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Cold-adapted (ca) live attenuated influenza vaccines (LAIVs) have been introduced as alternatives to existing inactivated influenza vaccines. The influenza A components of the FDA-approved ca LAIVs (Flumist®; Medimmune) have common internal genes derived from the donor strain A/Ann Arbor/6/60 ca and surface genes derived from current wild-type (wt) epidemic strains. The aim of this thesis was to investigate determinants of immunogenicity for reassortants of A/Ann Arbor/6/60 ca, using a range of immunological assays, including recently developed MHC tetramer techniques. From the study, the extent of viral replication in the respiratory tract of mice, the primary site of inoculation, was a key factor in determining ca vaccine immunogenicity. Replication was shown to be influenced by both viral surface Ags and the host MHC. The H3 ca reassortants CR6, CR18, CR29 and CR6-35* exhibited greater replication efficiency (as determined by their PFU:HAU ratios) than the H1 ca reassortants CR35 and CR6-35. The H3 ca reassortant CR6 caused a 3.79% loss in body weight but no losses were observed for the H1 ca reassortant CR35 and the ca H2N2 donor strain A/Ann Arbor/6/60 ca. Higher HI responses were detected after 3 weeks in groups infected with the H3 ca reassortant CR6 (GMT 80) than with the H1 reassortant CR35 (GMT 10) and the H2 ca donor strain A/Ann Arbor/6/60 ca (GMT 13). Recently developed techniques were used to evaluate specific T-cell response to ca LAIVs. Fluorescent-labelled tetramer is the key reagent for use in tetramer-based flow cytometry assays. The NP366-374 peptide of influenza A viruses comprises an immunodominant epitope that is highly conserved between subtypes. Tetramers developed for A/PR/8/34 (H1N1) were able to detect NP-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) induced by A/Ann Arbor /6/60 ca (H2N2). An attempt to prepare the A/Ann Arbor/6/60 ca-specific-NP-tetramer is described. H-2Db monomers were successfully refolded with the peptide, but only 20% were able to form tetramers through biotin-streptavidin linkage, resulting in a poor capacity to stain. By contrast, an IFN-γ ICC assay developed in parallel demonstrated that peptide NP366-374 was able to restimulate A/Ann Arbor/6/60 NP ca-specific CTLs and secrete IFN-γ when tested in vitro. Specific-B and T cell responses induced in the lungs in response to infection by ca reassortants exhibited great variability that was determined by the growth characteristics of different viruses. Type I (CTL) responses were induced by low yielding ca reassortants, such as CR35 (H1N1). Viruses with enhanced growth characteristics, such as CR6 (H3N2), produced higher Type II (HA-specific Ab) responses. In addition, host factors, such as MHC type, were found to play an important role in responses to the same viruses. Susceptible mouse strains, such as C57BL/6, showed higher CTL but lower serum Ab responses than more resistant strains, such as BALB/c. Throughout this PhD project, a fine balance between the humoral and CMI, local and systemic immune responses induced by ca LAIVs was demonstrated. The need to assess local immune responses, in addition to serum antibody levels, for the evaluation of vaccine efficacy was an important conclusion of the thesis.

T cells are an essential part of the adaptive immune system and protect the body from intracellular infections. The specificity with which αßTCR-bearing T cells recognize cognate antigen presented on MHC molecules is paramount to maintaining the balance between mounting effector functions against pathogens and establishing peripheral tolerance to self. The mechanism by which T cells translate qualitative differences in TCR:pMHC binding to sensitive proximal signalling events which ultimately result in specific Tcell effector responses to infected cells but not to self is mostly unknown. To address how T cell signalling responds to qualitative differences in TCR triggering by pMHC, I established a system of stimulating T cells bearing the 1G4 TCR specifically in vitro with a panel of four NY-ESO-1_156-165 peptide variant MHC tetramers. Single amino acid substitutions to the NY-ESO-1_156-165 peptide conferred a maximum 35-fold difference in the monomeric affinity for the 1G4 TCR. The system allows the highly controlled investigation of very rapid TCR proximal signalling events simultaneously and quantitatively using flow cytometry. Stimulations with pMHC tetramers showed rapid sensitive sequential signalling responses which were able to confer ligand discrimination. Very early signalling events such as CD3ζ phosphorylation showed analogue responses to the different affinity pMHC tetramers. Later signalling events including phospho-ERK showed a distinct on/off switch-like response. The amplitude of the very early analogue signalling responses determined the extent of later digital ERK signals. This indicates that a certain analogue signalling threshold must be passed to result in T cell activation. The thymocyte protein Themis has been shown proximal TCR signalling to modulate thymocyte selection thresholds. Its deletion results in profound defects in positive thymocyte selection. Themis locates to the LAT signalosome of the TCR signalling cascade via Grb2, yet its molecular function is unknown. Employing the system I established, I demonstrate that Themis-k/d cells show increased levels of CD3z-chain phosphorylation, phospho-ERK signalling and signal-induced apoptosis which was independent of the ERK signal. This shows that Themis is a global attenuator of proximal TCR signalling. We are currently investigating possible associations of Themis to proteins phosphastases such as SHP-1 which could attenuate TCR proximal protein tyrosine signalling events.

L’immunothérapie allergénique (ITA) est la seule thérapie capable d’agir sur l’étiologie des allergies. La compréhension des mécanismes d’action de ce traitement et la mise en évidence de biomarqueurs d’efficacité favoriserait l’optimisation de l’ITA. A l’aide des tétramères de classe II, nous avons suivi les lymphocytes T CD4 périphériques spécifiques d’allergènes, acteurs centraux de la réaction allergique, dans des conditions normales, pathologiques ou en cours d’ITA, afin d’établir un lien entre ces trois situations physiologiques. Nous avons mis en évidence des différences entre les réponses lymphocytaires T CD4 spécifiques d’allergènes saisonniers et perannuels, chez les individus sains et allergiques. Puis, lors de 2 études cliniques d’ITA sublinguale, l’une menée chez des adultes allergiques aux pollens de graminées traités pendant 4 mois et l’autre menée chez des enfants allergiques aux acariens traités pendant 1, nous avons respectivement observé une diminution des lymphocytes Th2A et une augmentation de la production d’IFN- γ liées au traitement. Toutefois, ces variations ne corrèlent pas avec l’efficacité clinique de l’ITA observée dans ces deux études. Les limites d’utilisation des tétramères de classe II nous ont amené à rechercher si l’expression de marqueurs d’activation membranaires pouvait remplacer un marquage « tétramère ». Alors qu’une corrélation insuffisante a été observée entre le marquage « tétramère » et l’expression des marqueurs d’activation testés, nous avons mis en évidence 3 populations cellulaires aux propriétés fonctionnelles diverses, soulignant l’hétérogénéité des réponses lymphocytaires spécifiques d’allergènes. De plus, la découverte des lymphocytes Th2A pourrait être une approche prometteuse pour le suivi des réponses lymphocytaires T CD4 spécifiques d’allergènes lors d’ITA à plus long terme. / Allergenic immunotherapy (AIT) is currently the only curative treatment for allergic disease. Whereas efficacy of this treatment is well established, its mechanisms of action are not clearly understood and predictive as well as surrogate biomarkers are needed to further support AIT development. We focused on allergen specific CD4 T cells, highly involved in allergic inflammation, and monitored their responses both in normal and pathologic conditions, or during AIT. Using MHC class II tetramers, we highlighted distinct patterns of polarization between seasonal and perennial allergen-specific CD4 T cells as well as between healthy and allergic individuals. Then, allergen-specific CD4 T cell responses were monitored during 2 double-blind placebo-controlled sublingual AIT clinical trials. After short term AIT (4 months), we observed a decrease of Th2A cells, a newly define subset, thought to contain most allergen-specific CD4+ T cells. IFN-γ production was increased after one year of treatment. However, these variations were not related to AIT clinical efficacy. We further compared the expression of various activation markers and MHC class II tetramer staining following in vitro stimulation in order to circumvent inherent limitation of tetramers. No correlation could be established between tetramer staining and the expression of multiple activation markers in allergen-stimulated CD4 T cells. Combining these methods helps understanding patient heterogeneity regarding CD4 T cell responses. Moreover, Th2A cells detection is likely a promising approach to identify allergen-specific CD4 T cell during long-term AIT.

Signal Transducers and Activators of Transcription (STATs) are latent transcription factors that mediate several cellular responses. This protein family consists of seven members, STAT1 – 6 including two closely related molecules, STAT5a and STAT5b, that show 96% amino acid sequence homology and are critical for lymphoid, myeloid and erythroid cell development and function. Activated STAT proteins dimerize and translocate to the nucleus, where they bind to high-affinity DNA motifs to modulate gene expression. We recently identified STAT5b as the critical regulator of IgE-mediated cytokine production in mast cells. STAT5b knockout (KO) cells show decreased sensitivity to IgE-mediated passive systemic anaphylaxis accompanied with decreased production of IL-6 and IL-13 compared to wild type counterparts. Interestingly, STAT5b KO mice demonstrated elevated levels of serum IgE but a normal response to histamine-mediated passive systemic anaphylaxis. The current work demonstrates that STAT5b regulates mast cell function both in vivo and in vitro. Additionally, activated STAT proteins can also form tetramers through an N-terminal domain-mediated oligomerization process when bound to low-affinity tandem motifs. Dr. Warren Leonard’s laboratory generated STAT5a-STAT5b double knock-in (DKI) mice in which STAT5 proteins are phosphorylated and can form dimers but not tetramers. We have now found that bone marrow-derived mast cells from STAT5 DKI mice are defective in IgE-induced cytokine and chemokine production and exhibit defective stem cell factor (SCF)-induced migration and survival responses in vitro. Similarly, IgE-mediated passive systemic anaphylaxis is decreased in STAT5 DKI mice. These data indicate that Stat5 tetramers are critical for some aspects of mast cell function in allergic and inflammatory disease.

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une déplétion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en l’absence de traitements anti-rétroviraux, conduit inéluctablement à la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mécanismes impliqués dans ce dysfonctionnement de la réponse cellulaire T ont été élucidés et ont révélé un rôle important de la molécule PD-1 dans l’exhaustion des cellules T en phase chronique de l’infection. En effet, des niveaux élevés de PD-1 ont été associés à une charge virale élevée ainsi qu’à une diminution de la production de cytokines et de la capacité de proliférer des cellules T spécifiques du virus. De plus, bloquer in vitro l’interaction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rétabli la fonction de ces cellules. De façon intéressante, notre groupe ainsi que d’autres équipes, ont montré que l’expression de PD-1 était non seulement augmentée sur les cellules spécifiques de l’antigène mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant à l’impact de l’expression de PD-1 sur le renouvellement et la différenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de l’infection. L’expression de PD-1 n’a notamment pas été étudiée en phase aigue de l’infection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue qu’en phase chronique de l’infection, l’expression de PD-1 est augmentée sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naïves. Nous avons également mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phénotype plus différencié, et ce à tous les stades de la maladie. Dans cette thèse, nous discutons le rôle possible de PD-1 dans l’homéostasie des cellules T chez les individus infectés par le VIH-1. En étudiant la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection, nous avons trouvé que les sous-populations T CD8+ des individus récemment infectés exprimaient moins de PD-1 que celles des individus à un stade plus avancé de la maladie. Ces niveaux plus élevés de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associés à des niveaux réduits de prolifération in vivo – comme mesuré par l’expression de Ki67 – suggérant que l’expression de PD-1 est partiellement impliquée dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naïves s’accumulent en fréquence lors de la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection. Considérant que les cellules naïves expriment déjà des hauts niveaux de PD-1, nous avons émis l’hypothèse que l’activation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infectés est affectée. En résumé, nous proposons un modèle où des hauts niveaux d’expression de PD-1 sont associés à (1) un dysfonctionnement de la réponse cellulaire T CD8+ et (2) un défaut d’activation des cellules naïves ce qui contribue non seulement à la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter l’efficacité de potentiels vaccins dans l’infection par le VIH-1 en empêchant toute nouvelle réponse d’être initiée. Afin de mieux disséquer la réponse immunitaire mise en place lors d’une infection comme celle du VIH-1, nous avons développé un outil qui permet de détecter les cellules T CD4+ i.e. des tétramères de CMH de classe II. Ces réactifs ont pour but d’augmenter l’avidité du CMH de classe II pour son ligand et donc de détecter des TCR de faible affinité. Dans cette thèse, nous décrivons une méthode originale et efficace pour produire diverses molécules de HLA-DR liant de façon covalente le peptide antigénique. Mieux déterminer les mécanismes responsables de l’exhaustion des cellules T dans l’infection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que développer des outils de pointe pour suivre ces réponses T, est central à une meilleure compréhension de l’interaction entre le virus et le système immunitaire de l’hôte, et permettra ainsi le développement de stratégies pertinentes pour lutter contre l’infection par le VIH-1. / HIV-1 infection leads to a progressive CD4+ T cell depletion and T cell dysfunction, which in the absence of successful anti-retroviral therapy, results in individuals progressing to AIDS. Some of the underlying mechanisms for this T cell dysfunction have been elucidated and reveal an important role for the inhibitory receptor program death-1 (PD-1) in T cell exhaustion during chronic HIV-1 infection. Indeed, PD-1 up regulation correlates with increased viral load as well as decreased cytokine production and proliferative capacity of HIV-1 specific T cells. Moreover, blocking in vitro the interaction of PD-1 with its counter-receptor PD-L1 using antibodies restores HIV-1 specific T cell effector functions. Interestingly, our group and others have shown that levels of PD-1 during chronic HIV-1 infection are not only up regulated on virus-specific T cells but also on the total pool of CD4+ and CD8+ T cells. However, little is known about the impact of PD-1 expression on the turnover and maturation status of the PD-1 expressing cells during the course of the disease. Of note, PD-1 expression has never been investigated in acute HIV-1 infection. In this thesis, we clearly show that, in both acutely and chronically HIV-1 infected individuals, PD-1 is up regulated on all T cell subsets, including naïve T cells. We also uncovered an abnormal distribution of T cell subsets toward a more differentiated phenotype at all stages of the disease. In this thesis, we discuss the possible role of PD-1 in the homeostasis breakdown observed in HIV-1 infected individuals. More interestingly, if we focus on the transition from the acute to the chronic phase of the infection, we found that PD-1 is expressed at much lower levels on total CD8+ T cell subsets from acutely infected individuals than chronically infected individuals. These augmented PD-1 expression levels on CD8+ T cell in chronic infection are associated with reduced levels of in vivo cell proliferation - as monitored by Ki67 expression - suggesting that PD-1 expression may be partially responsible for the loss of CD8+ T cell function. In addition, naïve T cells accumulate in frequency during the transition from the acute to the chronic phase of the infection. Considering that naïve T cells already express high levels of PD-1, we hypothesize that priming of T cell might be impaired in chronically infected individuals. Altogether, we propose a model where high PD-1 expression is associated with (1) impaired CD8+ T cell function in chronic HIV-1 infection and suggest that lower levels of PD-1 may partially preserve the CD8+ T cell function and (2) impaired priming of T cells contributing to the progressive immunodeficiency in HIV-1 infection but also limiting the effectiveness of vaccine strategies by preventing any new responses to be triggered. To better understand immune responses in infection such as HIV-1 disease, we next developed multimeric reagents for the detection of CD4+ T cells, namely tetramers of HLA-DR molecules. These reagents aim at increasing the overall avidity of peptide-MHC class II complexes to detect low affinity TCRs. In this thesis, we describe a versatile and efficient method to produce different soluble HLA-DR molecules covalently linked to antigenic peptides. Gaining further insights into mechanisms underlying T cell exhaustion and disease progression, in addition to the development of state-of-the-art immune monitoring tools, will be crucial in better understanding of the interplay between the virus and the host immune system, leading to rational strategies in the fight against the AIDS epidemic.

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une déplétion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en l’absence de traitements anti-rétroviraux, conduit inéluctablement à la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mécanismes impliqués dans ce dysfonctionnement de la réponse cellulaire T ont été élucidés et ont révélé un rôle important de la molécule PD-1 dans l’exhaustion des cellules T en phase chronique de l’infection. En effet, des niveaux élevés de PD-1 ont été associés à une charge virale élevée ainsi qu’à une diminution de la production de cytokines et de la capacité de proliférer des cellules T spécifiques du virus. De plus, bloquer in vitro l’interaction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rétabli la fonction de ces cellules. De façon intéressante, notre groupe ainsi que d’autres équipes, ont montré que l’expression de PD-1 était non seulement augmentée sur les cellules spécifiques de l’antigène mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant à l’impact de l’expression de PD-1 sur le renouvellement et la différenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de l’infection. L’expression de PD-1 n’a notamment pas été étudiée en phase aigue de l’infection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue qu’en phase chronique de l’infection, l’expression de PD-1 est augmentée sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naïves. Nous avons également mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phénotype plus différencié, et ce à tous les stades de la maladie. Dans cette thèse, nous discutons le rôle possible de PD-1 dans l’homéostasie des cellules T chez les individus infectés par le VIH-1. En étudiant la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection, nous avons trouvé que les sous-populations T CD8+ des individus récemment infectés exprimaient moins de PD-1 que celles des individus à un stade plus avancé de la maladie. Ces niveaux plus élevés de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associés à des niveaux réduits de prolifération in vivo – comme mesuré par l’expression de Ki67 – suggérant que l’expression de PD-1 est partiellement impliquée dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naïves s’accumulent en fréquence lors de la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection. Considérant que les cellules naïves expriment déjà des hauts niveaux de PD-1, nous avons émis l’hypothèse que l’activation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infectés est affectée. En résumé, nous proposons un modèle où des hauts niveaux d’expression de PD-1 sont associés à (1) un dysfonctionnement de la réponse cellulaire T CD8+ et (2) un défaut d’activation des cellules naïves ce qui contribue non seulement à la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter l’efficacité de potentiels vaccins dans l’infection par le VIH-1 en empêchant toute nouvelle réponse d’être initiée. Afin de mieux disséquer la réponse immunitaire mise en place lors d’une infection comme celle du VIH-1, nous avons développé un outil qui permet de détecter les cellules T CD4+ i.e. des tétramères de CMH de classe II. Ces réactifs ont pour but d’augmenter l’avidité du CMH de classe II pour son ligand et donc de détecter des TCR de faible affinité. Dans cette thèse, nous décrivons une méthode originale et efficace pour produire diverses molécules de HLA-DR liant de façon covalente le peptide antigénique. Mieux déterminer les mécanismes responsables de l’exhaustion des cellules T dans l’infection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que développer des outils de pointe pour suivre ces réponses T, est central à une meilleure compréhension de l’interaction entre le virus et le système immunitaire de l’hôte, et permettra ainsi le développement de stratégies pertinentes pour lutter contre l’infection par le VIH-1. / HIV-1 infection leads to a progressive CD4+ T cell depletion and T cell dysfunction, which in the absence of successful anti-retroviral therapy, results in individuals progressing to AIDS. Some of the underlying mechanisms for this T cell dysfunction have been elucidated and reveal an important role for the inhibitory receptor program death-1 (PD-1) in T cell exhaustion during chronic HIV-1 infection. Indeed, PD-1 up regulation correlates with increased viral load as well as decreased cytokine production and proliferative capacity of HIV-1 specific T cells. Moreover, blocking in vitro the interaction of PD-1 with its counter-receptor PD-L1 using antibodies restores HIV-1 specific T cell effector functions. Interestingly, our group and others have shown that levels of PD-1 during chronic HIV-1 infection are not only up regulated on virus-specific T cells but also on the total pool of CD4+ and CD8+ T cells. However, little is known about the impact of PD-1 expression on the turnover and maturation status of the PD-1 expressing cells during the course of the disease. Of note, PD-1 expression has never been investigated in acute HIV-1 infection. In this thesis, we clearly show that, in both acutely and chronically HIV-1 infected individuals, PD-1 is up regulated on all T cell subsets, including naïve T cells. We also uncovered an abnormal distribution of T cell subsets toward a more differentiated phenotype at all stages of the disease. In this thesis, we discuss the possible role of PD-1 in the homeostasis breakdown observed in HIV-1 infected individuals. More interestingly, if we focus on the transition from the acute to the chronic phase of the infection, we found that PD-1 is expressed at much lower levels on total CD8+ T cell subsets from acutely infected individuals than chronically infected individuals. These augmented PD-1 expression levels on CD8+ T cell in chronic infection are associated with reduced levels of in vivo cell proliferation - as monitored by Ki67 expression - suggesting that PD-1 expression may be partially responsible for the loss of CD8+ T cell function. In addition, naïve T cells accumulate in frequency during the transition from the acute to the chronic phase of the infection. Considering that naïve T cells already express high levels of PD-1, we hypothesize that priming of T cell might be impaired in chronically infected individuals. Altogether, we propose a model where high PD-1 expression is associated with (1) impaired CD8+ T cell function in chronic HIV-1 infection and suggest that lower levels of PD-1 may partially preserve the CD8+ T cell function and (2) impaired priming of T cells contributing to the progressive immunodeficiency in HIV-1 infection but also limiting the effectiveness of vaccine strategies by preventing any new responses to be triggered. To better understand immune responses in infection such as HIV-1 disease, we next developed multimeric reagents for the detection of CD4+ T cells, namely tetramers of HLA-DR molecules. These reagents aim at increasing the overall avidity of peptide-MHC class II complexes to detect low affinity TCRs. In this thesis, we describe a versatile and efficient method to produce different soluble HLA-DR molecules covalently linked to antigenic peptides. Gaining further insights into mechanisms underlying T cell exhaustion and disease progression, in addition to the development of state-of-the-art immune monitoring tools, will be crucial in better understanding of the interplay between the virus and the host immune system, leading to rational strategies in the fight against the AIDS epidemic.