Le projet de thèse à pour but de produire et caractériser un nouvel allergène de pollen d'ambroisie. Le projet est décliné en cinq axes: production d'une forme recombinante mature et en conformation native, caractérisation structurale, étude de la fonction enzymatique, étude de l'allergenicité et l'immunogénicité et évaluation du potentiel thérapeutique. / The goal of the thesis project is to product and caracterize a novel ragweed pollen allergen.The project have five axes: production of recombinant mature and native form,structurale caracterization, study of enzymatique function, study of allergenicity and immunogenicity and evaluation of therapeutic potential.

L'allergie respiratoire au pollen de bouleau affecte un nombre important de personnes dans le monde. Il est estimé que 100 millions d'individus sont sensibilisés à l'allergène majeur du pollen de bouleau nommé Bet v 1. L’immunothérapie allergénique, basée sur l'administration répétée de l'allergène incriminé, permet la rééducation du système immunitaire du patient d’un profil TH2 vers un profil TH1/Treg et à terme la diminution des symptômes allergiques. Ces travaux de thèse avaient donc pour finalité de produire et de caractériser l'allergène recombinant Bet v 1, à des fins d’immunothérapie allergénique. Dans ce cadre, différentes méthodes analytiques ont été développées et appliquées afin d'optimiser le procédé de production via l'élimination de différentes impuretés liées au produit ou au procédé de production et de documenter la structure de l’allergène. En particulier, l'utilisation de la spectrométrie de masse a permis la détermination de la masse exacte de l'allergène ainsi que la vérification complète de sa séquence en acides aminés. Les travaux en spectrométrie de masse ont également contribué aux détections et identifications de diverses impuretés et produits de dégradations et ont ainsi conduit à plusieurs optimisations du procédé industriel de production de l'allergène recombinant. Les activités immunologiques de certains produits de dégradations ont également été investiguées. La structure tertiaire (spatiale) de l'allergène a été déterminée par diffraction aux rayons X. Enfin, ces travaux ont permis de documenter la qualité de l'allergène recombinant rBet v 1 afin i) de l'établir comme substance de référence pour la Pharmacopée Européenne et ii) de procéder à une étude clinique d’immunothérapie allergénique de phase II auprès de 483 patients allergiques au pollen de bouleau. / Respiratory allergy to birch pollen affects a large number of people in the world. It is estimated that 100 million people are sensitized to the major allergen from birch pollen, namely Bet v 1. Allergen immunotherapy, based on the repeated administration of the allergen of interest, allows the modification of the patient's immune response from a TH2 to a TH1/Treg pattern and thus the reduction of allergic symptoms. This study was therefore aimed to produce and characterize the recombinant Bet v 1 (rBet v 1) allergen, for immunotherapy purpose.In this context, various analytical methods have been developed and applied in order to optimize the production of rBet v 1 via the reduction of process or product-related impurities as well as to document the quality of the purified allergen. In particular, the use of mass spectrometry has allowed the determination of the exact mass of the intact allergen and the complete verification of its amino acid sequence. Mass spectrometry data have also contributed to the detection and identification of impurities and degradation products and have therefore led to several optimizations of the industrial process for the production of the recombinant allergen. Immunological activities of certain degradation products were also investigated and the allergen tertiary structure was determined by X-ray diffraction. Finally, this study was decisive in order i) to establish rBet v 1 as a chemical reference substance for the European Pharmacopoeia as well as ii) to perform a phase II clinical study conducted in 483 patients with birch pollen-induced rhinoconjunctivitis.

À travers le monde, l'asthme ainsi que les maladies allergiques sont considérées comme les pathologies les plus fréquentes et constituent un problème majeur de santé publique. La population vulnérable la plus touchée par l'asthme est celle des enfants, et de plus en plus d'études mettent en cause les spores dans l'exacerbation de la maladie. Depuis quelques décennies, on observe une dégradation de la qualité de l'air en milieu urbain, accentuée par une hausse de la température qui est en partie associée au changement climatique. Ce contexte pourrait favoriser dans le futur la hausse du contenu aéroallergène dans l'air urbain et contribuer à dégrader de façon plus marquée la qualité de l'air. Ces projections inquiétantes sont à la base de cette étude qui vise à évaluer l'effet à court terme des concentrations d'aéroallergènes sur les visites et réadmissions à l'urgence pour asthme chez les enfants montréalais de 0-9 ans, entre 1994 et 2004. Les indicateurs sanitaires proviennent de la Régie d'Assurance Maladie du Québec et les données de concentrations de spores, soient les spores de Basidiomycètes, Deuteromycètes, Cladosporium et Ganoderma, ont été obtenues par l'acquisition de bases de données fournies par le laboratoire de recherche en aérobiologie « Aerobiology Research Laboratory ». Des analyses épidémiologiques écologiques de séries temporelles, basées sur des modèles paramétriques log-linéaires de Poisson, ont été effectuées. Des ajustements ont été nécessaires au niveau des tendances et des cycles temporels, ainsi que pour les variables météorologiques (température, pression) et les polluants chimiques (ozone troposphérique, dioxyde d'azote). De plus, l'effet à court terme des concentrations de spores sur les visites à l'urgence a été vérifié jusqu'à 5 jours après le jour de l'exposition aux aéroallergènes, ceci dans le but de valider le délai de l'impact. Enfin, les analyses statistiques ont été réalisées sur les premières visites ainsi que sur l'ensemble des réadmissions. Les concentrations de spores associées positivement avec les visites à l'urgence pour asthme sont: les Basidiomycètes et les Cladosporium, 4 jours après l'exposition pour les premières visites, respectivement: MPClag4=0.34%; 95% IC: 0.10-0.59%; MPClag4=0.18%; 95% IC: 0.02-0.33%. De faibles associations négatives sont observées concernant les spores de Deutéromycètes et Ganoderma, 2 jours après l'exposition, pour les réadmissions, respectivement: MPClag2=-0.57%; 95% IC : -1.05, -0.09; MPClag2=-0.57; 95% IC : -1.05, 0.09.lLes résultats de l'étude montrent que les spores de Basidiomycètes et de Cladosporium exercent une influence dans l'exacerbation de l'asthme chez les enfants notamment pour les premières visites à l'urgence. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Spores, Asthme pédiatrique, Analyse de séries temporelles, GLM, Changements climatiques, Polluants atmosphériques, Épidémiologie.

L'asthme chez les enfants constitue un problème majeur de santé publique à l'échelle mondiale, et de plus en plus d'études incriminent le pollen allergène dans l'exacerbation de l'asthme. Dans un contexte où les changements climatiques font désormais partie de la réalité, un ensemble de scénarios climatiques propices à la hausse des concentrations polliniques, à l'allongement des saisons de croissance et à l'augmentation de l'allergénicité du pollen est à prévoir. Ces perspectives préoccupantes suscitent l'intérêt de clarifier l'impact du pollen sur la santé respiratoire. À cet effet, l'objectif de cette étude consiste à évaluer, dans le contexte urbain montréalais, l'effet à court terme de l'exposition aux pollens de Graminées et d'Herbacées sur les visites et réadmissions à l'urgence pour asthme chez les enfants de 0 à 9 ans emegistrées entre avril à octobre, de 1994 à 2004. Des analyses de séries temporelles ont été réalisées à partir de modèles paramétriques loglinéaires de Poisson, ajustés pour les tendances et cycles temporels, les conditions météorologiques quotidiennes (température, pression) et les polluants atmosphériques gazeux (ozone et dioxyde d'azote). Nous avons trouvé des associations positives entre les visites à l'urgence pour asthme et les pollens de Graminées, significatives trois jours après l'exposition. L'effet des Graminées est supérieur sur les réadmissions à l'urgence. Par contre, de faibles associations négatives significatives ont été décelées entre les visites à l'urgence deux jours après l'exposition au pollen des Herbacées, dont celui de l'herbe-à-poux. Ces analyses indiquent que les visites à l'urgence pour asthme chez les enfants, particulièrement les réadmissions pour le même diagnostic, sont susceptibles d'augmenter lors de pics de concentrations polliniques de Graminées. Les résultats mitigés concernant les effets des pollens d'Herbacées mènent toutefois à l'évidence que des recherches plus poussées sur de plus longues périodes de temps doivent être faites pour approfondir les connaissances dans ce domaine.

L'allergie de contact est une pathologie en constante augmentation et particulièrement répandue dans les pays industrialisés. Aucune thérapie n'existe actuellement et seule l'éviction totale de l'allergène permet d'éviter toute nouvelle réaction d'allergie. La base de l'allergie de contact est la formation d'une liaison entre l'allergène et les protéines épidermiques. C'est cette étape chimique clé qu' il est important de comprendre afin de développer de nouvelles méthodes dites« alternatives» dans le cadre de l'actuelle législation sur les cosmétiques. Le but de ce travail de thèse a été d'étudier la réactivité de différents allergènes connus face aux acides aminés et protéines d'épidermes reconstruits de type SkinEthic® par la technique RMN HRMAS dérivée de la RMN du solide. Six allergènes ont ainsi été étudiés et leur réactivité a été comparée a celle observée en solution face à une protéine modèle. / Contact dermatitis is one of the most common health problem and highly prevalent in industrialized countries. No therapy currently exists and only the total eviction of the allergen can prevent further allergie reaction.The key molecular event in skin sensitization is the formation of a bond between the allergen and the epidermal proteins. Due to the recent legislation on cosmetic and to help avoid the inappropriate use of new allergens, the understanding of this key step has to be expanded in order to develop new alternative metbods.The aim of this PhD work is to study the reactivity of some allergens towards amino acids and proteins presents in reconstructed human epidermis like SkinEthic® using the HRMAS NMR technique. Six allergens have been studied and their reactivity was compared to that observed ln solution with a model protein.

L’allergie de contact est une pathologie touchant de 15 à 20 % de la population occidentale. A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement, la seule façon efficace de prévention étant l’éviction totale des allergènes. Les tests de sensibilisation de nouvelles molécules avant leur mise sur le marché ont été réalisés sur l’animal jusqu’à l’interdiction dans le 7ème amendement à la directive Européenne concernant l’industrie cosmétique. Dans ce contexte il est primordial de développer des méthodes alternatives. Ce travail de thèse propose d’analyser la problématique de l’allergie de contact en allant de la molécule au tissu pour les allergènes réagissant par voie radicalaire :In chemico : étude de la réactivité des hydroperoxydes allyliques vis-à-vis des acides aminés par la RMNIn situ : études de radicaux issus de ces composés sur des épidermes humains reconstitués par RPEIn cellulo : étude du stress oxydant sur les cellules dendritiques et la voie de signalisation Keap1/Nrf2/ARE. / Allergic contact dermatitis is a pathology affecting 15 to 20% of the Western population. Until now no treatment exists, the prevention is the eviction of allergens. In the past, tests concerning new molecules for the market were tested on animals until the prohibition in the 7th amendment of the European directive concerning the cosmetics industry. In this context it is essential to develop alternative methods to assess the allergenic potential of chemicals.This manuscript proposes to analyze the problem of the allergic contact dermatitis from the molecule to the tissue for allergens reacting through radical mechanisms:In chemico: study of the reactivity profile of allylic hydroperoxides toward amino acids by NMRIn situ: radical intermediates formation on reconstructed human epidermis from allylic hydroperoxides by EPR In cellulo: study of the oxidative stress from allylic hydroperoxides on dendritic cells trough the Keap1/Nrf2/ARE sensor pathway.

L’allergie de contact est une pathologie de la peau particulièrement répandue dans les pays industrialisés. Aucune thérapie ne permet actuellement de la soigner et seule l’éviction de l’allergène permet de la prévenir. Historiquement, l’évaluation du potentiel sensibilisant des molécules mises sur le marché a toujours été réalisée au moyen de tests sur l’animal. Cependant, le champ d’action de ces tests est aujourd’hui limité en raison de la nouvelle législation européenne sur les cosmétiques. Dans ce contexte, le développement de méthodes alternatives ne reposant pas sur l’utilisation d’animaux devient capital. L’allergie de contact repose sur une étape chimique clé : la formation d’un complexe antigénique allergène-protéine capable d’activer le système immunitaire cutané. Le but de ce travail de thèse a été d’étudier le comportement in situ d’allergènes au sein d’épidermes reconstruits de type SkinEthic®. A l’aide d’une technique d’analyse non invasive, la spectroscopie RMN HRMAS, il a été possible de suivre le devenir de différents allergènes, de leur éventuelle activation par voie métabolique, jusqu’à leur fixation sur les protéines épidermiques. / Contact dermatitis is a skin pathology particularly prevalent in industrialized countries. No therapy currently exists and only complete avoidance of the particular allergen can prevent an allergic reaction. Historically, the assessment of skin sensitisation potential of molecules placed on the market was always carried out by animal testing. However, the scope of this testing method is now limited by the new European cosmetics legislation. In this way, the development of alternative methods, not based on animal experimentation, become an important issue. Contact dermatitis results of a chemical key step: the formation of an antigenic complex allergen-protein complexe able to activate the cutaneous immune system. The aim of this PhD work was to study the in situ behaviour of allergens in reconstructed human epidermis (SkinEthic® model). By using an appropriate non-invasive analysis technique, HR-MAS NMR spectroscopy, it has been possible to study the mode of action of different allergens, from their possible activation through the metabolic pathway to the binding with epidermal proteins.