Cette thèse a pour objectif d’identifier et caractériser des biomarqueurs liés aux traitements d’immunothérapie allergénique (ITA). En particulier, le travail s’est porté sur les biomarqueurs prédictifs de l’efficacité du traitement : leur estimation avant la prise médicamenteuse permettrait d’évaluer les bénéfices cliniques à l’issue de l’ITA. À partir d’échantillons de sérum collectés avant ITA et provenant de patients inclus dans une étude clinique contrôlée, randomisée et dirigée contre les pollens de graminées, une méthode d’analyse protéomique différentielle (la 2D-DIGE) a permis d’identifier une protéine comme candidat biomarqueur prédictif de l’efficacité de l’ITA. Dans un premier temps, les variants moléculaires de la protéine identifiée ont été caractérisés. L’analyse en spectrométrie de masse de la protéine a permis d’identifier les modifications post-Traductionnelles associées aux isoformes plus abondants dans le sérum des patients pour lesquels une réponse positive à l’ITA est observée. Une approche protéomique de quantification relative a été mise en œuvre par LC-MS/MS sans marquage, et a permis d’identifier des peptides de la protéine d’intérêt, portant des modifications post-Traductionnelles spécifiques, associés à un bénéfice clinique accru en fin d’ITA. Dans un deuxième temps, l’implication de la fétuine-A dans la physiopathologie de l’allergie a été étudiée. Des modèles cellulaires humains ont mis en évidence le caractère essentiel des acides sialiques portés par la protéine pour l’activation de la voie TLR4, dans les mécanismes de l’immunité innée initiant la réaction allergique. In vivo, les modèles murins d’asthme allergique développés ont en revanche montré la fonction anti-Inflammatoire de la protéine. La fétuine-A a donc un rôle ambivalent, mais est indubitablement liée à la régulation de l’inflammation allergique. La validation des candidats biomarqueurs peptidiques de la protéine dans d’autres cohortes cliniques représente une future étape clé, qui permettrait d’envisager l’usage de ces marqueurs en clinique, pour améliorer la sélection des patients les plus susceptibles de répondre à l’ITA. / This thesis aimed at identifying and characterizing predictive biomarkers associated with allergen-Specific immunotherapy (AIT) efficacy. In particular, we were focused on biomarkers predictive of AIT efficacy: quantifying such markers before treatment would allow estimating the final clinical benefit. For this purpose, serum samples were collected before AIT from patients included in a double-Blind, placebo controlled clinical study against grass pollen allergy. Their analysis by means of differential proteomics (2D-DIGE) pointed out a protein, named fetuin-A, as a candidate biomarker predictive of AIT efficacy. First, the protein fetuin-A isoforms were extensively characterized by mass spectrometry, and specific post-Translational modifications (PTMs) were associated to the isoforms more abundant in sera from patients positively responding to AIT. A second proteomic approach allowed identifying fetuin-A peptides, differentially expressed among groups of patients. Some peptides from the candidate protein, bearing specific post-Translational modifications (PTMs), are associated with an increased clinical benefit at the end of the treatment. In a second part, we studied the involvement of the fetuin-A during the course of allergic inflammation. Human cellular assays highlighted that sialic acids on the protein PTMs are essential to activate the TLR4 pathway, and inducing innate immune mechanisms linked to allergy. In vivo, murine models of allergic asthma showed an opposite anti-Inflammatory function of the protein. Thus, the protein fetuin-A is still ambivalent, but is undoubtedly linked to the regulation of allergic inflammation. Validation of peptides candidate biomarkers in larger clinical cohorts is of utmost interest, since using such biomarkers in clinics would improve patients’ selection and therefore clinical benefit from the treatment.

Identification et caractérisation d'une population d'ILC2 associée à la sévérité de la rhinite allergique et de l'asthmeTrois catégories de cellules lymphoïdes innées (innate lymphoid cells, ILC) ont été décrites récemment sur la base de leurs phénotypes et leurs caractéristiques fonctionnelles : les ILC1, ILC2 et ILC3. Les ILC2 semblent avoir un rôle pro-inflammatoire important dans l’allergie en raison de leur capacité à produire de grandes quantités de cytokines TH2.Pour mieux comprendre le rôle de ces cellules dans l’allergie respiratoire, nous avons comparé les ILC sanguines de patients atteints d’une rhinite allergique associée ou non à un asthme, à celles de sujets non allergiques. Cette étude révèle de multiples différences fonctionnelles entre les ILC circulantes de sujets sains et allergiques. Notamment, la fréquence d’ILC2 exprimant le récepteur aux chimiokines CCR10 est augmentée dans le sang de patients asthmatiques sévères.CCR10 pouvant permettre le recrutement des ILC vers les organes cibles, le rôle des ILC2 CCR10+ dans la physiopathologie de l’asthme a été étudié. Leur présence dans les poumons humains a été observée. Des analyses fonctionnelles et phénotypiques ont révélé que cette sous-population cellulaire était peu activée mais présentait une plasticité leur conférant des caractéristiques proches des ILC1. La déplétion de ces cellules dans un modèle murin d’asthme allergique aggrave l’hyperréactivité bronchique.Les travaux de cette thèse documentent le rôle des ILC dans l’asthme. En particulier, la fréquence sanguine d’ILC2 CCR10+ augmente avec la sévérité de la maladie. Les résultats obtenus dans les modèles animaux suggèrent que ces cellules auraient un rôle bénéfique dans le contrôle de l’asthme. La voie du CCR10 pourrait représenter une nouvelle cible pour le développement de traitements innovants contre l’asthme ou une source prometteuse de biomarqueurs. / Identification and characterization of an ILC2 subset linked to allergic rhinitis and asthma severityInnate lymphoid cells (ILCs) have been classified into ILC1, ILC2 and ILC3 subsets based on their respective phenotypes and functions. Considering the strong ability of ILC2s to produce TH2 cytokines, these cells likely play a significant role in allergic diseases.To better understand the role of these cells in respiratory allergies, we compared blood ILCs from allergic patients with or without asthma to non-allergic individuals. Together our results show multiple functional differences between ILC from allergic and healthy subjects. In particular, ILC2s expressing the chemokine receptor CCR10 are specifically enriched in the blood of patients with severe allergic asthma.Considering that CCR10 could allow the recruitment of ILCs to target organs, the role of CCR10+ ILC2s in asthma physiopathology has been studied. This ILC2 subtype is present in human lungs. Functional and phenotypic analyses revealed that these cells are less activated than other ILC2s and show ILC1-like properties. CCR10+ ILC2s depletion in a mouse model of allergic asthma exacerbate airway hyperreactivity.Together, this work documents the role of ILCs in asthma. Specifically, circulating CCR10+ ILC2 frequency increases with asthma severity. The results obtained in mouse models suggest that these cells could have a beneficial role in asthma control. CCR10 pathway could represent a new target to elaborate breakthrough treatments against asthma or a source of promising biomarkers.

L’allergie ou l’hypersensibilité de type I est une réponse inappropriée du système immunitaire à une substance étrangère à l’organisme, nommée « allergène ». L’immunothérapie allergénique (ITA) est actuellement le seul traitement sur le marché qui permet de traiter l’étiologie de la maladie allergique par opposition aux traitements symptomatiques qui diminuent temporairement les manifestations allergiques. Son action consiste à réduire la sensibilité de l’organisme vis-à-vis de l’allergène en modulant progressivement la réponse immunitaire dirigée contre ce dernier. L’objectif de cette thèse était de définir des biomarqueurs d’efficacité clinique utilisables dans le cadre des traitements de l’ITA. La stratégie de recherche est basée sur une hypothèse qui consiste à suggérer que les cellules dendritiques (DCs) sont impliquées dans le succès de l’immunothérapie. En particulier, nous supposons que le traitement induit une baisse des DCs de type 2 (DC2), qui induisent des lymphocytes T auxiliaires de type 2 (TH2), et une augmentation des DCs régulatrices (DCreg), qui induisent des lymphocytes T régulateurs. La première partie de cette thèse a consisté à mettre au point des conditions de culture induisant des DC2. Pour cela, un criblage de molécules biologiques et pharmacologiques a été entrepris sur les DCs dérivées des monocytes afin d’induire in vitro des DC2 et a conduit à la mise au point d’un mélange de plusieurs molécules, dont certaines sont impliquées dans les mécanismes de l’allergie. Le phénotype des DC2 obtenu a été étudié ainsi que la polarisation des lymphocytes T induite après co-cultures en comparaison avec des DCs de type 1 (DC1) et des DCreg.La deuxième partie de cette thèse a consisté à analyser, à l’échelle moléculaire, les différents types de DCs induites (DC1, DC2 et DCreg). Pour cela, deux techniques ont été utilisées, une analyse transcriptomique par puces à ADN et une analyse protéomique par spectrométrie de masse sans marquage, pour comparer le transcriptome et le protéome des DCs induites. Le différentiel d’expression des marqueurs les plus pertinents a été validé au niveau transcriptionnel et protéique.Dans la troisième partie de cette thèse, le suivi des marqueurs dans des cellules du sang de patients allergiques traités ou non par ITA lors d’une étude clinique randomisée, contrôlée, en double aveugle, a permis de définir six nouveaux candidats biomarqueurs d’efficacité de l’immunothérapie, dont trois spécifiques des DC2 et trois autres spécifiques des DCreg. Ces marqueurs pourront être suivis lors des traitements d’ITA pour distinguer les patients répondeurs des non-répondeurs. / Allergy or type I hypersensitivity is an inappropriate response of the immune system to a foreign substance in the body, called "allergen". Allergen immunotherapy (AIT) is currently the only treatment on the market that can handle the etiology of allergic disease versus symptomatic treatments that temporarily reduce allergic manifestations. Its action is to reduce the sensitivity of the body against allergens.The aim of this thesis was to define biomarkers of clinical efficacy of AIT. The research strategy is based on the following hypothesis: dendritic cells (DCs) are involved in the success of immunotherapy. In particular, we assume that the treatment induces a decrease in DCs type 2 (DC2), which induce type 2 helper T cells, and an increase of regulatory DCs (DCreg), which induce regulatory T cells.First, we defined optimal culture conditions inducing the polarization of in vitro immature monocyte-derived DCs (MoDCs) toward a DC2 pattern. After screening several biological and pharmaceutical agents, we selected a cocktail of six molecules with some of them are pro-allergenic molecules. The phenotype of those DC2 cells and the CD4+ T cell polarization induced after coculture were characterized extensively in comparison with type 1 DC (DC1) and DCreg.In a second part, we compared the transcriptomes and the proteomes of MoDCs polarized into DC1, DC2 and DCreg by using cDNA microarrays together with label-free mass spectrometry. The differential expression of the most relevant markers was confirmed at the transcriptional and protein level. In the third part, markers were also followed in the peripheral blood from allergic patients enrolled in a randomized, double-blind, placebo-controlled AIT study. The expression of three DC2 markers was down-regulated and of three DCreg markers was up-regulated in patients who responded to the treatment and correlated with clinical efficacy. These markers could be used as follow-up read-outs of AIT efficacy in order of to discriminate responders from nonresponders.

L'allergie respiratoire au pollen de bouleau affecte un nombre important de personnes dans le monde. Il est estimé que 100 millions d'individus sont sensibilisés à l'allergène majeur du pollen de bouleau nommé Bet v 1. L’immunothérapie allergénique, basée sur l'administration répétée de l'allergène incriminé, permet la rééducation du système immunitaire du patient d’un profil TH2 vers un profil TH1/Treg et à terme la diminution des symptômes allergiques. Ces travaux de thèse avaient donc pour finalité de produire et de caractériser l'allergène recombinant Bet v 1, à des fins d’immunothérapie allergénique. Dans ce cadre, différentes méthodes analytiques ont été développées et appliquées afin d'optimiser le procédé de production via l'élimination de différentes impuretés liées au produit ou au procédé de production et de documenter la structure de l’allergène. En particulier, l'utilisation de la spectrométrie de masse a permis la détermination de la masse exacte de l'allergène ainsi que la vérification complète de sa séquence en acides aminés. Les travaux en spectrométrie de masse ont également contribué aux détections et identifications de diverses impuretés et produits de dégradations et ont ainsi conduit à plusieurs optimisations du procédé industriel de production de l'allergène recombinant. Les activités immunologiques de certains produits de dégradations ont également été investiguées. La structure tertiaire (spatiale) de l'allergène a été déterminée par diffraction aux rayons X. Enfin, ces travaux ont permis de documenter la qualité de l'allergène recombinant rBet v 1 afin i) de l'établir comme substance de référence pour la Pharmacopée Européenne et ii) de procéder à une étude clinique d’immunothérapie allergénique de phase II auprès de 483 patients allergiques au pollen de bouleau. / Respiratory allergy to birch pollen affects a large number of people in the world. It is estimated that 100 million people are sensitized to the major allergen from birch pollen, namely Bet v 1. Allergen immunotherapy, based on the repeated administration of the allergen of interest, allows the modification of the patient's immune response from a TH2 to a TH1/Treg pattern and thus the reduction of allergic symptoms. This study was therefore aimed to produce and characterize the recombinant Bet v 1 (rBet v 1) allergen, for immunotherapy purpose.In this context, various analytical methods have been developed and applied in order to optimize the production of rBet v 1 via the reduction of process or product-related impurities as well as to document the quality of the purified allergen. In particular, the use of mass spectrometry has allowed the determination of the exact mass of the intact allergen and the complete verification of its amino acid sequence. Mass spectrometry data have also contributed to the detection and identification of impurities and degradation products and have therefore led to several optimizations of the industrial process for the production of the recombinant allergen. Immunological activities of certain degradation products were also investigated and the allergen tertiary structure was determined by X-ray diffraction. Finally, this study was decisive in order i) to establish rBet v 1 as a chemical reference substance for the European Pharmacopoeia as well as ii) to perform a phase II clinical study conducted in 483 patients with birch pollen-induced rhinoconjunctivitis.

L’immunothérapie allergénique (ITA) est la seule thérapie capable d’agir sur l’étiologie des allergies. La compréhension des mécanismes d’action de ce traitement et la mise en évidence de biomarqueurs d’efficacité favoriserait l’optimisation de l’ITA. A l’aide des tétramères de classe II, nous avons suivi les lymphocytes T CD4 périphériques spécifiques d’allergènes, acteurs centraux de la réaction allergique, dans des conditions normales, pathologiques ou en cours d’ITA, afin d’établir un lien entre ces trois situations physiologiques. Nous avons mis en évidence des différences entre les réponses lymphocytaires T CD4 spécifiques d’allergènes saisonniers et perannuels, chez les individus sains et allergiques. Puis, lors de 2 études cliniques d’ITA sublinguale, l’une menée chez des adultes allergiques aux pollens de graminées traités pendant 4 mois et l’autre menée chez des enfants allergiques aux acariens traités pendant 1, nous avons respectivement observé une diminution des lymphocytes Th2A et une augmentation de la production d’IFN- γ liées au traitement. Toutefois, ces variations ne corrèlent pas avec l’efficacité clinique de l’ITA observée dans ces deux études. Les limites d’utilisation des tétramères de classe II nous ont amené à rechercher si l’expression de marqueurs d’activation membranaires pouvait remplacer un marquage « tétramère ». Alors qu’une corrélation insuffisante a été observée entre le marquage « tétramère » et l’expression des marqueurs d’activation testés, nous avons mis en évidence 3 populations cellulaires aux propriétés fonctionnelles diverses, soulignant l’hétérogénéité des réponses lymphocytaires spécifiques d’allergènes. De plus, la découverte des lymphocytes Th2A pourrait être une approche prometteuse pour le suivi des réponses lymphocytaires T CD4 spécifiques d’allergènes lors d’ITA à plus long terme. / Allergenic immunotherapy (AIT) is currently the only curative treatment for allergic disease. Whereas efficacy of this treatment is well established, its mechanisms of action are not clearly understood and predictive as well as surrogate biomarkers are needed to further support AIT development. We focused on allergen specific CD4 T cells, highly involved in allergic inflammation, and monitored their responses both in normal and pathologic conditions, or during AIT. Using MHC class II tetramers, we highlighted distinct patterns of polarization between seasonal and perennial allergen-specific CD4 T cells as well as between healthy and allergic individuals. Then, allergen-specific CD4 T cell responses were monitored during 2 double-blind placebo-controlled sublingual AIT clinical trials. After short term AIT (4 months), we observed a decrease of Th2A cells, a newly define subset, thought to contain most allergen-specific CD4+ T cells. IFN-γ production was increased after one year of treatment. However, these variations were not related to AIT clinical efficacy. We further compared the expression of various activation markers and MHC class II tetramer staining following in vitro stimulation in order to circumvent inherent limitation of tetramers. No correlation could be established between tetramer staining and the expression of multiple activation markers in allergen-stimulated CD4 T cells. Combining these methods helps understanding patient heterogeneity regarding CD4 T cell responses. Moreover, Th2A cells detection is likely a promising approach to identify allergen-specific CD4 T cell during long-term AIT.

L'immunothérapie allergénique (ITA) est la seule thérapie capable d'agir sur l'étiologie des allergies. La compréhension des mécanismes d'action de ce traitement et la mise en évidence de biomarqueurs d'efficacité favoriserait l'optimisation de l'ITA. A l'aide des tétramères de classe II, nous avons suivi les lymphocytes T CD4 périphériques spécifiques d'allergènes, acteurs centraux de la réaction allergique, dans des conditions normales, pathologiques ou en cours d'ITA, afin d'établir un lien entre ces trois situations physiologiques. Nous avons mis en évidence des différences entre les réponses lymphocytaires T CD4 spécifiques d'allergènes saisonniers et perannuels, chez les individus sains et allergiques. Puis, lors de 2 études cliniques d'ITA sublinguale, l'une menée chez des adultes allergiques aux pollens de graminées traités pendant 4 mois et l'autre menée chez des enfants allergiques aux acariens traités pendant 1, nous avons respectivement observé une diminution des lymphocytes Th2A et une augmentation de la production d'IFN- γ liées au traitement. Toutefois, ces variations ne corrèlent pas avec l'efficacité clinique de l'ITA observée dans ces deux études. Les limites d'utilisation des tétramères de classe II nous ont amené à rechercher si l'expression de marqueurs d'activation membranaires pouvait remplacer un marquage " tétramère ". Alors qu'une corrélation insuffisante a été observée entre le marquage " tétramère " et l'expression des marqueurs d'activation testés, nous avons mis en évidence 3 populations cellulaires aux propriétés fonctionnelles diverses, soulignant l'hétérogénéité des réponses lymphocytaires spécifiques d'allergènes. De plus, la découverte des lymphocytes Th2A pourrait être une approche prometteuse pour le suivi des réponses lymphocytaires T CD4 spécifiques d'allergènes lors d'ITA à plus long terme.