Interaktionen von Zellen mit der Extrazellulären Matrix (ECM) sind entscheidend für die normgerechte Entwicklung und Funktion des Organismus. Die Modulation der Zellmatrixinteraktion erfolgt durch proteolytische Systeme, die Bestandteile der ECM abbauen. Das betrifft physiologische und pathologische Prozesse wie beispielsweise Veränderungen der ECM im Rahmen von Augenerkrankungen. Die diabetische Retinopathie und altersabhängige Makuladegeneration (AMD) gehören zu den häufigsten Erblindungsursachen. In der Pathogenese dieser Erkrankungen spielt die pathologische Neubildung von Gefäßen (Neovaskularisation) eine entscheidende Rolle. Der Umbau der ECM, welcher insbesondere durch die Wirkung von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) erfolgt, stellt einen Schlüsselschritt bei Neovaskularisationen dar. Durch ihre Fähigkeit, die Aktivität von MMPs zu hemmen, sorgen TIMPs (Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase) für das sensible Gleichgewicht zwischen Gewebe-abbauenden und -aufbauenden Prozessen. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Bildung von MMPs durch retinale Pigmentepithel (RPE) -Zellen und retinale Endothel (RE) -Zellen sowie deren Regulation durch verschiedene Zytokine. In experimentellen Untersuchungen wurden insbesondere MMP-2 und MMP-9 näher betrachtet. Mittels Zymographie wurde zunächst die Sekretion von MMPs durch RPE-Zellen demonstriert. Nach Stimulation der Zellen durch verschiedene Zytokine/Mediatoren, d.h., in RPE-Zellen durch Tumornekrosefaktor (TNF)-α, in RE-Zellen durch Transforming Growth Factor (TGF)-β, Pigment Epithelium Derived Factor (PEDF) und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), konnte ein Trend in Richtung einer Förderung der Produktion von MMP-2 und MMP-9 beobachtet werden. Außerdem gelang der Nachweis einer TNF-α-stimulierten Sekretion von TIMP-2 durch RPE-Zellen mittels Westernblot-Analyse.

Bei der proliferativen Retinopathie (PVR) kommt es aufgrund einer Netzhautablösung zu einer Störung der Blut-Retina-Schranke. Durch die daraus resultierende Milieuänderung wandern retinale Zellen und Bestandteile des Blutes in den Glaskörper ein. Wachstumsfaktoren regen die mitotisch inaktiven RPE-Zellen zur Migration und Proliferation an. Im weiteren Verlauf der Erkrankung führt dies zur Ausbildung von Traktionsmembranen und zur Ablösung der Netzhaut. Die dadurch entstehenden Zugkräfte verhindern eine Wiederanlegung der Netzhaut. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, welchen Einfluss Wachstumsfaktoren und deren Kombinationen auf die Proliferation und Migration humaner retinaler Pigmentepithelzellen, die VEGF-Sekretion durch RPE-Zellen und die mRNA-Expression von Kollagenen haben. Die beteiligten Signalwege sollten ebenfalls ermittelt werden. Im Ergebnis sollten Faktoren identifiziert werden, die die Entstehung einer PVR begünstigen. Migration, Proliferation, VEGF-Sekretion und die TGF-ß-Sekretion konnten durch den Wachstumsfaktor PDGF (Platelet-derived growth factor) gesteigert werden. Die Wirkung des PDGF-Signals wurde durch die Aktivierung verschiedener intrazellulärer Signalwege (MAPK, p38MAPK, PI3K/AKT) vermittelt. PDGF wirkte hemmend auf die Kollagen mRNA-Expression. Für TGF-ß (Transforming growth factor-ß) wurde eine hemmende Wirkung auf die Proliferation und eine induzierende Wirkung auf die Kollagensynthese nachgewiesen. Beide Faktoren – PDGF und TGF-ß – steigerten die VEGF-Sekretion. Eine additive Erhöhung der VEGF-Sekretion wurde durch die Kombination beider Faktoren nachgewiesen. Die untersuchten Wachstumsfaktoren interagieren mit den humanen retinalen Pigmentepithelzellen und tragen somit maßgeblich zur Ausbildung und auch zur Beschleunigung des Verlaufs der proliferativen Retinopathie sowie der pathologischen Gefäßneubildung bei.

Interaktionen von Zellen mit der Extrazellulären Matrix (ECM) sind entscheidend für die normgerechte Entwicklung und Funktion des Organismus. Die Modulation der Zellmatrixinteraktion erfolgt durch proteolytische Systeme, die Bestandteile der ECM abbauen. Das betrifft physiologische und pathologische Prozesse wie beispielsweise Veränderungen der ECM im Rahmen von Augenerkrankungen. Die diabetische Retinopathie und altersabhängige Makuladegeneration (AMD) gehören zu den häufigsten Erblindungsursachen. In der Pathogenese dieser Erkrankungen spielt die pathologische Neubildung von Gefäßen (Neovaskularisation) eine entscheidende Rolle. Der Umbau der ECM, welcher insbesondere durch die Wirkung von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) erfolgt, stellt einen Schlüsselschritt bei Neovaskularisationen dar. Durch ihre Fähigkeit, die Aktivität von MMPs zu hemmen, sorgen TIMPs (Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase) für das sensible Gleichgewicht zwischen Gewebe-abbauenden und -aufbauenden Prozessen. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Bildung von MMPs durch retinale Pigmentepithel (RPE) -Zellen und retinale Endothel (RE) -Zellen sowie deren Regulation durch verschiedene Zytokine. In experimentellen Untersuchungen wurden insbesondere MMP-2 und MMP-9 näher betrachtet. Mittels Zymographie wurde zunächst die Sekretion von MMPs durch RPE-Zellen demonstriert. Nach Stimulation der Zellen durch verschiedene Zytokine/Mediatoren, d.h., in RPE-Zellen durch Tumornekrosefaktor (TNF)-α, in RE-Zellen durch Transforming Growth Factor (TGF)-β, Pigment Epithelium Derived Factor (PEDF) und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), konnte ein Trend in Richtung einer Förderung der Produktion von MMP-2 und MMP-9 beobachtet werden. Außerdem gelang der Nachweis einer TNF-α-stimulierten Sekretion von TIMP-2 durch RPE-Zellen mittels Westernblot-Analyse.

Bei der proliferativen Retinopathie (PVR) kommt es aufgrund einer Netzhautablösung zu einer Störung der Blut-Retina-Schranke. Durch die daraus resultierende Milieuänderung wandern retinale Zellen und Bestandteile des Blutes in den Glaskörper ein. Wachstumsfaktoren regen die mitotisch inaktiven RPE-Zellen zur Migration und Proliferation an. Im weiteren Verlauf der Erkrankung führt dies zur Ausbildung von Traktionsmembranen und zur Ablösung der Netzhaut. Die dadurch entstehenden Zugkräfte verhindern eine Wiederanlegung der Netzhaut. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, welchen Einfluss Wachstumsfaktoren und deren Kombinationen auf die Proliferation und Migration humaner retinaler Pigmentepithelzellen, die VEGF-Sekretion durch RPE-Zellen und die mRNA-Expression von Kollagenen haben. Die beteiligten Signalwege sollten ebenfalls ermittelt werden. Im Ergebnis sollten Faktoren identifiziert werden, die die Entstehung einer PVR begünstigen. Migration, Proliferation, VEGF-Sekretion und die TGF-ß-Sekretion konnten durch den Wachstumsfaktor PDGF (Platelet-derived growth factor) gesteigert werden. Die Wirkung des PDGF-Signals wurde durch die Aktivierung verschiedener intrazellulärer Signalwege (MAPK, p38MAPK, PI3K/AKT) vermittelt. PDGF wirkte hemmend auf die Kollagen mRNA-Expression. Für TGF-ß (Transforming growth factor-ß) wurde eine hemmende Wirkung auf die Proliferation und eine induzierende Wirkung auf die Kollagensynthese nachgewiesen. Beide Faktoren – PDGF und TGF-ß – steigerten die VEGF-Sekretion. Eine additive Erhöhung der VEGF-Sekretion wurde durch die Kombination beider Faktoren nachgewiesen. Die untersuchten Wachstumsfaktoren interagieren mit den humanen retinalen Pigmentepithelzellen und tragen somit maßgeblich zur Ausbildung und auch zur Beschleunigung des Verlaufs der proliferativen Retinopathie sowie der pathologischen Gefäßneubildung bei.

Schädigungen des retinalen Pigmentepithels spielen bei der Pathogenese der altersbedingten Makuladegeneration eine Schlüsselrolle. Oxidativer Stress und Komplementaktivierung tragen zur Degeneration des retinalen Pigmentepithels (RPE) und somit zum Tod von Photorezeptoren im Bereich der Makula bei. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von oxidativem Stress auf humane retinale Pigmentepithel-(RPE-) Zellen in vitro untersucht. Die Viabilität, Nekrose- und Apoptoserate der Zellen wurde unter dem Einfluss von Serumfaktoren oder antioxidativen Wirkstoffen analysiert. Steigender oxidativer Stress, experimentell ausgelöst durch steigende H2O2-Konzentrationen, war mit einer verminderten Viabilität bzw. erhöhten Nekrose-/Apoptoserate der humanen RPE-Zellen verbunden. Es zeigte sich, dass sowohl Serum (FKS), als auch Substanzen, die als Antioxidans (NAC) oder Radikalfänger (MnTBAP) wirken, bei einer H2O2-Konzentration bis 2 mM einen protektiven Effekt auf das Überleben der Zellen hatten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass humane RPE-Zellen auf H2O2-Konzentrationen bis zu 0,5 mM mit zunehmender Freisetzung der Komplementkomponente C5a reagieren. Diese Ergebnisse erlauben den Schluss, dass oxidativer Stress des RPE eine Komplementaktivierung begünstigt, die ihrerseits den zytolytischen Untergang von RPE-Zellen vorantreibt. Sowohl antioxidativ wirksame als auch komplementmodulierende Wirkstoffe wären demnach als therapeutischer Ansatz in der Behandlung der AMD denkbar. Weiterführende Studien sind zur Charakterisierung derartiger Substanzen erforderlich.:1 Einleitung 1.1 Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) 1.1.1 Definition 1.1.2 Prävalenz der AMD 1.1.3 Risikofaktoren der AMD 1.1.3.1 Genvarianten als prädisponierende Risikofaktoren der AMD 1.1.4 Formen der AMD 1.1.5 Physiologische Funktion von RPE-Zellen 1.2 Pathophysiologie 1.2.1 Pathophysiologische Rolle der RPE-Zellen bei der Entstehung von AMD 1.2.2 Entstehung von Drusen 1.2.3 Die Rolle des lokalen Komplementsystems im RPE-Choroidea-Komplex 1.2.4 Entstehung von choroidalen Neovaskularisationen 1.2.4.1 Die Rolle des Komplementsystems bei der Entstehung von CNV 1.3 Therapiemöglichkeiten der AMD 1.4 Das Komplementsystem 1.4.1 Der klassische Weg 1.4.2 Der alternative Weg 1.4.3 Der Lektinweg 1.4.4 Aktivierung über das C-reaktive Protein 1.4.5 Die Aufgaben von C3a, C4a und C5a 1.4.6 Aktivierung des Komplementsystems im Zusammenhang mit oxidativem Stress 1.5 Zielstellung der Arbeit 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Kulturmedien 2.1.2 Puffer 2.1.3 Chemikalien 2.1.4 Antikörper und Immunglobuline 2.1.5 Kits 2.1.6 Lösungen 2.1.7 Sonstiges 2.1.8 Verbrauchsmaterialien 2.1.9 Laborgeräte 2.2 Methoden 2.2.1 Allgemeine Verfahren beim Umgang mit einer Zellkultur 2.2.1.1 Herstellung des Kulturmediums für humane RPE-Zellen 2.2.1.2 Auftauen von Zellen 2.2.1.3 Mediumwechsel 2.2.1.4 Passagieren von humanen RPE-Zellen 2.2.1.5 Sterilfiltrieren von Flüssigkeiten 2.2.2 Vorbereitung der Experimente mit humanen RPE-Zellen 2.2.3 C5a - Assay 2.2.4 MTT-Test 2.2.4.1 MTT-Test mit oder ohne Zugabe von FKS 2.2.4.2 MTT-Test mit oder ohne Zugabe einer antioxidativ wirksamen Substanz 2.2.5 LDH-Bestimmung und Auszählung toter Zellen 2.2.6 BrdU-Apoptose-Assay 2.2.7 Statistische Auswertung 3 Ergebnisse 3.1 Einfluss von oxidativem Stress auf das Überleben von humanen RPE- Zellen 3.2 Einfluss von Additiven auf das durch oxidativen Stress beeinträchtigte Überleben humaner RPE-Zellen 3.2.1 Einfluss von Serumfaktoren und Dichte der Zellen auf das Überleben humaner RPE-Zellen 3.2.2 Einfluss von FKS 3.2.3 Einfluss von NAC 3.2.4 Einfluss von MnTBAP 3.3 Effekt von oxidativem Stress auf die Apoptose von humanen RPE-Zellen 3.4 Effekt von oxidativem Stress auf die Nekrose von humanen RPE-Zellen 3.5 Freisetzung von C5a nach Exposition von humanen RPE-Zellen gegenüber oxidativem Stress 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Literaturverzeichnis

Zu den bekannten Risikofaktoren der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), häufigste Erblindungsursache des Erwachsenen in den Industrienationen, gehören unter anderem die arterielle Hypertonie und/ oder eine hohe Kochsalzzufuhr, Zustände, die mit Gewebehypoxie und Hyperosmolarität einhergehen können. Die vorgelegte Arbeit beschäftigt sich mit der wichtigen Aufklärung von Veränderungen des neuroprotektiven Osteopontins (OPN) in humanen retinalen Pigmentepithelzellen (RPE-Zellen) durch unterschiedliche pathogene Faktoren. Osteopontin erbringt wichtige supportive Leistungen für die Photorezeptoren der Netzhaut, so die Bereitstellung von Nährstoffen und die Regeneration des Sehpigments. Sowohl unter hypoxischen- wie auch unter hyperosmolaren Versuchsbedingungen kam es zu einer gesteigerten OPN-Genexpression, wobei je nach Art des Stimulus, unterschiedliche Signaltransduktionswege engagiert wurden. Es konnten viele positive Einflüsse von Osteopontin auf RPE- Zellen und Photozeptoren gezeigt werden, die neue Therapiemöglichkeiten unter Einschluss protektiv wirkender Osteopontin-Peptide nahelegen.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einführung 1.1 Das retinale Pigmentepithel 1.2 Degenerative Erkrankungen der Netzhaut 1.2.1 Die altersbedingte Makuladegeneration 1.2.2 Risikofaktoren 1.2.3 Die Frühstadien der AMD 1.2.4 Die atrophe AMD 1.2.5 Die exsudative AMD 1.2.6 Therapie der AMD 1.3 Angiogener Wachstumsfaktor VEGF 1.4 Neuroprotektive Faktoren 1.4.1 GDNF 1.4.2 bFGF 1.4.3 Osteopontin (OPN) 2 Fragestellung 3 Material und Methoden 3.1 Arbeitsmaterialien 3.1.1 Substanzen 3.1.2 Pharmakologische Inhibitoren 3.1.3 Geräte und Materialien 3.1.4 Zellkulturmedien 3.1.5 Kits 3.1.6 Rekombinante Proteine 3.1.7 Primer für die PCR 3.2 Zellbiologische Methoden 3.2.1 Zellkultivierung 3.2.2 Zellstimulation 3.2.3 Transfektion mit siRNA 3.2.4 RNA Extraktion 3.2.5 Quantifizierung der RNA Menge 3.2.6 cDNA-Synthese 3.2.7 Real-Time-Polymerasekettenreaktion 3.2.8 Agarose-Gelelektrophorese 3.2.9 ELISA 3.2.10 Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Expression des Osteopontin-Gens bei humanen RPE-Zellen 4.2 Regulation der Osteopontin-Gen- und Proteinexpression 4.3 OPN-Genexpression - Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.3.1 Regulation der hyperosmolaren Genexpression von Osteopontin 4.3.2 Regulation der hypoxischen Genexpression von Osteopontin 4.4 Rolle des extrazellulären Signalings bei hyperosmolarer und hypoxischer OPN-Genexpression 4.4.1 Wachstumsfaktor-Rezeptoren 4.4.2 Purinerge Rezeptoren 4.5 Funktion der Transkriptionsfaktoraktivität 4.5 Wirkung von Osteopontin auf die Expression und Sekretion angiogener Faktoren bei RPE-Zellen 5 Diskussion 6 Zusammenfassung 7 Literaturverzeichnis 8 Abbildungsverzeichnis 9 Tabellenverzeichnis 10 Selbstständigkeitserklärung 11 Anlagen (Lebenslauf, Danksagung, Nachweis der Teilnahme an der Vorlesung 'Gute Wissenschaftliche Praxis“)