 (possible peroxisomal or mitochondrial), suggesting it could be a relevant component of antioxidant defense relative to the insult derived from the peroxisome. Nonetheless, the ahp1-null strain (Δahp1), which is usually sensitive to organic peroxide, displayed a gain of resistance in the absence of catalase activity (in the presence of ATZ and in the double-mutant strain Δcta1/ahp1), indicating the existance of a compensatory antioxidant pathway induced in the absence of catalase A. The double-mutant strains Δcta1/ahp1, Δcta1/tsa1, Δcta1/tsa2, Δcta1/prx1 and Δcta1/dot5 were developed in order to elucidate the identity of the enzymes that cooperate to protect yeast against oxidative insult derived from the peroxisome. To this end, comparative viability assays in conditions of high peroxisomal activity were realised, as well as assays in comparative total protein carbonyl levels. Among the double-mutant strains, Δcta1/tsa2 displayed higher sensibility to peroxide and higher levels of oxidative damage, suggesting that the peroxiredoxin Tsa2 may be an important component in the antioxidant pathway that compensates the lack of catalase A. In addition, a quintuple mutant strain, lacking all peroxiredoxins, and a mutant strain lacking all eight Cys-based, thiol peroxidases were used in these assays. The comparison of these strains with the wild-type, single-mutant and double-mutant strains demonstrated the importance of peroxiredoxins in the cellular antioxidant defence and that thiol-peroxidases are vital in conditions of oxidative stress. The expression of the TSA2 was induced in the absence of catalase A in cells grown in oleate and with no exogenous oxidants. The results suggest the existence of an efficient pathway of antioxidant defense, involving thiol-peroxidases, which compensates the absence of catalase A in the cell and protects yeast against oxidative stress induced by both hydrogen peroxide and organic peroxide. The peroxiredoxin Tsa2 may be involved in the antioxidant pathway that compensates the absence of peroxisomal catalase through an unknown mechanism.

As partículas eliminadas na exaustão do diesel (DEP) são importantes fontes diárias de partículas inaladas, responsáveis por gerar espécies reativas de oxigênio no sistema respiratório, fazendo com que as células ativem mecanismos de defesa, como o sistema Keap1-Nrf2 e a autofagia. Para investigar o papel do Nrf2 no processo de autofagia induzida pelas DEPs, BEAS-2B foram expostas às DEP, coletadas diretamente de um motor a diesel. BEAS-2B foram tratadas com sulforafano, bafilomicina e EBSS para testar a relação entre as vias autofágica e antioxidante. A quantidade relativa de mRNA foi verificada por RT-PCR para os seguintes genes: Nrf2, NQO1, HO-1, p62, Atg5 e LCB3. A seguir, BEAS-2B foram transfectadas com RNA silenciador (siRNA) para Nrf2, expostas ou não às DEPs (10 e 50 micro g/mL por 1h e 2 h), e mRNA detectado por RT-PCR e Western blot para proteínas. Bafilomicina (inibidor de autofagia) mostrou uma diminuição significativa nos marcadores antioxidantes Nrf2 (p = 0,024), HO-1 (p = 0,002) e NQO1 (p = 0,003), enquanto sulforafano (ativador de Nrf2) aumentou os marcadores autofágicos LC3B (p = 0,004) e Atg5 (p = 0,007). BEAS-2B expostas às DEP na concentração de 50 micro g/mL por 2hs mostraram um aumento significativo nos genes autofágicos LC3B (p = 0,018) e p62 (p = 0,007) e nos genes da via antioxidante Nrf2 (p = 0,007) e NQO1 (p = 0,025). Houve uma diminuição significativa no mRNA de LC3B (p < 0,001), p62 (p = 0,001) e Atg5 (p = 0,024) nas células transfectadas com siRNA, expostas ou não à DEP. Western blotting mostrou uma redução das proteínas Nrf2, p62 e LC3II nas BEAS-2B siRNA, indicando que a exposição ao silenciamento de Nrf2 modificou a expressão de marcadores de autofagia (R < 1). Os resultados deste estudo mostram que, em células brônquicas expostas às DEP, o sistema Nrf2 e a autofagia trabalham em conjunto para tentar manter a homeostase celular / Diesel Exhaust Particles (DEPs) are main sources of daily inhaled particles, responsible for generating reactive oxygen species in the respiratory system, and causing the cells to activate defense mechanisms, such as the Keap1-Nrf2 system and autophagy. In order to investigate the role of Nrf2 in Dep-induced autophagy, BEAS-2B cells collected directly from a diesel engine were exposed to DEP and treated with sulforaphane, bafilomycin and BESS to test the relationship between autophagic and antioxidant pathways. The relative amount of mRNA was verified by RT-PCR for the following genes: Nrf2, NQO1, HO-1, p62, Atg5 and LCB3. Next, BEAS-2B cells were transfected with silencer RNA (siRNA) specific to Nrf2, exposed or not to DEPs (10 and 50 micro g/mL 1h and 2hs), and mRNA detected by RT-PCR and Western blotting for protein. Bafilomycin ( autophagy inhibitor) showed a significant decrease in the antioxidant markers Nrf2 (p=0.024), HO-1 (p = 0.002) and NQO1 (p = 0.003), whereas sulforaphane (Nrf2 activator) increased the expression levels of autophagic markers LC3B (p=0.004) and Atg5 (p=0.007). BEAS-2B exposed to DEP at a concentration of 50 micro g/mL for 2hs showed a significant increase in autophagic genes LC3B (p=0.018) and p62 (p=0.007),and in the antioxidant pathway markers Nrf2 (p=0.007) and NQO1 (p=0.025). There was a significant decrease in mRNA of the LC3B (p < 0.001), p62 (p=0.001) and Atg5 (p=0.024) in cells transfected with siRNA, exposed or not to DEP. Western blotting showed a reduction of Nrf2, p62 and LC3II proteins in BEAS-2B transfected with siRNA, indicating that Nrf2 silencedexposed to DEP modulated the expression of autophagy markers (R < 1). The results of this study show that, in bronchial cells exposed to DEP, the Nrf2 system and autophagy work together in order to try to maintain cellular homeostasis

As partículas eliminadas na exaustão do diesel (DEP) são importantes fontes diárias de partículas inaladas, responsáveis por gerar espécies reativas de oxigênio no sistema respiratório, fazendo com que as células ativem mecanismos de defesa, como o sistema Keap1-Nrf2 e a autofagia. Para investigar o papel do Nrf2 no processo de autofagia induzida pelas DEPs, BEAS-2B foram expostas às DEP, coletadas diretamente de um motor a diesel. BEAS-2B foram tratadas com sulforafano, bafilomicina e EBSS para testar a relação entre as vias autofágica e antioxidante. A quantidade relativa de mRNA foi verificada por RT-PCR para os seguintes genes: Nrf2, NQO1, HO-1, p62, Atg5 e LCB3. A seguir, BEAS-2B foram transfectadas com RNA silenciador (siRNA) para Nrf2, expostas ou não às DEPs (10 e 50 micro g/mL por 1h e 2 h), e mRNA detectado por RT-PCR e Western blot para proteínas. Bafilomicina (inibidor de autofagia) mostrou uma diminuição significativa nos marcadores antioxidantes Nrf2 (p = 0,024), HO-1 (p = 0,002) e NQO1 (p = 0,003), enquanto sulforafano (ativador de Nrf2) aumentou os marcadores autofágicos LC3B (p = 0,004) e Atg5 (p = 0,007). BEAS-2B expostas às DEP na concentração de 50 micro g/mL por 2hs mostraram um aumento significativo nos genes autofágicos LC3B (p = 0,018) e p62 (p = 0,007) e nos genes da via antioxidante Nrf2 (p = 0,007) e NQO1 (p = 0,025). Houve uma diminuição significativa no mRNA de LC3B (p < 0,001), p62 (p = 0,001) e Atg5 (p = 0,024) nas células transfectadas com siRNA, expostas ou não à DEP. Western blotting mostrou uma redução das proteínas Nrf2, p62 e LC3II nas BEAS-2B siRNA, indicando que a exposição ao silenciamento de Nrf2 modificou a expressão de marcadores de autofagia (R < 1). Os resultados deste estudo mostram que, em células brônquicas expostas às DEP, o sistema Nrf2 e a autofagia trabalham em conjunto para tentar manter a homeostase celular / Diesel Exhaust Particles (DEPs) are main sources of daily inhaled particles, responsible for generating reactive oxygen species in the respiratory system, and causing the cells to activate defense mechanisms, such as the Keap1-Nrf2 system and autophagy. In order to investigate the role of Nrf2 in Dep-induced autophagy, BEAS-2B cells collected directly from a diesel engine were exposed to DEP and treated with sulforaphane, bafilomycin and BESS to test the relationship between autophagic and antioxidant pathways. The relative amount of mRNA was verified by RT-PCR for the following genes: Nrf2, NQO1, HO-1, p62, Atg5 and LCB3. Next, BEAS-2B cells were transfected with silencer RNA (siRNA) specific to Nrf2, exposed or not to DEPs (10 and 50 micro g/mL 1h and 2hs), and mRNA detected by RT-PCR and Western blotting for protein. Bafilomycin ( autophagy inhibitor) showed a significant decrease in the antioxidant markers Nrf2 (p=0.024), HO-1 (p = 0.002) and NQO1 (p = 0.003), whereas sulforaphane (Nrf2 activator) increased the expression levels of autophagic markers LC3B (p=0.004) and Atg5 (p=0.007). BEAS-2B exposed to DEP at a concentration of 50 micro g/mL for 2hs showed a significant increase in autophagic genes LC3B (p=0.018) and p62 (p=0.007),and in the antioxidant pathway markers Nrf2 (p=0.007) and NQO1 (p=0.025). There was a significant decrease in mRNA of the LC3B (p < 0.001), p62 (p=0.001) and Atg5 (p=0.024) in cells transfected with siRNA, exposed or not to DEP. Western blotting showed a reduction of Nrf2, p62 and LC3II proteins in BEAS-2B transfected with siRNA, indicating that Nrf2 silencedexposed to DEP modulated the expression of autophagy markers (R < 1). The results of this study show that, in bronchial cells exposed to DEP, the Nrf2 system and autophagy work together in order to try to maintain cellular homeostasis