Pour fixer en parallèle des milliers de biomolécules (ADN, ARN, protéines, etc.) à la surface des puces à ADN ou àprotéines, il faudrait choisir parmi une multitude de méthodes, selon la biomolécule à fixer et la nature du support, elle-mêmeconditionnée par la méthode de détection utilisée. Jusque-là, l'immobilisation de biomolécules sur une puce en utilisantla microfluidique continue présentait l'avantage d'un greffage en mode dynamique. Dans ce mode, les biomolécules sontcontinuellement transportées, via des microcanaux, à proximité de la puce. La volonté continue d'augmenter le nombredes zones immobilisées nécessite l'emploi de la microfluidique discrète pour cette fonction biologique. En effet, en modespotting (simple dépôt de gouttes contenant les biomolécules) le nombre de zones immobilisées est uniquement limité parle volume de liquide minimum pouvant être déposé. Cependant, en choisissant cette méthode fluidique, il fallait, jusque là,renoncer à une réaction en mode dynamique : le greffage s'effectue ainsi en mode passif. Ces travaux de thèse présententune méthode pour créer une dynamique à l'intérieure des gouttes porteuses des biomolécules durant l'opération de greffagemoléculaire. Nous avons choisi d'utiliser un générateur de vibration de basse fréquence permettant d'induire simultanémentdes écoulements dans plusieurs gouttes. De la conception, la réalisation et la caractérisation des générateurs de vibration àla caractérisation et la modélisation de l'écoulement induit par ce dispositif dans le liquide, ou encore à la caractérisation del'opération biologique visée, nous démontrons l'efficacité des vibrations basses fréquences dans ce domaine.

Magnetically driven separation techniques using magnetic solid carriers are one of modern methods to speed up and facilitate the previously used separation and purification procedures. The use of magnetic particles in biology imposes strict requirements on physical, and chemical properties of the particles, including low toxicity, biocompatibility and non-interference with the chemical environment in diagnostics. The aim of this study was to evaluate carboxyl-functionalised magnetic non-porous P(HEMA-co-GMA), P(HEMA-co-EDMA), PGMA, silica-coated lanthanum manganese peroskvite La0.75Sr0.25MnO3 and thermosensitive poly(N-isopropylacrylamide) microspheres – P(NIPAAm) for DNA isolation from different types of complex food and environmental samples containing PCR inhibitors. The solid-phase reversible immobilisation (SPRI) of nucleid acids on microsphere surface and the release of adsorbed DNA were optimised. DNA from real samples (milk products and probiotic food suplements, mouse faeces) was apparently adsorbed on solid particles from the aqueous phase system composed of 16% PEG 6000 and 2M NaCl. The conditions of the subsequent release absorbed DNA to the elution buffer (pH of elution buffer, temperature and time of elution) were optimized. The quality of eluted DNA and the presence of target DNA were examined by PCR and q-PCR using domain-specific Bacteria and genus-specific Lactobacillus primer set. Real-time PCR was used for an estimation of the PCR interference by comparing the amplification efficiencies of purified DNA containing solid nanoparticles with the DNA standards free of any nanoparticles

Le travail de cette thèse est axé autour de l'observation de la stabilité du duplexe de l'ADN. Exploitant un système de détection en temps réel basé sur le principe de l'imagerie par la résonance des plasmons de surface, nous utilisons des rampes de température pour mettre en évidence les interactions d'ADN sur une biopuce fonctionnalisée. Un premier travail porte ainsi sur une comparaison de chimies de greffages et l'influence du tampon sur la stabilité du duplex d'ADN. Notamment, la salinité du milieu et l'influence d'un dénaturant de l'ADN sont étudiés. Dans un deuxième temps, la méthode des rampes de température est appliquée à la détection des mutations ponctuelles sur des cibles d'ADN et ARN longues, issus de la polymerase chain reaction (PCR) ou la nucleic acid sequence based amplification (NASBA), respectivement. L'effet de compétition entre cibles mutées et l'hybridation à la surface est abordé. De plus, les structures secondaires en solutions peuvent changer la capture des cibles sur les sondes. La possibilité d'intégrer l'amplification dans un système de détection sur puce est démontrée pour la NASBA. Enfin, en collaboration avec le laboratoire des lésions d'acides nucléiques (LAN) au CEA Grenoble, une étude des interactions et de l'activité de protéines réparatrices sur l'ADN endommagé est présentée, profitant, de nouveau du choix flexible de la température.

L'objectif de ce travail est double : (i) la détection électrochimique des nucléosides sur<br />un nouveau matériau carboné d'électrode, le diamant dopé bore (BDD), et (ii) l'utilisation<br />d'un nouvel outil, la microscopie électrochimique à balayage (SECM), afin de fonctionnaliser<br />des surfaces avec des sondes oligonucléotidiques et de détecter le phénomène d'hybridation.<br />Dans un premier temps, nous montrerons la dualité d'utilisation de la microscopie<br />électrochimique en tant qu'outil de fonctionnalisation et de caractérisation de surfaces. Par<br />mode direct de la SECM, en utilisant la microélectrode en tant que contre-électrode, des<br />spots de polypyrrole-oligonucléotide de taille micrométrique sont déposés sur un substrat<br />d'or. Cette méthode d'élaboration est optimisée en étudiant l'hybridation des spots en<br />microscopie de fluorescence. La présence de ces spots sur la surface est ensuite détectée en<br />mode feedback de la SECM via la différence de conductivité entre le polypyrroleoligonucléotide<br />et l'or. Puis, le phénomène d'hybridation est étudié par mode feedback par la<br />précipitation d'un produit isolant sur la surface formé par une réaction catalysée par la<br />peroxydase couplée par l'intermédiaire d'un assemblage biologique à l'oligonucléotide<br />complémentaire. Enfin, cette technique électrochimique est couplée à une méthode optique,<br />l'imagerie de résonance plasmonique de surface (SPRi), afin de visualiser en temps réel<br />l'étape de structuration de la surface d'or par des spots d'oligonucléotides ou par des<br />gradients de surface d'oligonucléotides.<br />Dans un second temps, nous présenterons l'étude des réactions d'oxydation des<br />nucléosides, la 2'-désoxyguanosine et la 2'-désoxyadénosine, sur une électrode de diamant<br />dopée bore oxygéné. Nous montrerons ainsi l'intérêt de ce nouveau matériau carboné<br />d'électrode pour cette application en raison de sa large fenêtre d'électroinactivité en milieu<br />aqueux et son faible et stable courant de fond. Puis, nous mettrons en évidence la formation<br />d'un film continu constitué des produits de ces réactions d'oxydation sur l'électrode par une<br />étude macroscopique à l'aide de voltamétries cycliques d'une sonde redox, et une étude à<br />l'échelle microscopique en utilisant le microscope électrochimique à balayage.