Bibliotecas de produtos naturais são fontes de moléculas com ações farmacológicas, com diversas aplicações biotecnológicas. Estes compostos apresentam alta especificidade para o alvo, resultante de longo processo de seleção natural, sendo interessantes como ferramentas de estudo e princípios ativos. Porém, apesar da riqueza de estruturas presentes em tais secreções, as dificuldades em obter moléculas puras em grandes quantidades, o alto custo e o tempo de purificação, tornam-se barreiras para seu uso. Assim, cada vez mais, as técnicas ômicas são usadas como uma alternativa para produção destas toxinas obtidas em maior escala. A transcriptômica, técnica que consiste na produção de biblioteca de cDNA a partir do RNA obtido da de organismo, tecido ou célula de interesse, é altamente relevante, já que identifica o material proteico que é realmente transcrito a partir do RNA obtido em determinado tempo e situação. Sapos ainda são animais pouco estudados, quando comparados a outros animais peçonhentos e venenosos, e um dos fatores responsáveis por isso é o baixo rendimento na purificação de toxinas de seu veneno. A fim de se identificar componentes presentes nas secreções do sapo R. schneideri, foi, primeiramente, realizada extração de RNA poli A+ das secreções recém obtidas das glândulas mucosas e das secreções armazenadas por 2 anos no laboratório. A secreção armazenada há dois anos revelou qualidade e quantidade mais apropriadas para o estudo e foi, portanto, usada como material de partida para a construção do transcriptoma por metodologia tradicional. Este transcriptoma resultou em 6 clones com boa qualidade, sendo que um deles, Rs02, apresentou similaridade com a região do pró peptídeo da odorranaina. Uma vez que este transcriptoma não revelou resultados satisfatórios devido à sua baixa eficiência e visando maximizar o conhecimento sobre a secreção, um novo transcriptoma foi construído usando sequenciamento de nova geração, com sequenciador Illumina e RNA total extraído do tegumento contendo glândulas mucosas de um espécime como material de partida. O novo transcriptoma resultou em aproximadamente 131 milhões de reads brutos. Os reads foram filtrados de modo que apenas aqueles com boa qualidade (Q>20) fossem submetidos à montagem de novo. Esta etapa resultou em aproximadamente 130 milhões de reads, com média de 68 pb. Os reads foram então agrupados em contigs usando o programa SOAPdenovo2-Trans e submetidos a diversas abordagens de anotação funcional. Foram encontrados cDNAs codificantes de diversos peptídeos e proteínas com potencial aplicação biotecnológica. Além da abordagem ômica, ensaios de caracterização bioquímica, como atividade enzimática, cromatografia e eletroforese, auxiliaram a detecção de protease sem relatos prévios em secreções de sapo, uma fosfolipase A2, bem como lectina e galectina. Adicionalmente, através do transcriptoma foram identificadas cobatoxinas, mucinas e ficolinas. Portanto, este trabalho foi pioneiro no entendimento molecular do veneno da glândula mucosa de R. schneideri por métodos de vanguarda e análises bioquímicas. / Natural products libraries are known as medicine molecules sources once these molecules have a high target specificity inherited from the long natural evolutionary process. Thereby, animal, plant and microorganisms\' secretions are very important to biotechnological applications. However, despite the large number of molecules that can be found in these secretions, the difficulty on obtainment enough purification yield, high cost and long purification time, besides the small secretion amount provided by the studied organism, are factors that make this kind of study even harsher. These are the reasons why omic studies are becoming an alternative to produce these toxins in a larger scale, which allow new researches. Transcriptome is a technique that consists on the production of cDNA libraries from the secretion or gland RNA, using the transcriptase reverse enzyme, which results in a holistic poison understanding. Toads are animals that are still not widely studied, if we compare them with other venomous animals, mainly because of the insufficient purification yield. Thus, the mucous gland transcriptome from Rhinella schneideri poison, a toad that is widely found in Brazilian territory, has a great relevance on the elucidation and possibility to use several kind of molecules, especially because this gland produces unknown molecules. Thereof, aiming to unravel this poison molecules, we first compared the RNA yield from fresh and two years stored mucous gland secretion. The stored secretion has shown more suitable RNA, which was used to construct a Sanger sequencing transcriptome. It resulted in 6 clones and one of them had a good hit with odorranain pro-peptide region. In order to increase the knowledge about the secretion, we turned to Next Generation Sequencing transcriptome using Illumina technologies and one specimen integument as raw material. The new transcriptome resulted in approximately 131 million raw reads. These reads were filtered so that only those with good quality (Q>20) were used to perform the assembling. The latter step resulted in approximately 130 million reads with 68 bp average length. The reads were grouped into contigs using the assembler. Then, the resulting contigs were submitted to different functional annotation approaches. We unraveled cDNAs encoding peptides and protein with biotechnological application. Besides the omic approach, assays for biochemical characterization including chromatography, electrophoresis and proteolytic assays complemented the identification of a protease for the first time in toad secretions, phospholipase A2, as much as lectins and galectins. Thus, the transcriptome also allowed the identification of cobatoxins, mucins and ficolins. Therefore, this is the first work about the molecular composition of Rhinella schneideri mucous gland poison through avant-garde methodology and biochemical anaylsis.

Toxinas animais sempre foram estudadas ao longo dos tempos por apresentarem um arsenal químico de moléculas com diversas funções biológicas. Estudos podem conduzir essas moléculas para serem aplicadas na geração de agentes terapêuticos e/ou de ferramentas experimentais para a pesquisa básica e aplicada, justificando sua purificação e análise funcional. Considerando que estudos de venenos de sapos são relevantes, por serem estes considerados uma boa fonte de toxinas que atuam sobre diferentes sistemas biológicos, os objetivos deste trabalho foram identificar a fração Rs5 do veneno de Rhinella schneideri e caracterizar suas ações farmacológicas e/ou toxicológicas no sistema nervoso central. O veneno de Rhinella schneideri foi inicialmente submetido à diálise o que resultou na fração de baixa massa molecular, que foi liofilizada e submetida a uma cromatografia de fase reversa em sistema CLAE em coluna C18. Das 5 frações majoritárias obtidas nesta cromatografia apenas a Rs5 foi utilizada para caracterização de neuroproteção devido aos resultados prévios do grupo. A Rs5 (2 e 4 ?g) se mostrou eficiente em proteger células neuronais quando submetidas à crises induzidas por pilocarpina. As frações Rs3, Rs4 e Rs5 e também a bufalina adquirida comercialmente (BAC) foram utilizadas para ensaios em transportadores de neurotransmissores dopamina (Rs5-IC50: 0,063 ± 0,014 ?M), serotonina (Rs5-IC50: 0,090 ± 0,065 ?M), norepinefrina (Rs5-IC50: 0,079 ± 0,097 ?M), glutamato, GABA (Rs5-IC50: 0,010 ± 0,010 ?M) e glicina (Rs5-IC50: 0,021 ± 0,015 ?M), nos quais demonstraram ações inibitórias ou estimulantes na recaptação. A fração Rs3 foi submetida a ensaios de inibição de crises convulsivas induzidas por PTZ e se mostrou parcialmente eficaz, porém em todos os animais houve aumento do tempo de latência para o desenvolvimento de crises. Na tentativa de se caracterizar um alvo para neuroproteção, ensaios com mitocôndrias isoladas foram realizados. Os resultados mostraram que não ocorre interferência na função mitocondrial em v baixas concentrações da Rs5 (1, 10 e 50 nM) indicando baixa toxicidade nestas doses. Baseando-se nos resultados de recaptação, ensaios comportamentais foram realizados demonstrando que a Rs3 e a Rs5 foram capazes de inibir ansiedade. Por fim, vale ressaltar que estes estudos são inéditos com moléculas do tipo heterosídeos cardiotônicos derivados de anfíbios, sendo pioneiros e relevantes para futuras pesquisas. / Animal toxins have been studied over the years because they present a chemical arsenal of molecules with diverse biological functions. Studies can lead these molecules to be applied in the generation of therapeutic agents and / or experimental tools for basic and applied research, justifying its purification and functional analysis. Whereas toads poisons studies are relevant, since these are considered a good source of toxins that act on different biological systems, the objectives of this study were to identify the Rs5 fraction isolated from Rhinella schneideri toad poison and characterize their pharmacological actions and / or toxicological in central nervous system. The poison of Rhinella schneideri was first submitted to dialysis, which resulted in the fraction of low molecular weight, which was lyophilized and subjected to reverse phase chromatography on HPLC C18 system. Among the majority five fractions obtained by chromatography, only Rs5 was used for characterization of neuroprotection due to previous results of the group. The Rs5 (2 e 4 ?g) proved to be efficient in protecting neuronal cells when subjected to seizures induced by pilocarpine. The fractions Rs3, Rs4 and Rs5 and also bufalin purchased commercially (BAC) were used for testing transporters of neurotransmitters dopamine (Rs5-IC50: 0,063 ± 0,014 ?M), serotonin (Rs5-IC50: 0,090 ± 0,065 ?M), norepinephrine (Rs5-IC50: 0,079 ± 0,097 ?M), glutamate, GABA (Rs5-IC50: 0,010 ± 0,010 ?M) and glycine (Rs5-IC50: 0,021 ± 0,015 ?M), in which they demonstrated inhibitory or stimulating action on reuptake. The Rs3 fraction was subjected to assays of inhibition of seizures induced by PTZ test and proved to be partially effective, but in all animals showed significant increase in latency for the development of seizures. In an attempt to characterize a target for neuroprotection, tests with isolated mitochondria were performed. The results showed that no interference occurs on mitochondrial function at low concentrations of Rs5 (1, 10 e 50 nM) showing low toxicity at these doses. Based on the results of reuptake, behavioral assays were performed showing that Rs3 to Rs5 and were able to inhibit anxiety. Finally, it is important to emphasize that these studies are unprecedented using cardiotonic glycosides derived from amphibians, being pioneers and relevant for future research.

Toxinas animais sempre foram estudadas ao longo dos tempos por apresentarem um arsenal químico de moléculas com diversas funções biológicas. Estudos podem conduzir essas moléculas para serem aplicadas na geração de agentes terapêuticos e/ou de ferramentas experimentais para a pesquisa básica e aplicada, justificando sua purificação e análise funcional. Considerando que estudos de venenos de sapos são relevantes, por serem estes considerados uma boa fonte de toxinas que atuam sobre diferentes sistemas biológicos, os objetivos deste trabalho foram identificar a fração Rs5 do veneno de Rhinella schneideri e caracterizar suas ações farmacológicas e/ou toxicológicas no sistema nervoso central. O veneno de Rhinella schneideri foi inicialmente submetido à diálise o que resultou na fração de baixa massa molecular, que foi liofilizada e submetida a uma cromatografia de fase reversa em sistema CLAE em coluna C18. Das 5 frações majoritárias obtidas nesta cromatografia apenas a Rs5 foi utilizada para caracterização de neuroproteção devido aos resultados prévios do grupo. A Rs5 (2 e 4 ?g) se mostrou eficiente em proteger células neuronais quando submetidas à crises induzidas por pilocarpina. As frações Rs3, Rs4 e Rs5 e também a bufalina adquirida comercialmente (BAC) foram utilizadas para ensaios em transportadores de neurotransmissores dopamina (Rs5-IC50: 0,063 ± 0,014 ?M), serotonina (Rs5-IC50: 0,090 ± 0,065 ?M), norepinefrina (Rs5-IC50: 0,079 ± 0,097 ?M), glutamato, GABA (Rs5-IC50: 0,010 ± 0,010 ?M) e glicina (Rs5-IC50: 0,021 ± 0,015 ?M), nos quais demonstraram ações inibitórias ou estimulantes na recaptação. A fração Rs3 foi submetida a ensaios de inibição de crises convulsivas induzidas por PTZ e se mostrou parcialmente eficaz, porém em todos os animais houve aumento do tempo de latência para o desenvolvimento de crises. Na tentativa de se caracterizar um alvo para neuroproteção, ensaios com mitocôndrias isoladas foram realizados. Os resultados mostraram que não ocorre interferência na função mitocondrial em v baixas concentrações da Rs5 (1, 10 e 50 nM) indicando baixa toxicidade nestas doses. Baseando-se nos resultados de recaptação, ensaios comportamentais foram realizados demonstrando que a Rs3 e a Rs5 foram capazes de inibir ansiedade. Por fim, vale ressaltar que estes estudos são inéditos com moléculas do tipo heterosídeos cardiotônicos derivados de anfíbios, sendo pioneiros e relevantes para futuras pesquisas. / Animal toxins have been studied over the years because they present a chemical arsenal of molecules with diverse biological functions. Studies can lead these molecules to be applied in the generation of therapeutic agents and / or experimental tools for basic and applied research, justifying its purification and functional analysis. Whereas toads poisons studies are relevant, since these are considered a good source of toxins that act on different biological systems, the objectives of this study were to identify the Rs5 fraction isolated from Rhinella schneideri toad poison and characterize their pharmacological actions and / or toxicological in central nervous system. The poison of Rhinella schneideri was first submitted to dialysis, which resulted in the fraction of low molecular weight, which was lyophilized and subjected to reverse phase chromatography on HPLC C18 system. Among the majority five fractions obtained by chromatography, only Rs5 was used for characterization of neuroprotection due to previous results of the group. The Rs5 (2 e 4 ?g) proved to be efficient in protecting neuronal cells when subjected to seizures induced by pilocarpine. The fractions Rs3, Rs4 and Rs5 and also bufalin purchased commercially (BAC) were used for testing transporters of neurotransmitters dopamine (Rs5-IC50: 0,063 ± 0,014 ?M), serotonin (Rs5-IC50: 0,090 ± 0,065 ?M), norepinephrine (Rs5-IC50: 0,079 ± 0,097 ?M), glutamate, GABA (Rs5-IC50: 0,010 ± 0,010 ?M) and glycine (Rs5-IC50: 0,021 ± 0,015 ?M), in which they demonstrated inhibitory or stimulating action on reuptake. The Rs3 fraction was subjected to assays of inhibition of seizures induced by PTZ test and proved to be partially effective, but in all animals showed significant increase in latency for the development of seizures. In an attempt to characterize a target for neuroprotection, tests with isolated mitochondria were performed. The results showed that no interference occurs on mitochondrial function at low concentrations of Rs5 (1, 10 e 50 nM) showing low toxicity at these doses. Based on the results of reuptake, behavioral assays were performed showing that Rs3 to Rs5 and were able to inhibit anxiety. Finally, it is important to emphasize that these studies are unprecedented using cardiotonic glycosides derived from amphibians, being pioneers and relevant for future research.

Importantes estudos voltados para a análise das secreções de anfíbios fundamentam-se na grande quantidade de componentes biologicamente ativos presentes nas mesmas, tais como aminas biogênicas, esteróides, aminopolissacarídeos, glicosídeos, inibidores de proteases e diversos outros compostos, responsáveis pela complexa sintomatologia observada no envenenamento. O gênero Bufo apresenta diversas moléculas em suas excreções que podem ser divididas em categorias como aminas biogênicas, bufadienolídeos (bufogeninas), esteróides (bufotoxinas), alcalóides, peptídeos e proteínas. Marongio (2006) verificou que o veneno do sapo Bufo paracnemis, hoje classificado como Rhinella schneideri, apresenta componente ativo sobre a via clássica do sistema complemento (SC), necessitando de melhores estudos e caracterização. Os objetivos deste trabalho foram, portanto, o isolamento e caracterização química do componente do veneno de Rhinella schneideri responsável pelos efeitos observados sobre o sistema complemento. Para a purificação, o veneno foi inicialmente submetido a uma cromatografia catiônica (CM-Celulose-52), obtendo-se 7 frações denominadas C1, C2, C3, C4, C5, C6 e C7. A fração C1 foi cromatografada em resina aniônica (DEAE-SepharoseTM), resultando em 4 subfrações denominadas D1, D2, D3, e D4. A subfração D3 apresentou atividade sobre o sistema complemento e foi submetida a uma Gel Filtração (SephacrylTMS-200), fornecendo 5 subfrações denominadas S1, S2, S3, S4, e S5. As subfrações S2 e S5 induziram redução da atividade hemolítica das vias clássica/lectinas. Ambas apresentaram resultados positivos nos ensaios de migração de neutrófilos e imunoeletroforese bidimensional. No ensaio de capacidade geradora de SC5b-9, a subfração S2 apresentou maior significância frente as demais subfrações utilizadas. Visando esclarecer o mecanismo de ação das subfrações ativas sobre o sistema complemento, testes de determinação da atividade proteolítica ou inibitória de proteases (tripsina, quimotripsina e elastase) foram realizados. No entanto, nas concentrações utilizadas, as amostras não mostraram atividade proteolítica ou inibitória de protease. Os compostos isolados foram também submetidos ao sequenciamento amino-terminal inicial. Foi possível a identificação dos primeiros 15 aminoácidos da banda protéica majoritária do gel de poliacrilamida e 10 e 5 aminoácidos das subfrações S2 e S5, respectivamente. No entanto, os resultados de sequenciamento N-terminal apresentaram baixa confiabilidade, devido à baixa quantidade de material utilizada. Neste trabalho foram isolados e caracterizados dois compostos capazes de induzir a ativação do sistema complemento. Esta ação foi evidenciada, após exposição do soro humano normal às subfrações, por induzirem à formação do complexo SC5b-9 e aumentarem a migração de neutrófilos, provavelmente por induzirem a formação de fatores quimiotáticos. Este estudo permitiu avaliar melhor alguns componentes presentes na complexa mistura que é o veneno de Rhinella schneideri, que, no futuro, poderão se tornar ferramentas farmacológicas importantes para o estudo de diversas patologias relacionadas ao sistema complemento. / Important studies focused on amphibians secretions analysis are based on large amount of biologically active components present in them, such as biogenic amines, steroids, polysaccharide amine, glycosides, protease inhibitors and several other compounds, responsible for complex symptomatology observed in the envenomation by Bufo paracnemis. The genus Bufo presents several molecules in their excretions that can be divided into categories such as biogenic amines, bufadienolides (Bufogenin), steroids (Bufotoxins), alkaloids, peptides and proteins. Marongio (2006) found in one of his studies the toad poison of Bufo paracnemis, now classified as Rhinella schneideri, has an active component of the classical pathway of the complement system (SC), which needs further studies and characterization. The purification process of this study was accomplished through cation chromatography (CM-Cellulose-52), and seven fractions were obtained, called C1, C2, C3, C4, C5, C6 e C7. The fraction C1 was chromatographed on anion-exchange resin (DEAE- SepharoseTM) resulting in 4 subfractions referred to as D1, D2, D3, and D4. The subfraction D3 showed activity on complement system and was subjected to gel filtration (SephacrylTMS-200) giving 5 subfractions termed S1, S2, S3, S4, and S5. The subfractions S2 and S5 induced reduction of the hemolytic activity of the classical/lectin pathway. Both showed positive results in the assays of migration of neutrophils and bidimensional immunoelectrophoresis. In the assay of generating capacity of SC5b-9, the subfraction S2 presented greater significance when compared to the other used subfractions. Aiming to clarify the action mechanism of the active subfractions on the complement system, tests of determination of the proteolytic or inhibitory activity of proteases (trypsin, chymotrypsin and elastase) had been done. However, in the used concentrations, the samples had not shown proteolytic or inhibitory activity of protease. The isolated compounds also had been submitted to the initial amino-terminal sequence. The identification of the first 15 aminoacids of the major proteinic band of the polyacrylamide gel and 10 and 5 aminoacids of the subfractions S2 and S5 was possible, respectively. However, the sequence of N-terminal results had presented low trustworthiness, due to the low amount of used material. In this work, were isolated and characterized two capable compounds to induce the activation of the complement system. This action was evidenced, after exposition of the normal human serum to the subfractions, for inducing to the formation of the SC5b-9 complex and will increase the migration of neutrophils, probably because they can induce the formation of chemotactic factors. This study allowed a better evaluation of some components present in the complex mixture which is the poison of Rhinella schneideri, that, in the future, important pharmacological tools for the study of diverse pathologies related the complement system.

Toxinas animais são moléculas aplicáveis na geração de agentes terapêuticos e/ou de ferramentas experimentais para a pesquisa básica e aplicada, justificando sua purificação e análise funcional. Considerando que estudos de venenos de sapos são relevantes, por serem estes considerados uma boa fonte de toxinas que atuam sobre diferentes sistemas biológicos, os objetivos deste trabalho foram isolar toxinas presentes no veneno de Rinella schneideri e avaliar suas ações sobre a atividade da enzima Na+K+-ATPase e os sistemas nervosos central e periférico. O veneno de Rhinella schneideri foi inicialmente submetido a diferentes extrações resultando em quatro amostras. A AMOSTRA A, que apresenta apenas componentes de baixa massa molecular, foi a mais efetiva na redução da atividade da Na+K+-ATPase e foi, portanto, liofilizada e submetida a uma cromatografia de fase reversa em sistema CLAE em coluna C2C18. Das 5 frações majoritárias obtidas nesta cromatografia apenas as Rs3, Rs4 e Rs5 induziram uma redução concentração-dependente da atividade da Na+K+-ATPase, mostrando IC50% de 33,6 g, 47,7 g e 98,92 g, respectivamente. Estes resultados indicam que o veneno de R. schneideri apresenta pelo menos três substâncias capazes de inibir a Na+K+-ATPase. As frações Rs3, Rs4 e Rs5, foram submetidas à espectrometria de massa e revelaram massas moleculares de 403, 401 e 387 Da, provavelmente correspondentes à Telocinobufagina, Desacetilcinobufagina e Bufalina, respectivamente. Estes compostos mostraram também neuroproteção central muito relevante sobre crises convulsivas induzidas por PTZ (Pentilenotetrazol) e NMDA (n-metil-d-aspartato), sendo que a Rs5 foi a que causou maior neuroproteção. No entanto, estas mesmas frações apresentaram ação neurotóxica periférica, induzindo bloqueio da junção neuromuscular de pintainhos. Manifestações como alucinações, dormência, confusão mental também são observadas em envenenamentos por sapos, que podem ser induzidos por alcalóides presentes no veneno, o que justifica os estudos para a identificação dos mesmos. Neste trabalho confirmou-se a presença de ii alcalóides no veneno. No entanto, foram priorizados os estudos com as toxinas isoladas Rs3, Rs4 e Rs5, por apresentarem ações biológicas importantes. Concluindo, neste trabalho foram isolados 3 compostos de baixa massa molecular, denominados Rs3, Rs4 e Rs5, que são capazes de inibir a atividade da Na+K+- ATPase, bloquear a transmissão do impulso nervoso na junção neuromuscular de pintainhos e, principalmente a Rs5, proteger crises convulsivas induzidas por PTZ e NMDA. Estudos adicionais serão necessários para estabelecer a correlação entre estes efeitos e determinar o mecanismo de ação destas toxinas. / Animal toxins are molecules applicable in the generation of therapeutic agents and / or experimental tools for basic and applied research, justifying its purification and functional analysis. Whereas studies of poison toads are relevant, since these are considered a good source of toxins that act on different biological systems, the objectives of this work were to isolate toxins in the venom of Rinella schneideri and evaluate their actions on the Na+K+-ATPase activity and the central and peripheral nervous systems. The venom Rhinella schneideri was initially submitted to different extractions resulting in four samples. The SAMPLE A, with only low molecular mass components, was the most effective in reducing the activity of Na+K+-ATPase and was lyophilized and subjected to reverse phase chromatography in the HPLC system in C2C18 column. Five majority fractions were obtained from this chromatography and only Rs3, Rs4 and Rs5 induced a concentration-dependent reduction in activity of Na+K+-ATPase, showing IC50% 33.6 g, 47.7 g and 98.92 g, respectively. These results indicate that R. schneideri venom presents at least three substances that can inhibit the Na+K+-ATPase. Fractions Rs3, Rs4 and Rs5 were submitted to mass spectrometry assay showing molecular masses of 403, 401and 387 Da, probably corresponding to Telocinobufagin, Desacetylcinobufagin and Bufalin, respectively. These compounds also showed a very relevant central neuroprotection on seizures induced by PTZ (Pentylenetetrazole) and NMDA (N-methyl-d-aspartate), and the Rs5 caused the highest neuroprotection. However, these same fractions showed neurotoxicity on peripheral nervous system, inducing blockade of the neuromuscular junction of chicks. Manifestations such as hallucinations, numbness, mental confusion are also seen in poisoning by toads, which can be induced by alkaloids present in the venom, which justifies the studies for their identification. This work confirmed the presence of alkaloids in the venom. However, have been prioritized the studies with isolated toxins Rs3, Rs4 and Rs5, because they have important biological actions. In conclusion, in this study were isolated three compounds with iv low molecular mass, known as Rs3, Rs4 and Rs5, which are capable of inhibiting the activity of Na+K+-ATPase, blocking the nerve impulse transmission at the neuromuscular junction of chickens, and especially the Rs5 by protecting seizures induced by PTZ and NMDA. Additional studies are necessary to establish the correlation between these effects and determine the mechanism of action of these toxins.

Toxinas animais podem ser moléculas aplicáveis na geração de agentes terapêuticos e/ou de ferramentas para a pesquisa básica e aplicada. Recentemente, tem sido provado que medicamentos tradicionais chineses (TCM) compostos por substâncias extraídas de venenos de sapos são efetivos no tratamento de hepatocarcinoma e outros tipos de câncer. Desta forma, os objetivos deste estudo foram isolar toxinas do veneno do sapo Rhinella schneideri e avaliar suas ações antineoplásicas em diferentes linhagens celulares tumorais, além de avaliar a capacidade das toxinas em induzir instabilidade genômica (genotoxicidade e mutagenicidade). O veneno de Rhinella schneideri foi inicialmente submetido à diálise resultando na fração de baixa massa molecular (VRs), a qual foi submetida a uma cromatografia de fase reversa em coluna C18 em um sistema FPLC. Avaliou-se a citotoxicidade do VRs em linhagens celulares HL-60, HepG2, PC-12, B16F10, MCF-7, SKBr-3, L292 e em hepatócitos primários isolados de ratos Wistar, através do ensaio do MTT. Analisou-se também a influência do VRs em diversos parâmetros mitocondriais, através de experimentos realizados com mitocôndrias isoladas de fígados de rato. Adicionalmente, foram isoladas três toxinas do VRs, denominadas Rs1, Rs2 e Rs3, com as quais foram realizados ensaios de citotoxicidade com células tumorais HepG2 e hepatócitos primários, análise da dissipação do potencial de membrana mitocondrial, avaliação de indução de fragmentação nuclear, análise da distribuição do ciclo celular, ensaios de avaliação de apoptose/necrose utilizando anexina V (AV) e iodeto de propídeo (PI) e ativação das caspases 3, 8 e 9 por western blot. O VRs (0,01 - 1000 ?g/mL) foi citotóxico para quatro das seis linhagens tumorais estudas (B16F10, HepG2, HL-60 e Skbr-3), demonstrou interferir pouco na viabilidade de células não tumorais L929, e citotóxico para hepatócitos. O VRs não induz efeitos significativos nos parâmetros bioenergéticos e oxidativos das mitocôndrias isoladas de fígado de ratos sadios, o que é um indicativo que o VRs não induz efeito citotóxico a estas células através da via mitocondrial. Além disto, o VRs diminuiu o acúmulo de espécies reativas de oxigênio. Através da cromatografia de fase reversa foram isoladas três toxinas do VRs, dentre as quais duas (Rs1 e Rs3 [1-1000 nM]) demonstraram ser mais citotóxicas às células tumorais HepG2. Estas toxinas pouco ou nada interferiram na viabilidade celular de hepatócitos primários, característica extremamente importante para uma possível aplicação como agente antitumoral. Nos experimentos de dissipação do potencial de membrana mitocondrial vi e de fragmentação nuclear (características de células em apoptose) em células HepG2 ambas as toxinas se mostraram capazes de induzir a dissipação do potencial de membrana (de maneira concentração-dependente) e também causaram a condensação da cromatina e fragmentação nuclear. A análise da distribuição do ciclo celular em células HepG2 após o tratamento com Rs1 e Rs3 demonstrou que as toxinas induziram aumento da fase G2/M em menores concentrações (10- 50 nM), seguido de uma diminuição de células nesta fase e aumento em fase G0/G1 em maiores concentrações (100 - 1000 nM). A quantidade de células apoptóticas foi maior em concentrações maiores, porém não estabeleceu relação concentração-resposta. Os ensaios realizados com anexina V e PI, demonstram que ambas as toxinas são capazes de induzir as células HepG2 à morte, principalmente pelo processo de apoptose. Os ensaios de caspases 3, 8 e 9 confirmaram a ativação da apoptose tanto pela via intrínseca quanto pela via extrínseca. Os ensaios de mutagenicidade e genotoxicidade revelaram que ambas as toxinas não causaram danos ao DNA das células HepG2. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo indicam a seletividade dos efeitos citotóxicos das toxinas Rs1 e Rs3 pelas células tumorais HepG2, induzindo estas células à morte principalmente por apoptose, justificando o potencial uso destas duas toxinas em terapias antitumorais. / Animal toxins can be applicable in generating therapeutic agents and/or tools for basic and applied research. Recently, it has been proved that traditional Chinese medicines (TCM) consisting of substances extracted from toad poisons have marked effect in the treatment of hepatocellular carcinoma and other cancers. Thus, the objectives of this study were to isolate toxins from Rhinella schneideri toad poison and evaluate their antineoplastic effects in different tumor cell lines, and to evaluate the ability of toxins to induce genomic instability (genotoxicity and mutagenicity). The poison from Rhinella schneideri was initially submitted to dialysis resulting in the fraction of low molecular weight (VRs), which was subjected to reverse phase chromatography on C18 column in a FPLC system. The cytotoxicity of VRs was assessed in cell lines HL-60, HepG2, PC-12, B16F10, MCF-7, SKBR-3, L292 and primary hepatocytes isolated from Wistar rats through MTT assay. The influence of VRs in various mitochondrial parameters was also evaluated through experiments with mitochondrias isolated from rat liver. Additionally, three toxins were isolated from VRs, named Rs1, Rs2 and Rs3, and cytotoxicity assays with tumor cells HepG2 and primary hepatocytes were performed with them. The analysis of mitochondrial membrane potential dissipation, nuclear fragmentation-inducing, evaluation of the cell cycle distribution, analysis of apoptosis/necrosis using annexin V (AV) and propidium iodide (PI) and activation of caspase 3, 8 and 9 by western blot were also performed. The VRs (0,01 - 1000 ?g/mL) showed to be cytotoxic to four of the six tumor cell lines studied (B16F10, HepG2, HL-60 and SKBR-3), showed little interference with the viability of non-tumor cells L929, and showed to be cytotoxic to primary hepatocytes. It was also observed that the VRs did not induce significant effects on bioenergetic and oxidative parameters of isolated mitochondria, which is an indication that the VRs did not induce cytotoxic effect on these cells via mitochondrial pathway. In addition, the VRs have showed to reduce the accumulation of reactive oxygen species. Three toxins were isolated from VRs by reverse phase chromatography and two of them (Rs1 and Rs3 [1-1000 nM]) have shown to be more cytotoxic to tumor cells HepG2. These toxins cause only a small decrease in cell viability of primary hepatocytes, an extremely important feature for a possible antitumor action. The experiments of mitochondrial membrane potential dissipation and nuclear fragmentation (apoptosis characteristics) in HepG2 cells showed that both toxins were able to induce dissipation of the membrane potential (dose-dependent manner) and also caused chromatin condensation and nuclear fragmentation. Cell cycle distribution analysis in HepG2 cells after treatment with Rs1 and Rs3 showed increase in G2/M phase at lower concentrations (10 - 50 nM), followed by a reduction of cells in this phase and increase in the G0/G1 phase at viii higher concentrations (100 - 1000 nM). The amount of apoptotic cells was greater at higher concentrations but did not establish dose-response relation. Assays performed with annexin V and PI showed that both toxins are able to induce HepG2 cell death mainly by apoptosis. The assays of caspases 3, 8 and 9 confirmed the activation of apoptosis by both the intrinsic an extrinsic pathways. Mutagenicity and genotoxicity tests revealed that both toxins caused no damage to the DNA of HepG2 cells. Thus, the results of this study indicate the selective cytotoxic effect of toxins Rs1 and Rs3 by tumor cells HepG2, inducing these cells to death mainly by apoptosis, justifying the potential use of these two toxins in antitumor therapies.

Importantes estudos voltados para a análise das secreções de anfíbios fundamentam-se na grande quantidade de componentes biologicamente ativos presentes nas mesmas, tais como aminas biogênicas, esteróides, aminopolissacarídeos, glicosídeos, inibidores de proteases e diversos outros compostos, responsáveis pela complexa sintomatologia observada no envenenamento. O gênero Bufo apresenta diversas moléculas em suas excreções que podem ser divididas em categorias como aminas biogênicas, bufadienolídeos (bufogeninas), esteróides (bufotoxinas), alcalóides, peptídeos e proteínas. Marongio (2006) verificou que o veneno do sapo Bufo paracnemis, hoje classificado como Rhinella schneideri, apresenta componente ativo sobre a via clássica do sistema complemento (SC), necessitando de melhores estudos e caracterização. Os objetivos deste trabalho foram, portanto, o isolamento e caracterização química do componente do veneno de Rhinella schneideri responsável pelos efeitos observados sobre o sistema complemento. Para a purificação, o veneno foi inicialmente submetido a uma cromatografia catiônica (CM-Celulose-52), obtendo-se 7 frações denominadas C1, C2, C3, C4, C5, C6 e C7. A fração C1 foi cromatografada em resina aniônica (DEAE-SepharoseTM), resultando em 4 subfrações denominadas D1, D2, D3, e D4. A subfração D3 apresentou atividade sobre o sistema complemento e foi submetida a uma Gel Filtração (SephacrylTMS-200), fornecendo 5 subfrações denominadas S1, S2, S3, S4, e S5. As subfrações S2 e S5 induziram redução da atividade hemolítica das vias clássica/lectinas. Ambas apresentaram resultados positivos nos ensaios de migração de neutrófilos e imunoeletroforese bidimensional. No ensaio de capacidade geradora de SC5b-9, a subfração S2 apresentou maior significância frente as demais subfrações utilizadas. Visando esclarecer o mecanismo de ação das subfrações ativas sobre o sistema complemento, testes de determinação da atividade proteolítica ou inibitória de proteases (tripsina, quimotripsina e elastase) foram realizados. No entanto, nas concentrações utilizadas, as amostras não mostraram atividade proteolítica ou inibitória de protease. Os compostos isolados foram também submetidos ao sequenciamento amino-terminal inicial. Foi possível a identificação dos primeiros 15 aminoácidos da banda protéica majoritária do gel de poliacrilamida e 10 e 5 aminoácidos das subfrações S2 e S5, respectivamente. No entanto, os resultados de sequenciamento N-terminal apresentaram baixa confiabilidade, devido à baixa quantidade de material utilizada. Neste trabalho foram isolados e caracterizados dois compostos capazes de induzir a ativação do sistema complemento. Esta ação foi evidenciada, após exposição do soro humano normal às subfrações, por induzirem à formação do complexo SC5b-9 e aumentarem a migração de neutrófilos, provavelmente por induzirem a formação de fatores quimiotáticos. Este estudo permitiu avaliar melhor alguns componentes presentes na complexa mistura que é o veneno de Rhinella schneideri, que, no futuro, poderão se tornar ferramentas farmacológicas importantes para o estudo de diversas patologias relacionadas ao sistema complemento. / Important studies focused on amphibians secretions analysis are based on large amount of biologically active components present in them, such as biogenic amines, steroids, polysaccharide amine, glycosides, protease inhibitors and several other compounds, responsible for complex symptomatology observed in the envenomation by Bufo paracnemis. The genus Bufo presents several molecules in their excretions that can be divided into categories such as biogenic amines, bufadienolides (Bufogenin), steroids (Bufotoxins), alkaloids, peptides and proteins. Marongio (2006) found in one of his studies the toad poison of Bufo paracnemis, now classified as Rhinella schneideri, has an active component of the classical pathway of the complement system (SC), which needs further studies and characterization. The purification process of this study was accomplished through cation chromatography (CM-Cellulose-52), and seven fractions were obtained, called C1, C2, C3, C4, C5, C6 e C7. The fraction C1 was chromatographed on anion-exchange resin (DEAE- SepharoseTM) resulting in 4 subfractions referred to as D1, D2, D3, and D4. The subfraction D3 showed activity on complement system and was subjected to gel filtration (SephacrylTMS-200) giving 5 subfractions termed S1, S2, S3, S4, and S5. The subfractions S2 and S5 induced reduction of the hemolytic activity of the classical/lectin pathway. Both showed positive results in the assays of migration of neutrophils and bidimensional immunoelectrophoresis. In the assay of generating capacity of SC5b-9, the subfraction S2 presented greater significance when compared to the other used subfractions. Aiming to clarify the action mechanism of the active subfractions on the complement system, tests of determination of the proteolytic or inhibitory activity of proteases (trypsin, chymotrypsin and elastase) had been done. However, in the used concentrations, the samples had not shown proteolytic or inhibitory activity of protease. The isolated compounds also had been submitted to the initial amino-terminal sequence. The identification of the first 15 aminoacids of the major proteinic band of the polyacrylamide gel and 10 and 5 aminoacids of the subfractions S2 and S5 was possible, respectively. However, the sequence of N-terminal results had presented low trustworthiness, due to the low amount of used material. In this work, were isolated and characterized two capable compounds to induce the activation of the complement system. This action was evidenced, after exposition of the normal human serum to the subfractions, for inducing to the formation of the SC5b-9 complex and will increase the migration of neutrophils, probably because they can induce the formation of chemotactic factors. This study allowed a better evaluation of some components present in the complex mixture which is the poison of Rhinella schneideri, that, in the future, important pharmacological tools for the study of diverse pathologies related the complement system.

Toxinas animais são moléculas aplicáveis na geração de agentes terapêuticos e/ou de ferramentas experimentais para a pesquisa básica e aplicada, justificando sua purificação e análise funcional. Considerando que estudos de venenos de sapos são relevantes, por serem estes considerados uma boa fonte de toxinas que atuam sobre diferentes sistemas biológicos, os objetivos deste trabalho foram isolar toxinas presentes no veneno de Rinella schneideri e avaliar suas ações sobre a atividade da enzima Na+K+-ATPase e os sistemas nervosos central e periférico. O veneno de Rhinella schneideri foi inicialmente submetido a diferentes extrações resultando em quatro amostras. A AMOSTRA A, que apresenta apenas componentes de baixa massa molecular, foi a mais efetiva na redução da atividade da Na+K+-ATPase e foi, portanto, liofilizada e submetida a uma cromatografia de fase reversa em sistema CLAE em coluna C2C18. Das 5 frações majoritárias obtidas nesta cromatografia apenas as Rs3, Rs4 e Rs5 induziram uma redução concentração-dependente da atividade da Na+K+-ATPase, mostrando IC50% de 33,6 g, 47,7 g e 98,92 g, respectivamente. Estes resultados indicam que o veneno de R. schneideri apresenta pelo menos três substâncias capazes de inibir a Na+K+-ATPase. As frações Rs3, Rs4 e Rs5, foram submetidas à espectrometria de massa e revelaram massas moleculares de 403, 401 e 387 Da, provavelmente correspondentes à Telocinobufagina, Desacetilcinobufagina e Bufalina, respectivamente. Estes compostos mostraram também neuroproteção central muito relevante sobre crises convulsivas induzidas por PTZ (Pentilenotetrazol) e NMDA (n-metil-d-aspartato), sendo que a Rs5 foi a que causou maior neuroproteção. No entanto, estas mesmas frações apresentaram ação neurotóxica periférica, induzindo bloqueio da junção neuromuscular de pintainhos. Manifestações como alucinações, dormência, confusão mental também são observadas em envenenamentos por sapos, que podem ser induzidos por alcalóides presentes no veneno, o que justifica os estudos para a identificação dos mesmos. Neste trabalho confirmou-se a presença de ii alcalóides no veneno. No entanto, foram priorizados os estudos com as toxinas isoladas Rs3, Rs4 e Rs5, por apresentarem ações biológicas importantes. Concluindo, neste trabalho foram isolados 3 compostos de baixa massa molecular, denominados Rs3, Rs4 e Rs5, que são capazes de inibir a atividade da Na+K+- ATPase, bloquear a transmissão do impulso nervoso na junção neuromuscular de pintainhos e, principalmente a Rs5, proteger crises convulsivas induzidas por PTZ e NMDA. Estudos adicionais serão necessários para estabelecer a correlação entre estes efeitos e determinar o mecanismo de ação destas toxinas. / Animal toxins are molecules applicable in the generation of therapeutic agents and / or experimental tools for basic and applied research, justifying its purification and functional analysis. Whereas studies of poison toads are relevant, since these are considered a good source of toxins that act on different biological systems, the objectives of this work were to isolate toxins in the venom of Rinella schneideri and evaluate their actions on the Na+K+-ATPase activity and the central and peripheral nervous systems. The venom Rhinella schneideri was initially submitted to different extractions resulting in four samples. The SAMPLE A, with only low molecular mass components, was the most effective in reducing the activity of Na+K+-ATPase and was lyophilized and subjected to reverse phase chromatography in the HPLC system in C2C18 column. Five majority fractions were obtained from this chromatography and only Rs3, Rs4 and Rs5 induced a concentration-dependent reduction in activity of Na+K+-ATPase, showing IC50% 33.6 g, 47.7 g and 98.92 g, respectively. These results indicate that R. schneideri venom presents at least three substances that can inhibit the Na+K+-ATPase. Fractions Rs3, Rs4 and Rs5 were submitted to mass spectrometry assay showing molecular masses of 403, 401and 387 Da, probably corresponding to Telocinobufagin, Desacetylcinobufagin and Bufalin, respectively. These compounds also showed a very relevant central neuroprotection on seizures induced by PTZ (Pentylenetetrazole) and NMDA (N-methyl-d-aspartate), and the Rs5 caused the highest neuroprotection. However, these same fractions showed neurotoxicity on peripheral nervous system, inducing blockade of the neuromuscular junction of chicks. Manifestations such as hallucinations, numbness, mental confusion are also seen in poisoning by toads, which can be induced by alkaloids present in the venom, which justifies the studies for their identification. This work confirmed the presence of alkaloids in the venom. However, have been prioritized the studies with isolated toxins Rs3, Rs4 and Rs5, because they have important biological actions. In conclusion, in this study were isolated three compounds with iv low molecular mass, known as Rs3, Rs4 and Rs5, which are capable of inhibiting the activity of Na+K+-ATPase, blocking the nerve impulse transmission at the neuromuscular junction of chickens, and especially the Rs5 by protecting seizures induced by PTZ and NMDA. Additional studies are necessary to establish the correlation between these effects and determine the mechanism of action of these toxins.