Inorganic phosphate is an essential nutrient required by all organisms for optimal growth. During phosphate starvation, Saccharomyces cerevisiae induces a set of genes responsible for the regulation of inorganic phosphate acquisition. The phosphate-responsive signaling (PHO) pathway controls this response, with the CDK-cyclin complex Pho85-Pho80 playing a prominent role. Here we report the X-ray structure of the Pho85-Pho80 complex, identifying the unique structural features that distinguish it from other cell cycle associated CDK-cyclin complexes. The structure reveals a specific salt bridge between a Pho85 arginine and a Pho80 aspartate that maintains a Pho80 loop confirmation important for substrate recognition and makes phosphorylation of the Pho85 activation loop dispensible. We show that a cluster of residues distal to the kinase active site are involved in a high affinity interaction between the Pho80 cyclin and the transcription factor substrate (Pho4). The structure also reveals a separate high affinity binding site for the CDK inhibitor (Pho81). The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, regulates expression of the secreted acid phosphatase \((pho1^+)\) via a non-orthologous PHO pathway. The genes induced by phosphate limitation and the molecular mechanism by which the genetically identified positive \((pho7^+)\) and negative \((csk1^+)\) regulators function are not known. Here we use a combination of molecular biology, expression microarrays, chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-Seq), and global transcriptome sequencing (RNA-Seq) to characterize the role of \(pho7^+\) and \(csk1^+\) in the PHO response. We show that there is a fast and slow response to phosphate starvation, each with defined regulatory roles. We use ChIP-Seq to identify members of the Pho7 regulon and characterize Pho7 binding dynamics in response to phosphate-limitation and Csk1 activity. We identify a conserved PHO response for the PHO5 \((pho1^+)\), PHO84 \((spbc8e4.01c^+)\), and GIT1 \((spbc1271.09^+)\) orthologs. We show that activation of \(pho1^+\) requires Pho7 binding to a UAS in the \(pho1^+\) promoter and that a URS is necessary for Csk1 repression. We find that Pho7-dependent activation is not limited to phosphate-starvation, as additional environmental stress response pathways require \(pho7^+\) for maximal induction. Using RNA-Seq we show that Pho7 is also involved in regulating non-coding transcription and is a bi-functional transcription factor.

Zellen sind darauf angewiesen, ihre Lebensbedingungen wahrzunehmen und darauf zu reagieren. Der TOR („Target of Rapamycin“)-Signalweg spielt dabei eine wichtige Rolle, indem er das Wachstum in Abhängigkeit von Nährstoffen und Hormonen reguliert. In dieser Arbeit wurde die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) als Modellorganismus für die Untersuchungen des TOR-Signalweges verwendet. Dabei zeigte sich, dass in S. pombe, wie in Säugern und der Bäckerhefe, zwei TOR-Komplexe existieren. Ko-Immunpräzipitationsexperimente zeigten, dass sich der TOR-Komplex 1 aus SpTor2, SpMip1 und SpWat1 zusammensetzt. Bei SpTor1, SpSin1, SpSte20 und SpWat1 handelt es sich um Mitglieder des TOR-Komplex 2. Phänotypische Analysen von Mutanten in Genen, die für TOR-Komplex 2-Komponenten kodieren, unterstreichen, dass diese Proteine in der Zelle ähnliche Funktionen bei der Antwort auf verschiedene Stresssituationen ausüben. Die heterologe Expression von wat1+ in einer S. cerevisiae delta lst8-Mutante komplementiert deren Wachstumsdefekt, was untermauert, dass diese beiden Proteine tatsächlich gleiche Funktionen in der Zelle ausüben. Eine Membranassoziation der TOR-Komplexe, wie sie in Säugern und S. cerevisiae bereits beschrieben wurde, konnte in dieser Arbeit für die TOR-Komplex 2-Komponente SpSte20 nachgewiesen werden. Möglicherweise spielt dabei die Interaktion zwischen der leichten Kette des Clathrins mit SpSte20 eine Rolle. Auch für die homologen Proteine aus S. cerevisiae, ScCLC1 und ScAVO3, konnte mittels des "Zwei-Hybrid"-Systems eine Bindung nachgewiesen werden. Dieses deutet eine Konservierung dieser Proteininteraktion innerhalb von Eukaryonten an. Obwohl das vegetative Wachstum von S. pombe durch Rapamycin nicht gehemmt wird, zeigen die hier aufgeführten Daten eine in vivo-Bindung von SpFkh1 an sowohl SpTor1 als auch SpTor2 in Anwesenheit von Rapamycin. Das Phosphorylierungslevel von SpGad8, dem bisher einzigen postulierten TOR-Komplex 2-Zielprotein, wird durch die Bindung des SpFkh1-Rapamycin-Komplexes an SpTor1 jedoch nicht beeinflusst. Dies und die Tatsache, dass delta gad8-Mutanten ein Rapamycin-sensitives Wachstum zeigen, lassen vermuten, dass noch weitere bisher unbekannte SpTOR-Komplex-Zielproteine durch Rapamycin beeinflusst werden. Zusammengenommen unterstreichen die Daten dieser Arbeit die Konservierung der Komplexe und des von ihnen vermittelten Signaltransduktionsweges. Sie zeigen aber auch, dass die Wirkung von Rapamycin nicht einfach durch eine generelle Hemmung der Aktivität der Komplexe beschrieben werden kann, was insbesondere für die klinische Anwendung von Rapamycin von Bedeutung ist.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第18626号 / 生博第317号 / 新制||生||42(附属図書館) / 31526 / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 上村 匡, 教授 西田 栄介, 教授 James Hejna / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DGAM

Der Missbrauch anaboler Substanzen zur Leistungssteigerung wird von den meisten Sportverbänden, dem Olympischen Komitee und vor allem der Welt Anti Doping Agentur (WADA) abgelehnt und sanktioniert. Trotzdessen bleibt der Missbrauch derartiger Substanzen sowohl im Leistungs- als auch im Freizeitsport nicht zuletzt aufgrund der starken Nebenwirkungen ein schwerwiegendes Problem. Allein im Leistungssport sind 2009 ca. 2 % der von der WADA durchgeführten Dopingkontrollen positiv ausgefallen. Dabei konnten in 65 % der positiv-getesteten Proben muskelaufbauende anabole Substanzen nachgewiesen werden. Im Freizeitsport konzentriert sich der Missbrauch dieser verbotenen Substanzen vor allem im Bereich des Bodybuildings. Die einzige rechtlich relevante und routinemäßig genutzte analytische Methode für den Nachweis anaboler Steroide in Urinproben von Sportlern ist die Gas- oder Flüssigkeitschromatographie in Kombination mit der Massenspektrometrie. Diese Methoden sind jedoch sehr kosten- und zeitintensiv. Außerdem können dabei unbekannte Substanzen nur schwer nachgewiesen werden. Ein alternativer Ansatz zum Nachweis androgener anaboler Steroide führt über deren biologische Aktivität. Auf diesem Prinzip beruhen unter anderem Hefeassays. Diese Assays sind kostengünstig, schnell und einfach durchzuführen. In dieser Arbeit wurden zwei neue Hefeassays zum einen in der Hefe Saccharomyces (S.) cerevisiae und zum anderen in der Hefe Schizosaccharomyces (S.) pombe konstruiert und hinsichtlich ihrer Eignung zur Doping-Prescreening Analyse getestet. Diese zwei Hefen wurden genutzt, da sie phylogenetisch sehr weit voneinander entfernt sind und dadurch unter anderem einen unterschiedlichen Metabolismus und einen unterschiedlichen Aufbau der Zellwand besitzen. In Hefeassays können falsch negative und falsch positive Ergebnisse auftreten, da endokrin-wirksame Substanzen in der Hefe und im humanen Organismus eine unterschiedliche Wirkung besitzen können. Humane Zellen unterscheiden sich von Hefezellen unter anderem im Metabolismus von aufgenommenen Substanzen, in der Durchlässigkeit der Zellwand für verschiedene Stoffe und in Transportsystemen, die Substanzen aus der Zelle ausschleusen. Eine Kombination dieser beiden neu konstruierten Assays verspricht den Aktivitätsnachweis eines viel größeren Substanzspektrums, als es mit einem System allein möglich wäre, wodurch eine Reduzierung falsch negativer Ergebnisse erreicht werden kann. Als erster Schritt in dieser Arbeit wurde ein bestehendes Hefesystem von Sohoni und Sumpter (1998) charakterisiert. Der Hefestamm dieses S. cerevisiae Reportergen-Assays exprimiert den humanen Androgenrezeptor (AR) konstitutiv, da das AR Gen durch genetische Manipulation ins Genom der Hefe stabil integriert wurde. Außerdem liegt in der Hefezelle ein so genanntes Reporterplasmid vor. Dieses Plasmid trägt das lacZ Gen, welches in diesem Fall als Reportergen funktioniert und unter der Kontrolle eines androgen-sensitiven Promoters steht. Gelangen nun Androgene in diese Zellen wird das lacZ Gen abgelesen und die beta-Galactosidase gebildet. Dieses Enzym wird ins Hefemedium sekretiert und wandelt dort einen gelben in einen roten Farbstoff um. Dieser Farbumschlag kann nunmehr quantitativ gemessen und als Maß androgener Aktivität ausgewertet werden. Die Eignung dieses Reportergenassays als Doping-Prescreening Test konnte in vielfältigen Experimenten bestätigt werden. Zunächst konnten mit diesem Assay bekannte Dopingsubstanzen und deren Metabolite anhand ihrer biologischen Aktivität nachgewiesen werden. Außerdem konnte die Spezifität des Assays gegenüber Androgenen gezeigt werden, wobei Steroide anderer Klassen, wie das Mineralocorticoid Aldosteron, das künstliche Glucocorticoid Dexamethason, das Östrogen 17beta-Östradiol und das Gestagen Progesteron und außerdem das Prohormon Dehydroepiandrosteron im Hefeassay geprüft worden sind. Alle diese Substanzen zeigten keinen relevanten Signalanstieg in physiologischen Konzentrationen. Weiterhin wurde die Praktikabilität des Hefeassays für die Doping-Prescreening Analyse anhand eines Trenbolox- und eines Methyltestosteron-Ausscheidungsversuchs untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Hefen dieses Assays eine 20 %ige Urinkonzentration im Medium tolerieren und gleichzeitig die biologische Aktivität von oral eingenommenem Methyltestosteron und Estra-4,9-dien-3,17-dion (Präparatname: Trenbolox) bzw. deren Metabolite in Urinproben detektierbar ist. Außerdem wurden parallel Urinproben von Frauen und Männern, die keine androgen wirksamen Substanzen eingenommen haben, getestet. Diese Urinproben ohne exogene Zufuhr von anabolen Steroiden wiesen keinen bedeutenden Signalanstieg auf. Eine Verbesserung des ursprünglichen Reportergenassays von Sohoni und Sumpter wurde durch den Austausch des Reportergens von lacZ zum optimierten grün fluoreszierenden Protein (EGFP) erreicht. Dadurch konnte eine deutliche Verringerung der Inkubationszeit von 48 auf 24 Stunden bewirkt werden. Auch bei der Konstruktion der beiden neuen Reportergenassays in S. cerevisiae und S. pombe wurde daraufhin EGFP als Reportergen eingesetzt. Dafür wurde ein für die jeweilige Hefe spezifisches Reporterplasmid mit dem EGFP-Gen unter der Kontrolle eines androgen-sensitiven Promoters und ein spezifisches Expressionsplasmid mit dem Gen für den humanen Androgenrezeptor konstruiert und in die jeweilige Hefe eingebracht. Durch Optimierungsversuche wurde festgestellt, dass beide neu konstruierten Hefen eine identische einzusetzende Zellzahl, Inkubationszeit, Inkubationstemperatur und ein identisches Kulturvolumen besitzen. Daraus ergibt sich der Vorteil, dass beide Assays gut kombiniert werden können. Mit Hilfe beider Hefeassays konnte die Wirkung verschiedener dopingrelevanter Substanzen detektiert werden, wobei der S. cerevisiae Assay eine geringfügig höhere Sensitivität zeigte als der S. pombe Assay und sogar als der Reportergenassay von Sohoni und Sumpter. Zum weiteren Vergleich der Sensitivität beider Assays wurden drei Ausscheidungsversuche durchgeführt. Im ersten so genannten Trenbolox-Ausscheidungsversuch zeigte der S. pombe Assay in allen fünf Urinproben ein stärkeres Signal als die Referenzprobe. Im S. cerevisiae Assay konnten nur vier der fünf getesteten Urinproben eine höhere Signalintensität als die Referenzprobe erreichen. Dies lässt auf eine unterschiedliche Sensitivität beider Assays für die eingenommene Substanz Estra-4,9-dien-3,17-dion (Trenbolox) bzw. seiner Metabolite schließen. In einem zweiten Ausscheidungsversuch nach 1-Androsteron Einnahme konnte gezeigt werden, dass im Urin hohe Konzentrationen von ausgeschiedener Ausgangssubstanz oder deren Metabolite bis zu 30 Stunden nach Substanzeinnahme ein positives Signal in beiden Hefeassays hervorriefen. Wohingegen zu späteren Ausscheidungszeitpunkten beide Hefeassays sehr unterschiedliche Ergebnisse zeigten. Beide Hefen scheinen späte Metabolite von 1 Androsteron mit unterschiedlicher Sensitivität zu detektieren. Im dritten Ausscheidungsversuch mit der Substanz Methyltestosteron konnte ebenfalls eine sehr unterschiedliche Sensitivität beider konstruierter Hefeassays gegenüber Methyltestosteron und seiner Metabolite festgestellt werden. Die Ergebnisse der Ausscheidungsversuche scheinen die Annahme zu bestätigen, dass eine Kombination beider Assays den Aktivitätsnachweis eines weiten Spektrums von androgenen Substanzen gewährleistet. Vor allem in der Dopinganalyse wäre dies von großem Vorteil, um bisher unbekannte Substanzen, wie neue so genannte Designer-Steroide, in Kombination mit der MS-Analytik nachzuweisen. Die Hefeassays bieten dabei die Möglichkeit zum einfachen, schnellen und kostengünstigen Doping-Prescreening. Auch der hier erstmals untersuchte direkte Einsatz von unbehandelten Urinproben in Hefeassays ist ein deutlicher Vorteil im Vergleich zu den klassischen Methoden, bei denen die Urinproben aufwendig gereinigt werden müssen. Ein weiteres aus unseren Ergebnissen resultierendes Anwendungsgebiet für die konstruierten Hefeassays könnte der Nachweis der biologischen Aktivität von Antiandrogenen sein.

Der Missbrauch anaboler Substanzen zur Leistungssteigerung wird von den meisten Sportverbänden, dem Olympischen Komitee und vor allem der Welt Anti Doping Agentur (WADA) abgelehnt und sanktioniert. Trotzdessen bleibt der Missbrauch derartiger Substanzen sowohl im Leistungs- als auch im Freizeitsport nicht zuletzt aufgrund der starken Nebenwirkungen ein schwerwiegendes Problem. Allein im Leistungssport sind 2009 ca. 2 % der von der WADA durchgeführten Dopingkontrollen positiv ausgefallen. Dabei konnten in 65 % der positiv-getesteten Proben muskelaufbauende anabole Substanzen nachgewiesen werden. Im Freizeitsport konzentriert sich der Missbrauch dieser verbotenen Substanzen vor allem im Bereich des Bodybuildings. Die einzige rechtlich relevante und routinemäßig genutzte analytische Methode für den Nachweis anaboler Steroide in Urinproben von Sportlern ist die Gas- oder Flüssigkeitschromatographie in Kombination mit der Massenspektrometrie. Diese Methoden sind jedoch sehr kosten- und zeitintensiv. Außerdem können dabei unbekannte Substanzen nur schwer nachgewiesen werden. Ein alternativer Ansatz zum Nachweis androgener anaboler Steroide führt über deren biologische Aktivität. Auf diesem Prinzip beruhen unter anderem Hefeassays. Diese Assays sind kostengünstig, schnell und einfach durchzuführen. In dieser Arbeit wurden zwei neue Hefeassays zum einen in der Hefe Saccharomyces (S.) cerevisiae und zum anderen in der Hefe Schizosaccharomyces (S.) pombe konstruiert und hinsichtlich ihrer Eignung zur Doping-Prescreening Analyse getestet. Diese zwei Hefen wurden genutzt, da sie phylogenetisch sehr weit voneinander entfernt sind und dadurch unter anderem einen unterschiedlichen Metabolismus und einen unterschiedlichen Aufbau der Zellwand besitzen. In Hefeassays können falsch negative und falsch positive Ergebnisse auftreten, da endokrin-wirksame Substanzen in der Hefe und im humanen Organismus eine unterschiedliche Wirkung besitzen können. Humane Zellen unterscheiden sich von Hefezellen unter anderem im Metabolismus von aufgenommenen Substanzen, in der Durchlässigkeit der Zellwand für verschiedene Stoffe und in Transportsystemen, die Substanzen aus der Zelle ausschleusen. Eine Kombination dieser beiden neu konstruierten Assays verspricht den Aktivitätsnachweis eines viel größeren Substanzspektrums, als es mit einem System allein möglich wäre, wodurch eine Reduzierung falsch negativer Ergebnisse erreicht werden kann. Als erster Schritt in dieser Arbeit wurde ein bestehendes Hefesystem von Sohoni und Sumpter (1998) charakterisiert. Der Hefestamm dieses S. cerevisiae Reportergen-Assays exprimiert den humanen Androgenrezeptor (AR) konstitutiv, da das AR Gen durch genetische Manipulation ins Genom der Hefe stabil integriert wurde. Außerdem liegt in der Hefezelle ein so genanntes Reporterplasmid vor. Dieses Plasmid trägt das lacZ Gen, welches in diesem Fall als Reportergen funktioniert und unter der Kontrolle eines androgen-sensitiven Promoters steht. Gelangen nun Androgene in diese Zellen wird das lacZ Gen abgelesen und die beta-Galactosidase gebildet. Dieses Enzym wird ins Hefemedium sekretiert und wandelt dort einen gelben in einen roten Farbstoff um. Dieser Farbumschlag kann nunmehr quantitativ gemessen und als Maß androgener Aktivität ausgewertet werden. Die Eignung dieses Reportergenassays als Doping-Prescreening Test konnte in vielfältigen Experimenten bestätigt werden. Zunächst konnten mit diesem Assay bekannte Dopingsubstanzen und deren Metabolite anhand ihrer biologischen Aktivität nachgewiesen werden. Außerdem konnte die Spezifität des Assays gegenüber Androgenen gezeigt werden, wobei Steroide anderer Klassen, wie das Mineralocorticoid Aldosteron, das künstliche Glucocorticoid Dexamethason, das Östrogen 17beta-Östradiol und das Gestagen Progesteron und außerdem das Prohormon Dehydroepiandrosteron im Hefeassay geprüft worden sind. Alle diese Substanzen zeigten keinen relevanten Signalanstieg in physiologischen Konzentrationen. Weiterhin wurde die Praktikabilität des Hefeassays für die Doping-Prescreening Analyse anhand eines Trenbolox- und eines Methyltestosteron-Ausscheidungsversuchs untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Hefen dieses Assays eine 20 %ige Urinkonzentration im Medium tolerieren und gleichzeitig die biologische Aktivität von oral eingenommenem Methyltestosteron und Estra-4,9-dien-3,17-dion (Präparatname: Trenbolox) bzw. deren Metabolite in Urinproben detektierbar ist. Außerdem wurden parallel Urinproben von Frauen und Männern, die keine androgen wirksamen Substanzen eingenommen haben, getestet. Diese Urinproben ohne exogene Zufuhr von anabolen Steroiden wiesen keinen bedeutenden Signalanstieg auf. Eine Verbesserung des ursprünglichen Reportergenassays von Sohoni und Sumpter wurde durch den Austausch des Reportergens von lacZ zum optimierten grün fluoreszierenden Protein (EGFP) erreicht. Dadurch konnte eine deutliche Verringerung der Inkubationszeit von 48 auf 24 Stunden bewirkt werden. Auch bei der Konstruktion der beiden neuen Reportergenassays in S. cerevisiae und S. pombe wurde daraufhin EGFP als Reportergen eingesetzt. Dafür wurde ein für die jeweilige Hefe spezifisches Reporterplasmid mit dem EGFP-Gen unter der Kontrolle eines androgen-sensitiven Promoters und ein spezifisches Expressionsplasmid mit dem Gen für den humanen Androgenrezeptor konstruiert und in die jeweilige Hefe eingebracht. Durch Optimierungsversuche wurde festgestellt, dass beide neu konstruierten Hefen eine identische einzusetzende Zellzahl, Inkubationszeit, Inkubationstemperatur und ein identisches Kulturvolumen besitzen. Daraus ergibt sich der Vorteil, dass beide Assays gut kombiniert werden können. Mit Hilfe beider Hefeassays konnte die Wirkung verschiedener dopingrelevanter Substanzen detektiert werden, wobei der S. cerevisiae Assay eine geringfügig höhere Sensitivität zeigte als der S. pombe Assay und sogar als der Reportergenassay von Sohoni und Sumpter. Zum weiteren Vergleich der Sensitivität beider Assays wurden drei Ausscheidungsversuche durchgeführt. Im ersten so genannten Trenbolox-Ausscheidungsversuch zeigte der S. pombe Assay in allen fünf Urinproben ein stärkeres Signal als die Referenzprobe. Im S. cerevisiae Assay konnten nur vier der fünf getesteten Urinproben eine höhere Signalintensität als die Referenzprobe erreichen. Dies lässt auf eine unterschiedliche Sensitivität beider Assays für die eingenommene Substanz Estra-4,9-dien-3,17-dion (Trenbolox) bzw. seiner Metabolite schließen. In einem zweiten Ausscheidungsversuch nach 1-Androsteron Einnahme konnte gezeigt werden, dass im Urin hohe Konzentrationen von ausgeschiedener Ausgangssubstanz oder deren Metabolite bis zu 30 Stunden nach Substanzeinnahme ein positives Signal in beiden Hefeassays hervorriefen. Wohingegen zu späteren Ausscheidungszeitpunkten beide Hefeassays sehr unterschiedliche Ergebnisse zeigten. Beide Hefen scheinen späte Metabolite von 1 Androsteron mit unterschiedlicher Sensitivität zu detektieren. Im dritten Ausscheidungsversuch mit der Substanz Methyltestosteron konnte ebenfalls eine sehr unterschiedliche Sensitivität beider konstruierter Hefeassays gegenüber Methyltestosteron und seiner Metabolite festgestellt werden. Die Ergebnisse der Ausscheidungsversuche scheinen die Annahme zu bestätigen, dass eine Kombination beider Assays den Aktivitätsnachweis eines weiten Spektrums von androgenen Substanzen gewährleistet. Vor allem in der Dopinganalyse wäre dies von großem Vorteil, um bisher unbekannte Substanzen, wie neue so genannte Designer-Steroide, in Kombination mit der MS-Analytik nachzuweisen. Die Hefeassays bieten dabei die Möglichkeit zum einfachen, schnellen und kostengünstigen Doping-Prescreening. Auch der hier erstmals untersuchte direkte Einsatz von unbehandelten Urinproben in Hefeassays ist ein deutlicher Vorteil im Vergleich zu den klassischen Methoden, bei denen die Urinproben aufwendig gereinigt werden müssen. Ein weiteres aus unseren Ergebnissen resultierendes Anwendungsgebiet für die konstruierten Hefeassays könnte der Nachweis der biologischen Aktivität von Antiandrogenen sein.

Le but de ces travaux de thèse est d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes de régulation contrôlant la division cellulaire au niveau moléculaire. La division cellulaire est composée de la mitose et la cytocinèse. Les deux processus doivent être coordonnés étroitement afin de garantir la stabilité du génome. La division cellulaire doit aussi s’équilibrer avec la croissance cellulaire pour que les cellules conservent une taille constante au cours des cycles successifs. La levure S. pombe est un organisme modèle simple très utilisé pour des études de cycle cellulaire et de cytocinèse. Dans ce modèle, nous avons focalisé ce travail de thèse sur les nœuds corticaux médians, des structures protéiques complexes, qui ont une fonction double dans l’engagement en mitose et dans le positionnement du plan de division. Les nœuds médians corticaux sont organisés par la kinase SAD Cdr2. Leur localisation et leur fonction sont régulées négativement pour la DYRK kinase Pom1 qui forme des gradients émanant des extrémités de la cellule. Les nœuds corticaux médians contiennent une voie d’inhibition pour Wee1 qui promeut l’entrée en mitose. Cette voie implique la kinase SAD Cdr1, un inhibiteur direct de Wee1 et pourrait coupler l’entrée en mitose à la taille de la cellule par levée progressive de l’inhibition exercée par Pom1 quand les cellules s’allongent. Cdr2 recrute aussi l’anillin Mid1 sur les nœuds corticaux médians ainsi qu’une série de composants additionnels, Blt1, Gef2, Nod1 et Klp8, pour former des précurseurs médians de l’anneau contractile de cytocinèse qui se compactent en un anneau fin pendant la mitose. La localisation médiane des nœuds, contrôlée négativement par les gradients polaires de Pom1 prédéfinit ainsi le plan de division au centre géométrique de la cellule. Dans la première partie de ma thèse, j’ai étudié la protéine des nœuds corticaux médians Blt1 dont la fonction restait énigmatique. Nous avons montré que Blt1 promeut une association robuste de Mid1 avec les nœuds corticaux. Blt1 interagit avec Mid1 via le RhoGEF Gef2 pour stabiliser les nœuds au cortex cellulaire durant les premiers stades de l’assemblage de l’anneau contractile. L’extrémité N-terminale de Blt1 est nécessaire à sa localisation ainsi qu’à sa fonction, tandis que son extrémité C-terminale favorise sa localisation au cortex en interagissant avec des phospholipides. Dans des cellules dans lesquelles ni Mid1 ni Blt1 ne peuvent s’attacher à la membrane, les nœuds se détachent du cortex et génèrent des anneaux contractiles de cytocinèse aberrants. Nous en avons conclu que Blt1 agit comme une protéine d’échafaudage pour les précurseurs de l’anneau contractile, et que Blt1 et Mid1 constituent des ancres membranaires redondantes pour le positionnement du plan de division. Dans une deuxième partie de ma thèse, j’ai étudié comment Cdr2 organise les différents composants des nœuds en voies fonctionnelles qui favorisent l’entrée en mitose et la division médiane. J’ai montré que l’interaction de Cdr2 avec Wee1 et Mid1 dépend du domaine UBA de Cdr2 de manière dépendante de l’activité kinase. En revanche, Cdr1 s’associe avec l’extrémité C-terminale de Cdr2, composée des domaines basique et KA1 d’association aux lipides membranaires. De manière intéressante, Mid1 interagit également avec l’extrémité C-terminale de Cdr2 et pourrait ponter les parties N- et C-terminales de Cdr2, alors que Blt1 s’associe à la région centrale de Cdr2. Nous faisons l’hypothèse que l’association des effecteurs de Cdr2 avec différents domaines de Cdr2 pourraient contraindre Cdr1 et Wee1 spatialement pour promouvoir l'inhibition de Wee1 quand la kinase Cdr2 est active. / The aim of this PhD work is to bring a better understanding of the regulatory mechanism controlling cell division in space and time at the molecular level. Cell division is composed of mitosis and cytokinesis. Both processes need to be perfectly coordinated in order to guarantee genome integrity. Cell division also needs to be properly balanced with cell growth to maintain cell size constant during successive cell cycles. Temporal and spatial regulatory mechanisms ensure the coordination of these events. The fission yeast Schizosaccharomyces pombe is a simple rod-shaped model organism well-known for cell cycle and cytokinesis studies. In this model, we focused the work of this thesis on the medial cortical nodes, complexe protein structures that have a dual role in mitotic commitment and in division plane positioning. Medial cortical nodes are organized by the SAD kinase Cdr2. Their localization and function is negatively regulated by the DYRK kinase Pom1 that forms a gradient emanating from the cell tips. Medial cortical nodes contain an inhibitory pathway for Wee1, promoting mitotic entry. This pathway involves the SAD kinase Cdr1, a direct inhibitor of Wee1 and has been proposed to couple mitotic entry to cell size by progressive alleviation of Pom1 inhibition when cells grow longer. Cdr2 also recruits to medial nodes the anillin Mid1 as well as a series of four additional components, Blt1, Gef2, Nod1 and Klp8, to form medial precursors for the cytokinetic contractile ring that compact into a tight ring during mitosis. Nodes medial localization, negatively controlled by Pom1 gradients, predefines thereby the division plane in the cell geometrical center. In a first part of my thesis, I studied the previously enigmatic cortical node protein Blt1. We showed that Blt1 promotes the robust association of Mid1 with cortical nodes. Blt1 interacts with Mid1 through the RhoGEF Gef2 to stabilize nodes at the cell cortex during the early stages of contractile ring assembly. The Blt1 N terminus is required for localization and function, while the Blt1 C terminus promotes cortical localization by interacting with phospholipids. In cells lacking membrane binding by both Mid1 and Blt1, nodes detach from the cell cortex and generate aberrant cytokinetic rings. We conclude that Blt1 acts as a scaffolding protein for precursors of the cytokinetic ring and that Blt1 and Mid1 provide overlapping membrane anchors for proper division plane positioning. In the second part of my thesis, I studied how Cdr2 scaffolds various nodes components to organize them in functional pathways promoting mitotic commitment and medial division. I showed that Cdr2 interaction with Wee1 and Mid1, depends on Cdr2 UBA domain in a kinase activity dependent manner. In contrast, Cdr1 associates with Cdr2 C-terminus composed of basic and KA-1 lipid-binding domains. Interestingly, Mid1 also interacts with Cdr2 C-terminus and may the bridge N- and C-terminal domains of Cdr2 while Blt1 associates with the central spacer region. We propose that the association of Cdr2 effectors with different Cdr2 domains may constrain Cdr1 and Wee1 spatially to promote Wee1 inhibition upon Cdr2 kinase activation.

Esta tesis doctoral consiste en la caracterización de la ciclina meiótica Rem1, de Schizosaccharomyces pombe. En este trabajo se analizó, inicialmente, el patrón de transcripción y expresión de rem1 durante la meiosis observando que el pico de expresión se produce durante la meiosis I, la actividad quinasa del complejo ciclina-Cdk también coincide con la meiosis I. Seguidamente, se determinó que la transcripción del mRNA maduro de rem1 depende de Mei4 a través de las cajas FLEX del promotor de rem1. También se observó la presencia de un RNA "antisense" que se transcribe durante las primeras horas de la meiosis. A continuación, se estudió la función de Rem1 durante la meiosis determinando una función de esta ciclina en la meiosis I. Se observó la toxicidad de Rem1 expresado durante el ciclo mitótico. Posteriormente, se analizaron posibles interacciones genéticas con otras ciclinas meióticas detectando que Rem1 tiene una función redundante con Cig2 durante la fase S meiótica. También se determinó la necesaria presencia de rem1 para conseguir unos niveles de recombinación meiótica intragénica normales, mientras que se requiere para la recombinación intergénica. / The main goal of this doctoral thesis is the characterization of the meiotic cyclin Rem1, in Schizosaccharomyces pombe. First of all we analized the transcription and expresion profiles of rem1 during meiosis. We observed the maximum of expresion during meiosi I and the kinase activity of the complex cyclin-Cdk had exactly the same profile. Then, we analized the transcription profile of the mature mRNA of rem1, showing that this transcription depends on Mei4 through the FLEX boxes which are loclized in the rem1 promoter. An antisense RNA was also detected at the begining of the meiosis. We next diceded to study the function of this cyclin. Firstly we observed that overexpression of Rem1 is toxic for the cell during mitotic cell growth. Moreover, a function for Rem1 was observed during meiosis I. Rem1 is also required in order to obtain normal levels of meiotic intragenic recombination, but it is not necesary for the intergenic recombination. Finally, we could detect a genetic interaction betwen Rem1 and the meiotic S phase cyclin, Cig2.

Η διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας είναι απαραίτητη για την επιβίωση των κυττάρων και κατ’ επέκταση των οργανισμών. Δύο είναι οι κύριοι παράγοντες που συμβάλλουν στην διαφύλαξη της σταθερότητας του γονιδιώματος: η ορθή διεξαγωγή της αντιγραφής, που είναι σημαντική για την, χωρίς λάθη, μεταβίβαση του γενετικού υλικού από γενιά σε γενιά και η ανάπτυξη μηχανισμών επιδιόρθωσής του σε περίπτωση παρουσίας βλαβών. Ανάμεσα στα μόρια που συμμετέχουν στις δύο παραπάνω κυτταρικές διεργασίες, συγκαταλέγεται και ένα από τα πέντε μέλη της εξελικτικά συντηρημένης οικογένειας των RecQ ελικασών, η RecQ4 ελικάση. Η RecQ4 είναι συνδεδεμένη με την εμφάνιση του συνδρόμου προγηρίας Rothmund-Thomson και ξεχωρίζει από τα άλλα μέλη της οικογένειας στο ότι, πέραν του ρόλου της στην επιδιόρθωση του γενετικού υλικού, είναι απαραίτητη για την έναρξη της αντιγραφής του DNA. Η μελέτη του συγκεκριμένου μορίου στον άνθρωπο παρουσιάζει δυσκολίες λόγω της περιπλοκότητας του συστήματος. Στον Σχιζοσακχαρομύκητα, η ομόλογη πρωτεΐνη της RecQ4, Hrq1, αναγνωρίστηκε πρόσφατα και τα δεδομένα που έχουμε για την δράση της είναι περιορισμένα. Η μελέτη της Hrq1 στο απλούστερο σύστημα του Σχιζοσακχαρομύκητα θα διαλευκάνει τον άγνωστο, μέχρι στιγμής, ρόλο της στον οργανισμό αυτό ενώ παράλληλα θα βοηθήσει στην κατανόηση του ακριβή ρόλου του ανθρώπινου ομολόγου της. Στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας μελετήθηκε ο ρόλος της Hrq1 ελικάσης στη διαδικασία της αντιγραφής, μέσω παρατήρησης φαινοτυπικών αλλαγών που παρουσιάζουν τα κύτταρα που φέρουν απαλοιφή της ελικάσης σε σχέση με κύτταρα αγρίου τύπου. Επίσης, διερευνήθηκαν αλληλεπιδράσεις της Hrq1 με μόρια που σχετίζονται με την διαδικασία της αντιγραφής στον Σχιζοσακχαρομύκητα, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της συνανοσοκατακρήμνησης. Στο δεύτερο μέρος, μελετήθηκε η δράση της ελικάσης στη διαδικασία της επιδιόρθωσης και πιο συγκεκριμένα στην επιδιόρθωση βλαβών που προκαλούνται από το αντικαρκινικό φάρμακο cisplatin, χρησιμοποιώντας και πάλι φαινοτυπική ανάλυση. Τέλος, ελέγχθηκαν πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις της Hrq1, που μπορεί να σχετίζονται με τη ρύθμιση της έκφρασής της in vivo. / The maintenance of genome integrity is essential for cell survival and therefore for survival of the organism. There are two major factors contributing to the preservation of genome stability: acurate DNA replication, which is important for the intact transfer of the genome to the next generation and DNA repair mechanisms, which act in the presence of DNA damage.There are many different molecules involved in the aforementioned cellular processes, including a helicase called, RecQ4. This enzyme belongs to the evolutionarily conserved family of RecQ helicases and is one of the five members of the family, in humans. RecQ4 is linked to Rothmund-Thomson premature aging syndrome and it is unique amongst RecQ helicases in being required for the normal initiation of DNA replication. Studying RecQ4 in humans has difficulties, because of the complexity of the system. In fission yeast, the RecQ4 homologue, called Hrq1, has been recently recognized as a member of the family and there is limited evidence, concerning its function. The study of Hrq1 in a model system, like fission yeast, will not only elucidate its role in this organism, but will also assist in understanding the role of its human orthologue. In the first part of this study we determined the role of Hrq1 helicase in DNA replication, by observing phenotypic changes in cells bearing the helicase deletion, compared to wild-type cells. We, also, investigated protein-protein interactions between Hrq1 and molecules related to the process of DNA replication in Schizosaccharomyces pombe, using co-immunoprecipitation. In the second part, the role of Hrq1 in DNA damage repair was investigated. Specifically, we examined how Hrq1 affects the cellular response to cisplatin, using phenotypic analysis. Finally, we looked into protein-protein interactions of Hrq1, that are related to the regulation of its expression in vivo.

Au laboratoire du Dr. Bachand, l’orthologue chez la levure à fission de la protéine humaine PABPN1 qui est reliée à la dystrophie musculaire oculopharyngée a été découvert. Cette protéine se nomme Pab2. Elle a une localisation nucléaire, fait la navette entre le noyau et le cytoplasme, et les arginines de son domaine arginine riche sont asymétriquement diméthylées tout comme son orthologue humain. Bien que ces protéines aient une localisation nucléaire, aucune étude in vivo n’a été effectuée afin d’élucider leur mécanisme d’import nucléaire. Dans mon premier projet de recherche, la levure à fission a été utilisée pour caractériser le mécanisme d’import nucléaire de ces protéines liant les queues poly(A). Il a été démontré que Pab2 détient un signal de localisation nucléaire de type PY-NLS qui est suffisant et nécessaire à sa localisation nucléaire ainsi qu’à l’exécution de ses fonctions. De plus, il a été démontré que le PY-NLS de Pab2 provoque l’internalisation nucléaire de la protéine hétérologue GST-GFP-Pab2 (139-166). De concert avec un système d’import nucléaire de type PY-NLS, une délétion de la karyophérine Kap104, orthologue de la Kap?2 qui est le transporteur des cargos PY-NLS, engendre un défaut d’import nucléaire de Pab2. S’ensuit aussi par la démonstration d’une interaction physique directe entre Pab2 et Kap104. Il a été observé que la méthylation du domaine arginine riche en C-terminal, où se retrouve le PY-NLS, n’affecte pas la localisation de Pab2. Toutefois, dans un contexte où Pab2 détient un signal de localisation nucléaire sub-optimal ; la méthylation du domaine arginine riche réduit son efficacité d’import nucléaire. Finalement, une vérification in vivo de l’importance du mécanisme d’import de type PY-NLS de PABPN1 par un système d’inhibition spécifique de la Kap?2 a permis de confirmer que ce mécanisme d’import n’est pas nécessaire à sa localisation nucléaire. Suggérant la présence de systèmes d’imports nucléaires redondants ainsi que la possibilité d’une autre voie d’import nucléaire prioritaire pourPABPN1. Une analyse transcriptomique par micropuce d’ADN a permis d’identifier divers gènes surexprimés dans une cellule pab2?. Une des classes de gènes qui ont été identifiés se réfère à des éléments génétiques mobiles se dénommant Tƒ2 chez la levure à fission. La confirmation de l’accumulation d’environ deux fois des transcrits Tƒ2 dans une souche pab2? par buvardage Northern a fit naître mon deuxième projet de recherche. Plusieurs études ont démontré que Pab2 agit dans la même voie que Rrp6, une exonucléase 3’-5’, dans la maturation et la dégradation de divers transcrits de façon post-transcriptionnelle. Afin de corroborer une répression post-transcriptionnelle des Tƒ2 par Pab2; un essai génétique a été effectué en combinant sa délétion à celle d’une protéine, Abp1, connue pour réprimer de façon transcriptionnelle ces Tƒ2. Étonnamment, une diminution d’accumulation de transcrits Tƒ2 a été observée dans le double mutant comparativement au simple mutant abp1?. Une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) par la Pol II a permis de confirmer que ce phénotype était d’ordre transcriptionnel. Les essais de ChIP ont aussi permis de corroborer un rôle post-transcriptionnel de répression des Tƒ2 par Pab2. Il a été démontré par un autre groupe de recherche qu’il y a activation du RNAi envers les Tƒ2 qui mènent à l’établissement d’une marque d’hétérochromatine dans un mutant rrp6?. Un dépistage de transcrits antisens aux Tƒ2 a permis d’en identifier un qui accumule dans un double mutant abp1?/pab2?. Il a aussi été observé que ce transcrit antisens accumule à des étapes spécifiques de la méiose. De plus, son accumulation dans des mutants génétiques ou bien en méiose corrèle négativement avec l’accumulation de l’ARNm des Tƒ2. [symboles non conformes]

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