Thesis (Ph.D.)--University of Florida, 2005. / Typescript. Title from title page of source document. Document formatted into pages; contains 103 pages. Includes Vita. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2008. / Barbara D. Boyan, Committee Member ; Ravi Bellamkonda, Committee Member ; Joseph Le Doux, Committee Member ; Andres J. Garcia, Committee Member ; Marc E. Levenston, Committee Chair.

Thesis (M.S.)--University of Alabama at Birmingham, 2007. / Title from first page of PDF file (viewed Oct. 30, 2007). Includes bibliographical references (p. 61-66).

Bibliography: leaves 152-223. Experiments were designed to identify and purify human bone marrow stromal precursor cells by positive immunoselection, based on the cell surface expression of the VCAM-1 and STRO-1 antigens. The data presented demonstrates a hierarchy of bone cell development in vitro.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-26Bitstream added on 2014-08-13T18:01:15Z : No. of bitstreams: 1 000733095_20141006.pdf: 458818 bytes, checksum: 5c6dc7bade9ad320ceb2ea1f2092fd78 (MD5) / As lesões de nervos periféricos representam um grande desafio para a medicina. Inúmeras técnicas visam solucionar a regeneração do nervo periférico. Os protocolos de recuperação funcional destes nervos são diversos e os resultados nem sempre apresentam soluções que promovam a regeneração da via motora e sesitiva. Com o advento da engenharia tecidual, a partir da diferenciação de células-tronco, surgiu uma nova alternativa terapêutica para a regeneração de nervos. O objetivo deste trabalho é estudar a regeneração de nervo mediante tubulização por enxerto de veia autóloga e verificar se o uso da combinação de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) e plasma rico em plaquetas (PRP) na tubulização do nervo fibular comum altera a morfologia e fisiologia deste nervo e de músculos inervados por ele. Os animais foram divididos em seis grupos, sendo três controles e três experimentais. O G1 (n=10) representou o controle inicial. Os grupos G2, G3 e G4 (n=20) representaram os Grupos Experimentais e receberam, após ressecção do segmento nervoso, enxerto de veia jugular externa de 20 mm tubulizando os dois cotos do nervo, sendo que G2 não recebeu preenchimento, G3 foi preenchido com PRP, G4 foi preenchido com PRP e células tronco, G5 (n=10) representou o controle final e o G6 (n=20) representou o controle de desnervação. Foram obtidas células-tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) do mesmo animal, com caracterização fenotípica, utilizando CD90 e CD44 identificando a expressão média de 86,5%. As CTM-TA foram expandidas em cultura e aplicadas na concentração de 5x106 por animal. O índice funcional foi avaliado pela marcha, testes eletrofisiológicos de latência e amplitude e ainda foi realizada a análise morfométrica das fibras nervosas, observando o diâmetro mínimo da fibra, diâmetro mínimo do axônio, área das fibras, área do axônio, área ... / As lesões de nervos periféricos representam um grande desafio para a medicina. Inúmeras técnicas visam solucionar a regeneração do nervo periférico. Os protocolos de recuperação funcional destes nervos são diversos e os resultados nem sempre apresentam soluções que promovam a regeneração da via motora e sesitiva. Com o advento da engenharia tecidual, a partir da diferenciação de células-tronco, surgiu uma nova alternativa terapêutica para a regeneração de nervos. O objetivo deste trabalho é estudar a regeneração de nervo mediante tubulização por enxerto de veia autóloga e verificar se o uso da combinação de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) e plasma rico em plaquetas (PRP) na tubulização do nervo fibular comum altera a morfologia e fisiologia deste nervo e de músculos inervados por ele. Os animais foram divididos em seis grupos, sendo três controles e três experimentais. O G1 (n=10) representou o controle inicial. Os grupos G2, G3 e G4 (n=20) representaram os Grupos Experimentais e receberam, após ressecção do segmento nervoso, enxerto de veia jugular externa de 20 mm tubulizando os dois cotos do nervo, sendo que G2 não recebeu preenchimento, G3 foi preenchido com PRP, G4 foi preenchido com PRP e células tronco, G5 (n=10) representou o controle final e o G6 (n=20) representou o controle de desnervação. Foram obtidas células-tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) do mesmo animal, com caracterização fenotípica, utilizando CD90 e CD44 identificando a expressão média de 86,5%. As CTM-TA foram expandidas em cultura e aplicadas na concentração de 5x106 por animal. O índice funcional foi avaliado pela marcha, testes eletrofisiológicos de latência e amplitude e ainda foi realizada a análise morfométrica das fibras nervosas, observando o diâmetro mínimo da fibra, diâmetro mínimo do axônio, área das fibras, área do ...

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-29Bitstream added on 2015-03-03T12:06:09Z : No. of bitstreams: 1 000810960.pdf: 543169 bytes, checksum: 86b76dd316103fade6c41bb9db902c95 (MD5) / As pesquisas com células-tronco têm avançado expressivamente e ocupam um papel de destaque no contexto do novo ramo terapêutico que se convencionou denominar de medicina regenerativa. A abundância e facilidade de obtenção do tecido muscular têm permitido a ampliação dos estudos acerca de seu potencial como fonte de células-tronco mesenquimais. Neste sentido, diferentes metodologias têm sido propostas para a obtenção de células-tronco mesenquimais oriundas do tecido muscular (CTDM), objetivando cultivo e aplicação clínica em medicina humana e veterinária. Um aspecto importante a ser considerado nos diversos protocolos de isolamento de células-tronco mesenquimais refere-se ao emprego rotineiro da colagenase de origem bacteriana (Clostridium histolyticum). O emprego de reagentes xenobióticos, como a colagenase, rotineiramente empregados, obedecem às recomendações da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA - Brasil), que preconiza a não utilização desses produtos no cultivo de células destinadas à terapia celular em pacientes humanos, uma vez que podem conter agentes infecciosos e contaminantes capazes de desencadear severas reações imunológicas. Neste contexto, objetivou-se, neste estudo, a proposição de novas metodologias a fim de substituir o emprego de xenobióticos no processo de obtenção CTDM. Para tanto, foram comparados os métodos de digestão enzimática (colagenase), dissociação mecânica e explante, em diferentes meios de cultura. O conjunto de resultados mostra que as técnicas de dissociação mecânica e explante são metodologias... / The researches with stem cells have advanced significantly and take a prominent role in the context of the new treatment branch that has been conventionally called of regenerative medicine. The abundance and ease of obtaining muscle tissue have allowed the expansion of studies on its potential as a source of mesenchymal stem cells. In this sense, different methodologies have been proposed for obtaining mesenchymal stem cells derived of muscle tissue (SCDM), aiming cultivation and clinical application in human and veterinary medicine. An important aspect to be considered in the various protocols of isolation of mesenchymal stem cells refers to the routine use of bacterial collagenase (Clostridium histolyticum). The use of xenobiotic reagents, such as collagenase, contrasts with the recommendations of the National Health Surveillance Agency (ANVISA - Brazil), which recommends the avoidance of the use of these products in the cultivation of cells destined for cell therapy in human patients, since which may contain infectious agents and contaminants that are capable of triggering severe immunological reactions. In this context, we aimed in this study to propose new methods to replace the use of xenobiotics in the process of obtaining SCDM. For this end, the methods of enzymatic digestion (collagenase), mechanical dissociation and explant were compared in different culture media. The set of results shows that the techniques of mechanical dissociation and explant are viable methodologies for replacement of collagenase procedures for obtaining SCDM. These new methodological...

Promoting tissue repair in adults represents a major unmet medical need. Tissue regeneration relies on the activation of quiescent endogenous stem cells and whilst considerable progress has been made, novel therapies based on stem cells have thus far failed to translate to routine clinical practice. Much attention has focussed on administrating exogenous stem cells expanded or altered in vitro. However, this approach faces several major limitations, including poor engraftment, high cost and importantly, the necessity for immunosuppression for allogenic cells. An alternative strategy that overcomes these shortcomings is to promote repair by harnessing the regenerative potential of endogenous stem cells. This thesis focussed on the role of alarmins, the upstream group of mediators released immediately following injury, in promoting tissue regeneration. I show that the alarmin HMGB1 accelerates tissue regeneration in various systems by transitioning multiple stem cell types from the quiescent G₀ to the G_Alert state. Firstly, in vitro screening of candidate alarmins with human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells showed that only pre-treatment with HMGB1 improved osteogenic differentiation. Using an optimised murine fracture model, I found that local administration of HMGB1 accelerated bone regeneration via the CXCL12-CXCR4 axis, whilst healing was impaired in inducible Hmgb1^-/- animals. Cell cycle analyses revealed that HMGB1 transitioned the skeletal stem cell from G₀ to G_Alert. In this intermediate phase, the cell is more metabolically active and efficiently enters the cell cycle when exposed to activating factors. This effect also extended to other types of stem cells, including murine haematopoietic and muscle stem cells, as well as human haematopoietic stem and progenitor cells, and MSCs. Using murine models, HMGB1 accelerated recovery from injury to these tissues. Finally, treatment with a single systemic dose of HMGB1 two weeks before injury also accelerated bone, haematopoietic, and muscle regeneration, which was indicative of an acquired pro-regenerative signature. These findings document that the HMGB1-G_Alert pathway results in a dynamic and adaptive multi-tissue regenerative response, and suggest that exogenous HMGB1 may be of therapeutic benefit in diverse clinical contexts, including trauma, chemotherapy, and elective surgery.

Parkinson's disease (PD) is characterised by the loss of dopaminergic neurons in the Substantia Nigra pars compacta in the midbrain and the presence of intracellular aggregates, known as Lewy bodies (LBs), in the surviving neurons. The aetiology of PD is unknown but a causative role for α-Synuclein (SNCA) has been proposed. Although the function of αSyn is not well understood, a number of pathological mechanisms associated with αSyn toxicity have been proposed. In this study, nine induced pluripotent stem cells (iPSCs) lines from healthy individuals and PD patients carrying the A53T SNCA mutation or a triplication of SNCA were differentiated to dopaminergic neurons (iDAn). All iPSC lines differentiated with similar efficiency to iDAn, indicating that they could be used for phenotypic analysis. Quantification of αSyn expression showed increased αSyn intracellular staining and the novel detection of increased αSyn oligomerization in PD iDAn. Analysis of mitochondrial respiration found a decrease in basal respiration, maximal respiration, ATP production and spare capacity in PD iDAn, but not in undifferentiated iPSCs, indicating the cell-type specificity of these defects. Decreased phosphorylation of dynamin-1-like protein at Ser616 (DRP1^Ser616) and increased levels of Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α (PGC-1α) in A53T SNCA iDAn suggest a new pathological mechanism linking αSyn to the imbalance in mitochondria homeostasis. Markers of endoplasmic reticulum (ER) stress were found to be up-regulated, along with increased β- Glucocerebrosidase (GBA) activity, perturbation of autophagy and decreased expression of fatty acids binding protein 7 (FAPB7) in PD iDAn. Lastly, lentiviral vectors for RNAi-mediated knockdown of αSyn were developed and these reduced αSyn protein levels in iDAn, resulting in increased expression of FABP7. These results describe a novel functional link between αSyn and FABP7. This work demonstrates that iDAn are a promising and relevant in vitro cell model for studying cellular dysfunctions in PD pathology, and the phenotypic analysis of A53T SNCA and SNCA triplication iDAn enabled the detection of novel pathological mechanisms associated with PD.

Resumo: A pesquisa em Biologia Celular, depende de técnicas laboratoriais que possam ser usadas para estudar a estrutura e função celular. Importantes avanços na compreensão das células têm sucedido diretamente o desenvolvimento de novas técnicas, que permitiram novos meios de investigação. Uma grande inovação da indústria biotecnológica é a produção de anticorpos monoclonais que são de extrema importância na área médica . Todas as células do organismo apresentam um conjunto de marcadores de superfície que caracterizam a singularidade biológica e a marca das células que os contêm. Contudo, as células-tronco mesenquimais (CTMs) apresentam poucos marcadores imunofenotípicos específicos, sendo sua caracterização estabelecida pela identificação de um perfil de marcadores específicos e não específicos. Essa imunofenotipagem é realizada com a utilização de anticorpos monoclonais que reconhecem esses antígenos de superfície da membrana celular, conforme demonstrado em estudos contemporâneos. O importante avanço da Terapia Celular em diferentes espécies animais tem alavancado à produção de anticorpos monoclonais para a caracterização fenotípica das célulastronco, sejam de origem hematopoiéticas ou de outros tecidos, por exigentes critérios de qualidade. Para o sucesso terapêutico há que se definir o perfil fenotípico das células a serem utilizadas na Terapia Celular, bem como proceder à quantificação das mesmas. Tendo em vista a inexistência no mercado de reagentes para coelhos e o elevado custo de aquisição para a espécie humana, o objetivo desta pesquisa foi desenvolver uma ferramenta diagnóstica explorando seu potencial de uso.Foi realizada a caracterização de dois clones de anticorpos monoclonais dirigidos contra antígenos expressos em células-tronco mesenquimais de coelhos, produzidos previamente no protocolo MSC, através de estudo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Research in Cell Biology, depends on laboratory techniques that can be used to study the structure and cellular function. Important advances in understanding the cells have happened directly the development of new techniques, which enabled new ways of investigation. Breakthrough biotechnology industry is the production of monoclonal antibodies that are of extreme importance in the medical field. All body cells have a set of surface markers that characterize the biological uniqueness and mark cells that contain them. However, the mesenchymal stem cells (MSCs) have few specific immunophenotypic markers, and their characterization established by identifying a profile of specific markers and nonspecific. This immunophenotype is performed with the use of monoclonal antibodies that recognize these surface antigens of the cell membrane, as demonstrated in contemporary studies. The important advance in cell therapy in different species has underpinned the production of monoclonal antibodies for the phenotypic characterization of stem cells, they originate in hematopoietic or other tissues, exacting standards of quality. Therapeutic success is defined as the phenotypic profile of cells to be used in cell therapy, as well as the quantification of them. Given the lack of reagents on the market for rabbits and the high cost to human beings, the goal of this research was to develop a diagnostic tool for exploring its potential use. The characterization of two clones of monoclonal antibodies directed against antigens expressed in mesenchymal stem cells from rabbits, previously produced in the MSC protocol, through study with five samples of bone marrow and fat of animals expanded in culture so watching the speech recognition phenotype of the cells and the level of recognition of clones against 5 different passages of cell culture.The production of monoclonal antibody directed against antigens... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Elenice Deffune / Coorientador: Flávia Cilene Maciel da Cruz Alves / Banca: Luciano Lobo Gatti / Banca: João Tadeu Ribeiro Paes / Mestre

Resumo: Injúrias traqueais são problemas na prática cirúrgica, pois apresentam dificuldades no tratamento. Atualmente, a engenharia tecidual (ET) é a única técnica para substituição traqueal que fornece promessa real. O uso de suportes naturais apresenta vantagens biológicas, mas faz-se necessário a descelularização desses materiais.Assim, o objetivo do presente trabalho é a descelularização de traquéias, com posterior aplicação das células epiteliais respiratórias (CERs) na face interna das traquéias descelularizadas; bem como, a diferenciação das células-tronco mesenquimais (CTMs) em condrócitos. O presente estudo foi efetuado com modelo em coelhos da raça Botucatu, pesando entre 3,0 e 4,0kg, provenientes do Biotério Central da Unesp. A utilização desses animais foi aprovada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal. Foram realizados 54 diferentes protocolos de descelularização, que envolvem métodos físicos (congelamento, agitação, pressão mecânica-PM, irradiação eletromagnética não ionizante-LED 475nm e LED 630nm), associados com métodos químicos (Triton X-100, SDS e DS) e enzimáticos (DNase e RNase). Paralelamente, também foi realizado cultura celular das CTMs, com posterior diferenciação em condrócitos. A expansão ex vivo das CERs foi realizada por diferentes protocolos: fragmentos traqueais, lavado traqueal, raspado traqueal, punch dermatológico de 2mm e digestão por tripsina. As células obtidas foram aplicadas na face interna das traquéias descelularizadas. Com relação a PM, não se observa contribuição nos protocolos de descelularização. A irradiação com LED 475nm provoca remoção das células condrogênicas; já a irradiação com LED 630nm provoca aumento da proliferação celular. Sob o critério custo-benefício, a utilização dos processos enzimáticos não foi validada. Em relação aos detergentes, ocorre... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Tracheal injuries are a problem in surgical practice once they present difficulties in their treatment. Nowadays, tissue engineering (TE) is the only technique for tracheal replacement that provides real promise. There are biological benefits in using natural scaffolds, but the decellularization of such materials is necessary. Thus, the objective of this study is tracheal decellularization with subsequent application of respiratory epithelial cells (RECs) on the inner side of the decellularized cells, as well as the differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into chondrocytes. This study was carried out with model in Botucatu rabbits weighing between 3.0 to 4.0kg from the Animal Colony at Unesp. The use of such animals was approved by the Ethics Committee of Animal Experiments. Fifty-four different decellularization protocols were used; they involved physical methods (freezing, agitation, mechanical pressure - MP, non-ionizing electromagnetic irradiation - LED 475nm and LED 630nm), associated with chemical methods (Triton X-100, SDS and DS) and enzymatic ones (DNase and RNase). At the same time, a cell culture of the MSCs was done as well, with subsequent differentiation into chondrocytes. The ex vivo expansion of RECs was performed with different protocols: tracheal fragments, tracheal wash, scraped trachea, 2mm dermatological punch, and trypsin digestion. The cells obtained were applied to the inner side of the decellularized tracheae. Regarding MP, no contribution to the decellularization protocols is observed. Irradiation with LED 475nm causes the removal of chondrogenic cells whereas the irradiation with LED 630nm increases cell proliferation. Under the cost-benefit criterion, the use of enzymatic processes was not validated. As for the detergents, there is more destruction of the extracellular matrix of the tracheae treated with SDS when compared to those treated with... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Elenice Deffune / Coorientador: Raul Lopes Ruiz Júnior / Banca: João Tadeu Ribeiro Paes / Banca: Paulo Francisco Guerreiro Cardoso / Mestre