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Les cellules dendritiques (DC) jouent un rôle central dans l’orchestration de la réponse immunitaire cellulaire spécifique, et des anomalies dans leur développement et/ou leur fonction peuvent être à l’origine de maladies auto-immunes. Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune qui résulte de la destruction spécifique des cellules ? du pancréas par les lymphocytes T auto-réactifs. Chez la souris NOD, modèle animal d’étude du diabète de type 1, la fonction des DC est altérée, et résulte en partie d’un défaut de la voie de signalisation JAK-STAT5. En effet, le facteur de transcription STAT5 est essentiel à la signalisation du Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF) et de la Thymie Stromal Lymphopoietin (TSLP), qui confèrent une fonction tolérogène aux DC in vitro et in vivo. De plus, les souris déficientes en STAT5b se caractérisent par une auto-immunité sévère, soulignant le rôle fondamental de STAT5b dans la tolérance immunitaire. Chez l’homme, des cas de mutations récessives du gène stat5b ont été rapportés, entraînant des maladies auto-immunes systémiques. Nous avons généré des souris NOD transgéniques exprimant de façon constitutive la forme active de STAT5b de souris C57BL/6 spécifiquement au sein des DC. Nos résultats ont montré que toutes les souris transgéniques sont protégées contre le diabète. Les analyses par cytométrie de flux ont montré une maturation plus importante des DC de souris transgéniques, ainsi qu'une augmentation de la proportion de lymphocytes T régulateurs, associée à une baisse de la population de lymphocytes T CD8+ dans la rate et les ganglions pancréatiques (PLN) et mésentériques (MLN). Les tests de prolifération in vitro ont montré une prolifération plus important de lymphocytes T CD4+ et CD8+ des souris transgéniques, et présentent un profil immunorégulateur de type TH2 et TC2 respectivement. En outre, les DC de souris transgéniques induisent une déviation immune vers un profil TH2 des lymphocytes T BDC2.5-CD4+ diabétogènes, ainsi que la conversion peptide-spécifique de lymphocytes T BDC2.5-CD4+Foxp3- diabétogènes en lymphocytes T régulateurs Foxp3+ in vitro. In vivo, les splénocytes de souris transgéniques ne transfèrent pas le diabète chez les souris NOD.SCID. De plus, le transfert de DC de souris transgéniques à des souris NOD prédiabétiques ont montré une résistance au diabète chez les souris receveuses. En conclusion, les DC exprimant de façon constitutive la forme activée de STAT5b acquièrent des propriétés tolérogènes, et protègent les souris NOD contre le diabète. Cette résistance au diabète est médiée en périphérie par l'augmentation du pool de lymphocytes T régulateurs et par l'induction d'une réponse immunorégulatrice de type TH2.

Signal Transducers and Activators of Transcription (STATs) are latent transcription factors that mediate several cellular responses. This protein family consists of seven members, STAT1 – 6 including two closely related molecules, STAT5a and STAT5b, that show 96% amino acid sequence homology and are critical for lymphoid, myeloid and erythroid cell development and function. Activated STAT proteins dimerize and translocate to the nucleus, where they bind to high-affinity DNA motifs to modulate gene expression. We recently identified STAT5b as the critical regulator of IgE-mediated cytokine production in mast cells. STAT5b knockout (KO) cells show decreased sensitivity to IgE-mediated passive systemic anaphylaxis accompanied with decreased production of IL-6 and IL-13 compared to wild type counterparts. Interestingly, STAT5b KO mice demonstrated elevated levels of serum IgE but a normal response to histamine-mediated passive systemic anaphylaxis. The current work demonstrates that STAT5b regulates mast cell function both in vivo and in vitro. Additionally, activated STAT proteins can also form tetramers through an N-terminal domain-mediated oligomerization process when bound to low-affinity tandem motifs. Dr. Warren Leonard’s laboratory generated STAT5a-STAT5b double knock-in (DKI) mice in which STAT5 proteins are phosphorylated and can form dimers but not tetramers. We have now found that bone marrow-derived mast cells from STAT5 DKI mice are defective in IgE-induced cytokine and chemokine production and exhibit defective stem cell factor (SCF)-induced migration and survival responses in vitro. Similarly, IgE-mediated passive systemic anaphylaxis is decreased in STAT5 DKI mice. These data indicate that Stat5 tetramers are critical for some aspects of mast cell function in allergic and inflammatory disease.

STAT5A et B sont des facteurs de transcription qui constituent le point de convergence de nombreux signaux extracellulaires. Parmi leurs fonctions biologiques, ils sont connus pour leur rôle dans le développement et la différentiation des cellules hématopoïétiques. Cependant, un taux d’activation et/ou d’expression élevé de ces protéines aboutit à une prolifération incontrôlée des cellules aboutissant ainsi à une leucémogenèse. Ce présent travail vise à caractériser des aptamères ADN (Apta1 et Apta2) sélectionnés préalablement au sein de notre laboratoire contre STAT5B afin de réguler son activité dans le contexte leucémique. Les aptamères ADN sont des oligonucléotides simple brin qui adoptent une structure 3D et interagissent de manière spécifique avec leurs cibles. Contrairement aux anticorps, ils sont peu immunogènes ; ils possèdent alors un potentiel thérapeutique intéressant. La première partie de ce projet se focalise sur l’étude de la capacité d’Apta1 et Apta2 à interagir avec la forme cellulaire et recombinante de STAT5B par pull down et calorimétrie à titrage isotherme. La seconde partie concerne l’évaluation de l’activité d’Apta2 par l’étude de son effet sur la viabilité d’un modèle de leucémie myéloïde chronique et sur sa capacité à perturber la voie de signalisation impliquant STAT5. / STAT5A and B are common transcription factors that constitute a convergent point for many cellular pathways. Among their multiple biological functions, they are well known in promoting immune cell development and differentiation. When some oncogenic mutations occur, STAT5A and B are highly activated leading to uncontrolled proliferation and then to leukemia. Thus, they constitute a prime target to therapeutic intervention. In this work, we characterize new DNA aptamers (Apta1 and Apta2) selected previously by our laboratory against STAT5B. DNA aptamers are single stranded DNA molecules that can adopt 3D structures and recognize specific targets. Unlike antibodies, they fail to induce the immune response: they emerge as potentiel therapeutic molecules. In the first part of this work, the selected aptamers were assessed on their ability to interact with the cellular and recombinant form of STAT5B by using pull down assay and Isothermal Titration Calorimetry. In the second part, we focused on evaluating the effect of Apta2 on chronic myeloid leukemia cell line. For this purpose, cell viability, apoptosis process and JAK-STAT5 signaling pathway were depicted when cells are treated with Apta2.

La contribution des DCs dans l’initiation et la perpétuation des maladies auto-immunes est bien établie. Chez la souris Non Obèse Diabétique (NOD), modèle spontané du diabète de type 1 (DT1), plusieurs travaux ont rapportés des anomalies phénotypiques et fonctionnelles des DCs. Les DCs sont parmi les premières cellules qui infiltrent les ilots pancréatiques, produisent des quantités excessives de cytokines pro-inflammatoires et contribuent à l’activation des lymphocytes T auto-réactifs (Teff). Cette capacité accrue des DCs à activer les Teffs est régulée par plusieurs voies de signalisation intracellulaire. STAT5 est parmi les facteurs de transcription critiques dans la régulation des gènes associés au développement, la maturation et les fonctions des DCs. La prédisposition au DT1 chez la NOD est déterminée par plusieurs régions de susceptibilités au diabète (idd1-20). De façon intéressante, le gène Stat5b est localisé dans la région de susceptibilité idd4 chez la souris NOD suggérant son implication dans le développement du diabète. En effet des études récentes ont identifiés un dysfonctionnement dans la voie de signalisation JAK-STAT5 chez les souris NOD, y compris la présence d’une mutation (L327M) au niveau du domaine de liaison à l’ADN de Stat5b qui altère sa liaison à l’ADN. Par ailleurs, les études réalisées dans notre laboratoire ont montré que le conditionnement des DCs au GM-CSF ou à la TSLP, qui activent la voie de signalisation Jak-Stat5, constitue une voie potentielle d’immunothérapie chez la souris NOD. Ces données suggèrent un rôle central de Stat5b dans la régulation des fonctions tolérogènes des cellules du système immunitaire. Nous avons généré un modèle de souris NOD transgéniques (NOD.CD11cStat5b-CA) exprimant de façon constitutive la forme active de STAT5B de la souris C57BL/6 spécifiquement dans les DCs. Nos résultats ont montré que ces souris transgéniques ont développées une protection totale contre le diabète auto-immun. Cette résistance au diabète à long terme est associe à l’acquisition des fonctions tolérogènes par les Stat5b-CA.DCs qui se manifestent par un phénotype mature tolérogène, marquées par une forte expression de molécules immunorégulatrices (PD-L1 et PD-L2) et une grande production de cytokines anti-inflammatoire (TGF-β) et une baisse significative de la production de cytokines pro-inflammatoires (IL-12p70, TNF-α et d’IL-23). Par ailleurs, nous avons mis en évidence le rôle de STAT5B dans la régulation à la hausse d’IRF4 et l’implication du complexe STAT5B/EZH2 dans le contrôle de la régulation à la baisse d’IRF8. En effet, cette régulation différentielle de l’expression des gènes Irf4 et Irf8 est accompagnée du développement d’une sous population CD11c+ CD11b+ DCs. Nos études ont démontré que le potentiel tolérogène des Stat5b-CA.DCs à rétablir et à maintenir la tolérance périphérique du système immunitaire vis-à-vis des auto-antigènes est associe à leur grande capacité d’induire la conversion et l’expansion des Tregs ainsi que la différentiation de deux populations cellulaires régulatrices Th2 et Tc2. Nous avons aussi démontré in vivo qu’une injection intraveineuse unique de Stat5-CA.DCs (spléniques ou générés de la moelle osseuse) ou de Tregs des souris transgéniques NOD.CD11cStat5b-CA a induit une protection totale contre le diabète chez les souris NOD receveuses. Notre étude apporte donc une évidence claire que la correction du défaut de la voie de signalisation Jak-Stat5b au sein des DC chez la souris NOD induit une protection à long terme contre le diabète. Finalement, cette voie de signalisation peut constituer une cible thérapeutique éventuelle non seulement dans le contexte du diabète de type 1 mais également dans d’autres maladies auto-immunes. / The contribution of DCs in the initiation and progression of autoimmune diseases is well established. Several studies have reported that phenotypic and functional abnormalities of DCs, in Non Obese Diabetic (NOD), contribute to spontaneous type 1 diabetes (T1D) development. DCs are among the first cells that infiltrate the pancreatic islets, produce excessive amounts of pro-inflammatory cytokines, and contribute to the activation of T effector cells (Teff). This increased ability of DCs to activate Teff is regulated by several intracellular signaling pathways. STAT5 is among the critical transcription factors in the regulation of genes associated with the development, maturation and functions of DCs. The predisposition to T1D in NOD is determined by several regions of susceptibility to diabetes (idd1-20). Interestingly, the Stat5b gene is located in the idd4 susceptibility region in NOD mice suggesting its involvement in the development of diabetes. Recent studies have identified a dysfunction in the Jak-Stat5 signaling pathway in NOD mice, including the presence of a mutation (L327M) at the DNA-binding domain of Stat5b which alters its binding to DNA. Furthermore, previous studies from our laboratory have shown that the GM-CSF- or TSLP-conditioned DCs, which activate the Jak-Stat5 signaling pathway, is a potential pathway for immunotherapy in NOD mice. These data suggest a central role for Stat5b in the regulation of tolerogenic functions of the immune cells. Here, we generated a transgenic NOD mouse model (NOD.CD11cStat5b-CA) that constitutively express the active form of STAT5B from the C57BL/6 mouse specifically in DCs. Our results showed that these transgenic mice are completely protected against autoimmune diabetes. This long-term diabetes protection is associated with the acquisition of tolerogenic functions by Stat5b-CA.DCs, that exhibit a mature tolerogenic phenotype, overexpression of immunoregulatory molecules (PD-L1 and PD-L2) and produce anti-inflammatory cytokines (TGF-β) and a significantly decrease their production of pro-inflammatory cytokines (IL-12p70, TNF-α and IL-23). Moreover, we have highlighted the role of STAT5B in the upregulation of IRF4 and also the involvement of the STAT5B/ EZH2 complex in downregulation of IRF8. This differential regulation of the Irf4 and Irf8 genes expression is accompanied by promoting the development of CD11c+CD11b+ DC subset. Furthermore, we demonstrated that the tolerogenic Stat5b-CA.DCs were able to restore and maintain peripheral immune tolerance to autoantigens, which is associated with their high ability to induce conversion and expansion Tregs and to promote Th2 and Tc2 immune deviation. We also demonstrated that a single intravenous injection of Stat5-CA.DCs (splenic or bone marrow derived dendritic cells) or Tregs from transgenic mice NOD.CD11cStat5b-CA halted ongoing diabetes in recipient NOD mice. Thus, our study provides clear evidence that the correction of the Jak-Stat5b signaling pathway defect in DC of NOD mice induces long-term protection against diabetes suggesting that signaling pathway can be a potential therapeutic target not only in the context of type 1 diabetes but also in other autoimmune diseases.