Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-26Bitstream added on 2014-06-13T18:53:46Z : No. of bitstreams: 1 olimpio_rmc_me_botfm.pdf: 826274 bytes, checksum: 61f1d8617e1e4d21f266017bd7d20258 (MD5) / Introdução: As Células Tronco Mesenquimais (CTMs) são capazes de diferenciar em várias linhagens de células. As CTMs, quando em cultura, e na presença de citocinas ativadoras de osso, sofrem osteoindução e diferenciam em osteoblastos. Entretanto, pouco se conhece sobre a função e a proliferação dos progenitores osteoblásticos, que pode ser essencial para a integridade do tecido ósseo. Objetivo: Implantar a técnica para diferenciação osteoblástica a partir de células tronco mesenquimais humanas derivadas do tecido adiposo. Metodologia: O tecido adiposo foi obtido de três pacientes do sexo feminino submetidas à abdominoplastia. As CTMs foram mantidas em meio D-MEM completo contendo 10% de SFB, mantidas a 37° C em uma atmosfera umidificada com 95% O2/5% CO2. Após a confluência alíquotas de células foram separadas para o processo de caracterização celular. Após esse período, foi realizada osteoindução utilizando meio DMEN completo com acréscimo de dexametasona, ácido ascórbico e βglicerofosfato. As células foram mantidas nesse meio por até 16 dias. Como controle negativo da indução, culturas de células foram mantidas em meio convencional pelo mesmo período de tempo. Ao término de 16 dias as células foram separadas para a caracterização celular e o RNA foi coletado para análise da expressão de RANKL. Resultados: As células após seis dias de cultura apresentaram aderidas com 40% de confluência e após dezessete dias com 75% de confluência. As CTMs expressaram anticorpo CD 44 e 90. Foi encontrado médio nível (20%- 40%) de dano de DNA em 40% das CTMs analisadas. A imunofluorescência confirmou a homogeneidade e positividade para expressão de anti-vimentina. A diferenciação química foi conseguida pela adição de dexametasona, ácido ascórbio e βglicerofosfato ao meio DMEN completo. Houve a expressão de... / Mesenchymal Stem Cells (MSCs) are able to differentiate into multiple cell lineages. The MSCs, when cultured, in the presence of activating cytokines bone suffer osteoinduction and differentiate into osteoblasts. However, little is known about the function and proliferation of osteoblastic progenitors, which can be essential for the integrity of bone tissue. Objective: Deploy the technique for osteoblast differentiation from human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue. Methods: Adipose tissue was obtained from three female patients undergoing abdominoplasty. MSCs were maintained in complete D-MEM containing 10% FBS, maintained at 37 ° C in a humidified atmosphere with 95% O2 / 5% CO2. After confluence aliquots of cells were separated into the cellular characterization process. After this period, was performed using osteoinduction medium DMEN complete with addition of dexamethasone, ascorbic acid and βglicerofosfato. Cells were maintained in this medium for up to 16 days. As a negative control induction, cell cultures were maintained in standard medium for the same period of time. At the end of 16 days the cells were separated for the characterization and cellular RNA was collected for analysis of expression of RANKL. Results: The cells after six days of culture had adhered with 40% confluency and after seventeen days with 75% confluency. The MSCs expressed antibody CD 44 and 90. Found average level (20% - 40%) of DNA damage in 40% of MSCs analyzed. Immunofluorescence confirmed the homogeneity and positivity for anti-vimentin expression. The chemical differentiation was achieved by addition of dexamethasone, ascórbio acid and βglicerofosfato DMEN in half full. There expression of alkaline phosphatase, osteocalcin, RANKL and mineralized matrix formation from osteoblasts after 16 days with osteogenic... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-04Bitstream added on 2014-06-13T19:45:11Z : No. of bitstreams: 1 pavao_gd_dr_botfmvz.pdf: 1151593 bytes, checksum: 3a898d8249ca2c2ca7389cd5d9ee4adc (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência da terapia celular no tratamento do endométrio de éguas com processo degenerativo crônico caracterizado pela presença de fibrose uterina. Foram utilizadas 10 éguas, de raça Quarto de Milha com idade entre 14 e 23 anos, com massa corpórea entre 400 a 600 Kg, e bom escore corporal com históricos reprodutivos de subfertilidade e grau severo de fibrose uterina detectada previamente pelo exame histológico realizado por meio da biópsia endometrial. O material foi coletada no dia zero (D0) antes do tratamento com células tronco mesenquimais (CTMs) e 15 dias (D15), 30 dias (D30) e 60 dias (D60) após o tratamento. As amostras foram classificadas segundo o modelo proposto por Kenney & Doig (1986) em grau de fibrose: Grau I - normal, Grau IIA – inflamação crônica leve, Grau IIB – inflamação crônica com infiltrado moderado, Grau III – inflamação crônica degenerativa grave. Estas amostras foram submetidas à confecção de lâminas para coloração de Tricrômio de Masson, Coloração de Hematoxilina e Eosina (HE) e Imunohistoquímica. A punção da medula óssea foi realizada em 10 éguas com idade entre 14 e 23 anos e o material coletado foi submetido ao Laboratório. O cultivo celular in vitro foi realizado em meio DMEM alta glicose em estufa com 37,5°C, em atmosfera úmida contendo 95% de ar e 5% de CO2. Após atingir a confluência de 80% na placa de cultivo, estas células foram removidas e injetadas intra-endometrial com uma concentração de 2x107 células\mL em um volume de 0,5 ml em 20 (vinte) diferentes pontos (sitio de administração) espaçados entre um centímetro, com o auxílio de endoscópio flexível, totalizando um volume de 10 mL aplicado. Nas avaliações realizadas, verificou-se diminuição significativa dos ninhos glandulares, mudança siginificativa de células... / The study aimed to evaluate the efficiency of cell therapy in the treatment of endometrial mares with chronic degenerative process characterized by the presence of uterine fibroids. We used 10 mares bred Quarter Horses aged between 14 and 23 years, with body mass between 400 and 600 kg, with good body and reproductive history of subfertility and severe degree of uterine fibrosis detected previously by histological examination performed by endometrial biopsy. The material was collected on day zero (D0) before treatment with mesenchymal stem cells (MSCs) and 15 days (D15), 30 days (D30) and day 60 (D60) post-treatment. The samples were classified according to the model proposed by Kenney & Doig (1986) in fibrosis: Grade I - normal, Grade IIA - mild chronic inflammation, IIB Grade - moderate chronic inflammatory infiltrate, Grade III - severe degenerative chronic inflammation. These samples were submitted for preparation of slides for staining Masson's trichrome, hematoxylin and eosin staining (HE) and immunohistochemistry. A bone marrow puncture was performed in 10 mares aged between 14 and 23 years and the collected material was submitted to the Laboratory. The in vitro cell cultivation was performed in DMEM with high glucose kiln 37.5 ° C in humidified atmosphere containing 95% air and 5% CO2. After reaching 80% confluence on plate culture, these cells were removed and injected intra-endometrial at a concentration of 2x107 cells \ ml in a volume of 0.5 ml for 20 (twenty) different point (site of administration) spaced of an inch, with the aid of flexible endoscope, for a total volume of 10 ml applied. In the assessments, there was a significant reduction in glandular nests, change polymorphonuclear cell siginificativa absent at baseline (D0) to moderate 60 days (D60); amendment of mononuclear cells in going from... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-15Bitstream added on 2015-04-09T12:47:39Z : No. of bitstreams: 1 000815064_20150715.pdf: 50300 bytes, checksum: 8f441f19a66d1fbc8d9e0f038cc01e8b (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-03T12:20:59Z: 000815064_20150715.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-03T12:22:19Z : No. of bitstreams: 1 000815064.pdf: 538304 bytes, checksum: 5ea43b7b562fe3e195c422aa12124413 (MD5) / O omento, tecido gorduroso rico em células tronco mesenquimais, expressa fatores de crescimento, que atuam na regeneração tecidual, tornando-o atrativo para utilização em medicina regenerativa. Não há relatos, todavia, quanto à investigação sobre células do omento na cirurgia regenerativa em oftalmologia. Avaliaram-se os efeitos clínicos e à microscópia do omento com membrana amniótica na reparação da córnea de coelhos submetidos a ceratectomia. Duas modalidades foram avaliadas. Na primeira, o omento foi coberto com membrana amniótica imediatamente à sua implantação na córnea (grupo OM); na segunda, a membrana amniótica foi colonizada por células progenitoras extraídas do omento e transplantadas para a córnea (grupo OMC). Os efeitos clínicos foram avaliados a partir de dados coletados por até 60 dias de pós-operatório. A incidência e a prevalência de quemose foram maiores no grupo OM (p<0,05). O grupo OMC mostrou mais incidência de blefarospasmo (p<0,001). À microscopia de luz, encontrou-se reparação corneal gradativa em ambos os grupos, com reepitelização ao 100 de pós-operatótio. Aos 60 dias da avaliação, todas as córneas estavam reparadas, entretanto, no grupo OMC constatou-se vascularização. Proliferação celular acentuada foi observada com o ki-67, nos estágios finais do processo de reparação de córneas que receberam MA contendo células do omento (grupo OMC). Somente no grupo OMC, a reparação corneal sem tranparência foi alcançada / The omentum, a fatty tissue rich in mesenchymal stem cells, expresses growth factors that act in tissue regeneration, making it attractive for use in regenerative medicine. To our knowledge, reports that investigate the use of omentum cells in ophthalmology have yet to be published. The purpose of this study was to assess the clinical and microscopic effects of omentum associated with amniotic membrane on the repair of rabbit cornea submitted to keratectomy. Two methods were evaluated; in the first, the omentum was covered with amniotic membrane immediately following its implantation on the cornea (OM group), while in the second, the amniotic membrane was colonized by omental progenitor cells and transplanted to the cornea (OMC group). Clinical parameters were evaluated from data collected up to 60 days postoperatively. The incidence and prevalence of chemosis were higher in the OM group (p<0.05). The OMC group showed greater incidence of blepharospasm (p<0.001). Under light microscopy, the absence of epithelium in the lesioned area and stromal disorganization were observed in the early postoperative period. After 60 days of evaluation, all the corneas were repaired. Intense cell proliferation was detected with Ki-67, in the final stages of the repair process, where amniotic membrane containing omental progenitor cells was transplanted to the corneas. The use of omentum and its cells, in association with amniotic membrane, favored the repair of the cornea and did not induce complications

Diabetes and congenital hyperinsulinism (CHI) are severe diseases affecting the pancreas. Current models for testing drugs to treat these diseases are in vivo in rodents or isolated rodent islets. Differences between the human and rodent pancreas, and ethical issues, mean that in vitro human models are needed. To develop a novel in vitro model for pancreatic diseases, mesenchymal stem cells (MSCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) were derived from the pancreas of patients with CHI. MSCs from three forms of CHI were phenotypically normal for MSCs, and maintained the CHI-causing mutation. When compared to MSCs from bone marrow, the CHI pancreatic MSCs expressed pancreas-specific gene ISL1 and showed promoter hypomethylation of other pancreatic genes, including PDX1. The CHI pMSCs could be differentiated to cells resembling immature beta-cells, with some beta-cell gene expression (INS, PDX1), but no glucose responsive insulin secretion. CHI associated hypersecretion of insulin was not seen as the ATP-sensitive potassium KATP channels were not being expressed. Addition of the Wnt inhibitor DKK1 markedly enhanced differentiation via induction of neuronal genes. Alongside high insulin secretion, CHI also features increased proliferation. CHI MSCs were also hyperproliferative, and showed alterations to the cell cycle. These changes were related to p27Kip1 localisation, a known affected protein in CHI tissue, and CDK1, a novel regulator for CHI. iPSCs were also derived from focal CHI MSCs and were also phenotypically normal, but did not maintain the pancreatic hypomethylation present in MSCs. The CHI iPSCs were efficiently differentiated to definitive endoderm and PDX1 positive cells. Terminally differentiated iPSCs were endocrine, but were not mature beta-cells. In conclusion, authentic MSCs and iPSCs were derived for the first time from patients with CHI. These stem cells could be differentiated towards beta-cells, but mature glucose responsive beta-cells were not produced. MSC derived beta-like cells secreted insulin but did not have KATP channels, whereas iPSC derived beta-like cells had KATP channel gene expression but not INS. With further optimisation to resolve these, CHI stem cell derived beta-cells may be used for in vitro modelling. Further, the undifferentiated MSCs only show hyperproliferation associated with p27Kip1 and CDK1 and so can be a useful resource for modelling hyperproliferation seen in CHI.

Les Chondrichtyens sont des espèces d’intérêt de par leur position phylogénétique à la base des Vertébrés. Au cours de cette thèse réalisée sur un petit requin, la petite roussette, l’étude des protéines Nanos, essentielles pour le maintien de la lignée germinale chez les Ostéichtyens, a mis en évidence la présence de deux protéines Nanos1 (1A et 1B) chez les Chondrichtyens, résultant d’une duplication du gène en amont des Gnathostomes. Chaque paralogue a révélé des profils d’expression spécifiques suggérant une spécification génique. De plus, la niche des spermatogonies souches (SSCs) a été mieux caractérisée et de nouveaux marqueurs de pluripotence tels que SSEA4 et Sox2 ont été détectés dans les SSCs potentielles chez cette espèce. Une culture primaire enrichie en spermatogonies de la zone germinative a montré une hétérogénéité d’expression des facteurs de SSC analysés (GFRα1, SSEA4, POU2, Nanos1A, Nanos1B, c-Kit), suggérant une hétérogénéité des cellules souches et/ou des progéniteurs. Afin de valider le caractère souche de ces cellules en culture, un test fonctionnel de transplantation a été initié. Le développement de cette technologie, pour la première fois chez un Chondrichtyen, ouvre de nouvelles perspectives en termes de préservation de ces espèces. Enfin, la recherche de facteurs à potentiel thérapeutique au niveau testiculaire chez la petite roussette a permis l’identification d’un peptide capable de réguler la glycémie et l’insulinémie de souris présentant un diabète de type 2, mais son mode d’action reste à explorer. L’ensemble des résultats confirme l’intérêt de la petite roussette pour l’étude évolutive de la niche germinale, essentielle au maintien de la gamétogenèse, et la recherche de molécules à potentiel thérapeutique. / Chondrichthyes are species of interest because of their phylogenetic position at the base of the Vertebrates. In this thesis, based on a small shark, the small spotted dogfish, the study of Nanos proteins, essential for the maintenance of the germ line in Osteichthyes, showed the presence of two Nanos1 proteins (1A and 1B) in Chondrichthyes, resulting from a gene duplication upstream of the Gnathostomata. Each paralog revealed specific expression profiles suggesting a gene specification. In addition, the spermatogonial stem cells (SSCs) niche was better characterized and new pluripotency markers such as SSEA4 and Sox2 were detected in potential SSCs in this species. A primary culture of the germinative zone enriched in spermatogonia showed a heterogeneity of expression of the analysed SSC factors (GFRα1, SSEA4, POU2, Nanos1A, Nanos1B, c-Kit), suggesting heterogeneity of stem cells and / or progenitors. In order to validate the stemness potential of these cells in culture, a functional transplantation test was initiated. The development of this technology, for the first time in a Chondrichthyes, opens new perspectives in terms of preservation of these species. Finally, the search of potential therapeutic factors in the dogfish testis led to the identification of a peptide able to regulate blood glucose and insulin levels in mice presenting type 2 diabetes, but its mode of action remains to be explored. All the results confirm the interest of the small spotted dogfish for the evolutionary study of the germinal niche, essential to the maintenance of gametogenesis, and the search for molecules with therapeutic potential.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-28Bitstream added on 2014-06-13T18:50:10Z : No. of bitstreams: 1 evaristo_tc_me_botfm.pdf: 1944919 bytes, checksum: f9a5a93860c79f6554bb319a05d333fe (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Injúrias traqueais são problemas na prática cirúrgica, pois apresentam dificuldades no tratamento. Atualmente, a engenharia tecidual (ET) é a única técnica para substituição traqueal que fornece promessa real. O uso de suportes naturais apresenta vantagens biológicas, mas faz-se necessário a descelularização desses materiais.Assim, o objetivo do presente trabalho é a descelularização de traquéias, com posterior aplicação das células epiteliais respiratórias (CERs) na face interna das traquéias descelularizadas; bem como, a diferenciação das células-tronco mesenquimais (CTMs) em condrócitos. O presente estudo foi efetuado com modelo em coelhos da raça Botucatu, pesando entre 3,0 e 4,0kg, provenientes do Biotério Central da Unesp. A utilização desses animais foi aprovada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal. Foram realizados 54 diferentes protocolos de descelularização, que envolvem métodos físicos (congelamento, agitação, pressão mecânica-PM, irradiação eletromagnética não ionizante-LED 475nm e LED 630nm), associados com métodos químicos (Triton X-100, SDS e DS) e enzimáticos (DNase e RNase). Paralelamente, também foi realizado cultura celular das CTMs, com posterior diferenciação em condrócitos. A expansão ex vivo das CERs foi realizada por diferentes protocolos: fragmentos traqueais, lavado traqueal, raspado traqueal, punch dermatológico de 2mm e digestão por tripsina. As células obtidas foram aplicadas na face interna das traquéias descelularizadas. Com relação a PM, não se observa contribuição nos protocolos de descelularização. A irradiação com LED 475nm provoca remoção das células condrogênicas; já a irradiação com LED 630nm provoca aumento da proliferação celular. Sob o critério custo-benefício, a utilização dos processos enzimáticos não foi validada. Em relação aos detergentes, ocorre... / Tracheal injuries are a problem in surgical practice once they present difficulties in their treatment. Nowadays, tissue engineering (TE) is the only technique for tracheal replacement that provides real promise. There are biological benefits in using natural scaffolds, but the decellularization of such materials is necessary. Thus, the objective of this study is tracheal decellularization with subsequent application of respiratory epithelial cells (RECs) on the inner side of the decellularized cells, as well as the differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into chondrocytes. This study was carried out with model in Botucatu rabbits weighing between 3.0 to 4.0kg from the Animal Colony at Unesp. The use of such animals was approved by the Ethics Committee of Animal Experiments. Fifty-four different decellularization protocols were used; they involved physical methods (freezing, agitation, mechanical pressure - MP, non-ionizing electromagnetic irradiation - LED 475nm and LED 630nm), associated with chemical methods (Triton X-100, SDS and DS) and enzymatic ones (DNase and RNase). At the same time, a cell culture of the MSCs was done as well, with subsequent differentiation into chondrocytes. The ex vivo expansion of RECs was performed with different protocols: tracheal fragments, tracheal wash, scraped trachea, 2mm dermatological punch, and trypsin digestion. The cells obtained were applied to the inner side of the decellularized tracheae. Regarding MP, no contribution to the decellularization protocols is observed. Irradiation with LED 475nm causes the removal of chondrogenic cells whereas the irradiation with LED 630nm increases cell proliferation. Under the cost-benefit criterion, the use of enzymatic processes was not validated. As for the detergents, there is more destruction of the extracellular matrix of the tracheae treated with SDS when compared to those treated with... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-17Bitstream added on 2014-06-13T18:21:09Z : No. of bitstreams: 1 inacio_jc_me_botfm.pdf: 9052728 bytes, checksum: 924e48540d09685b61abdb2d6903fb6d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A pesquisa em Biologia Celular, depende de técnicas laboratoriais que possam ser usadas para estudar a estrutura e função celular. Importantes avanços na compreensão das células têm sucedido diretamente o desenvolvimento de novas técnicas, que permitiram novos meios de investigação. Uma grande inovação da indústria biotecnológica é a produção de anticorpos monoclonais que são de extrema importância na área médica . Todas as células do organismo apresentam um conjunto de marcadores de superfície que caracterizam a singularidade biológica e a marca das células que os contêm. Contudo, as células-tronco mesenquimais (CTMs) apresentam poucos marcadores imunofenotípicos específicos, sendo sua caracterização estabelecida pela identificação de um perfil de marcadores específicos e não específicos. Essa imunofenotipagem é realizada com a utilização de anticorpos monoclonais que reconhecem esses antígenos de superfície da membrana celular, conforme demonstrado em estudos contemporâneos. O importante avanço da Terapia Celular em diferentes espécies animais tem alavancado à produção de anticorpos monoclonais para a caracterização fenotípica das célulastronco, sejam de origem hematopoiéticas ou de outros tecidos, por exigentes critérios de qualidade. Para o sucesso terapêutico há que se definir o perfil fenotípico das células a serem utilizadas na Terapia Celular, bem como proceder à quantificação das mesmas. Tendo em vista a inexistência no mercado de reagentes para coelhos e o elevado custo de aquisição para a espécie humana, o objetivo desta pesquisa foi desenvolver uma ferramenta diagnóstica explorando seu potencial de uso.Foi realizada a caracterização de dois clones de anticorpos monoclonais dirigidos contra antígenos expressos em células-tronco mesenquimais de coelhos, produzidos previamente no protocolo MSC, através de estudo... / Research in Cell Biology, depends on laboratory techniques that can be used to study the structure and cellular function. Important advances in understanding the cells have happened directly the development of new techniques, which enabled new ways of investigation. Breakthrough biotechnology industry is the production of monoclonal antibodies that are of extreme importance in the medical field. All body cells have a set of surface markers that characterize the biological uniqueness and mark cells that contain them. However, the mesenchymal stem cells (MSCs) have few specific immunophenotypic markers, and their characterization established by identifying a profile of specific markers and nonspecific. This immunophenotype is performed with the use of monoclonal antibodies that recognize these surface antigens of the cell membrane, as demonstrated in contemporary studies. The important advance in cell therapy in different species has underpinned the production of monoclonal antibodies for the phenotypic characterization of stem cells, they originate in hematopoietic or other tissues, exacting standards of quality. Therapeutic success is defined as the phenotypic profile of cells to be used in cell therapy, as well as the quantification of them. Given the lack of reagents on the market for rabbits and the high cost to human beings, the goal of this research was to develop a diagnostic tool for exploring its potential use. The characterization of two clones of monoclonal antibodies directed against antigens expressed in mesenchymal stem cells from rabbits, previously produced in the MSC protocol, through study with five samples of bone marrow and fat of animals expanded in culture so watching the speech recognition phenotype of the cells and the level of recognition of clones against 5 different passages of cell culture.The production of monoclonal antibody directed against antigens... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Célia Regina Nogueira / Coorientador: Patricia Pinto Saraiva / Banca: Sandro José Conde / Banca: Durvanei Augusto Maria / Resumo: Introdução: As Células Tronco Mesenquimais (CTMs) são capazes de diferenciar em várias linhagens de células. As CTMs, quando em cultura, e na presença de citocinas ativadoras de osso, sofrem osteoindução e diferenciam em osteoblastos. Entretanto, pouco se conhece sobre a função e a proliferação dos progenitores osteoblásticos, que pode ser essencial para a integridade do tecido ósseo. Objetivo: Implantar a técnica para diferenciação osteoblástica a partir de células tronco mesenquimais humanas derivadas do tecido adiposo. Metodologia: O tecido adiposo foi obtido de três pacientes do sexo feminino submetidas à abdominoplastia. As CTMs foram mantidas em meio D-MEM completo contendo 10% de SFB, mantidas a 37° C em uma atmosfera umidificada com 95% O2/5% CO2. Após a confluência alíquotas de células foram separadas para o processo de caracterização celular. Após esse período, foi realizada osteoindução utilizando meio DMEN completo com acréscimo de dexametasona, ácido ascórbico e βglicerofosfato. As células foram mantidas nesse meio por até 16 dias. Como controle negativo da indução, culturas de células foram mantidas em meio convencional pelo mesmo período de tempo. Ao término de 16 dias as células foram separadas para a caracterização celular e o RNA foi coletado para análise da expressão de RANKL. Resultados: As células após seis dias de cultura apresentaram aderidas com 40% de confluência e após dezessete dias com 75% de confluência. As CTMs expressaram anticorpo CD 44 e 90. Foi encontrado médio nível (20%- 40%) de dano de DNA em 40% das CTMs analisadas. A imunofluorescência confirmou a homogeneidade e positividade para expressão de anti-vimentina. A diferenciação química foi conseguida pela adição de dexametasona, ácido ascórbio e βglicerofosfato ao meio DMEN completo. Houve a expressão de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mesenchymal Stem Cells (MSCs) are able to differentiate into multiple cell lineages. The MSCs, when cultured, in the presence of activating cytokines bone suffer osteoinduction and differentiate into osteoblasts. However, little is known about the function and proliferation of osteoblastic progenitors, which can be essential for the integrity of bone tissue. Objective: Deploy the technique for osteoblast differentiation from human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue. Methods: Adipose tissue was obtained from three female patients undergoing abdominoplasty. MSCs were maintained in complete D-MEM containing 10% FBS, maintained at 37 ° C in a humidified atmosphere with 95% O2 / 5% CO2. After confluence aliquots of cells were separated into the cellular characterization process. After this period, was performed using osteoinduction medium DMEN complete with addition of dexamethasone, ascorbic acid and βglicerofosfato. Cells were maintained in this medium for up to 16 days. As a negative control induction, cell cultures were maintained in standard medium for the same period of time. At the end of 16 days the cells were separated for the characterization and cellular RNA was collected for analysis of expression of RANKL. Results: The cells after six days of culture had adhered with 40% confluency and after seventeen days with 75% confluency. The MSCs expressed antibody CD 44 and 90. Found average level (20% - 40%) of DNA damage in 40% of MSCs analyzed. Immunofluorescence confirmed the homogeneity and positivity for anti-vimentin expression. The chemical differentiation was achieved by addition of dexamethasone, ascórbio acid and βglicerofosfato DMEN in half full. There expression of alkaline phosphatase, osteocalcin, RANKL and mineralized matrix formation from osteoblasts after 16 days with osteogenic... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: João Tadeu Ribeiro Paes / Banca: Edislaine Barreiros de Souza / Banca: Márcia Zilioli Bellini / Resumo: As pesquisas com células-tronco têm avançado expressivamente e ocupam um papel de destaque no contexto do novo ramo terapêutico que se convencionou denominar de medicina regenerativa. A abundância e facilidade de obtenção do tecido muscular têm permitido a ampliação dos estudos acerca de seu potencial como fonte de células-tronco mesenquimais. Neste sentido, diferentes metodologias têm sido propostas para a obtenção de células-tronco mesenquimais oriundas do tecido muscular (CTDM), objetivando cultivo e aplicação clínica em medicina humana e veterinária. Um aspecto importante a ser considerado nos diversos protocolos de isolamento de células-tronco mesenquimais refere-se ao emprego rotineiro da colagenase de origem bacteriana (Clostridium histolyticum). O emprego de reagentes xenobióticos, como a colagenase, rotineiramente empregados, obedecem às recomendações da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA - Brasil), que preconiza a não utilização desses produtos no cultivo de células destinadas à terapia celular em pacientes humanos, uma vez que podem conter agentes infecciosos e contaminantes capazes de desencadear severas reações imunológicas. Neste contexto, objetivou-se, neste estudo, a proposição de novas metodologias a fim de substituir o emprego de xenobióticos no processo de obtenção CTDM. Para tanto, foram comparados os métodos de digestão enzimática (colagenase), dissociação mecânica e explante, em diferentes meios de cultura. O conjunto de resultados mostra que as técnicas de dissociação mecânica e explante são metodologias... / Abstract: The researches with stem cells have advanced significantly and take a prominent role in the context of the new treatment branch that has been conventionally called of regenerative medicine. The abundance and ease of obtaining muscle tissue have allowed the expansion of studies on its potential as a source of mesenchymal stem cells. In this sense, different methodologies have been proposed for obtaining mesenchymal stem cells derived of muscle tissue (SCDM), aiming cultivation and clinical application in human and veterinary medicine. An important aspect to be considered in the various protocols of isolation of mesenchymal stem cells refers to the routine use of bacterial collagenase (Clostridium histolyticum). The use of xenobiotic reagents, such as collagenase, contrasts with the recommendations of the National Health Surveillance Agency (ANVISA - Brazil), which recommends the avoidance of the use of these products in the cultivation of cells destined for cell therapy in human patients, since which may contain infectious agents and contaminants that are capable of triggering severe immunological reactions. In this context, we aimed in this study to propose new methods to replace the use of xenobiotics in the process of obtaining SCDM. For this end, the methods of enzymatic digestion (collagenase), mechanical dissociation and explant were compared in different culture media. The set of results shows that the techniques of mechanical dissociation and explant are viable methodologies for replacement of collagenase procedures for obtaining SCDM. These new methodological... / Mestre

Orientador: Fausto Viterbo / Banca: Antonio de Castro Rodrigues / Banca: Jesus Carlos Andreo / Banca: Valéria Paula Sassoli Fazan / Banca: Jayme Adriano Farina Junior / Resumo: As lesões de nervos periféricos representam um grande desafio para a medicina. Inúmeras técnicas visam solucionar a regeneração do nervo periférico. Os protocolos de recuperação funcional destes nervos são diversos e os resultados nem sempre apresentam soluções que promovam a regeneração da via motora e sesitiva. Com o advento da engenharia tecidual, a partir da diferenciação de células-tronco, surgiu uma nova alternativa terapêutica para a regeneração de nervos. O objetivo deste trabalho é estudar a regeneração de nervo mediante tubulização por enxerto de veia autóloga e verificar se o uso da combinação de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) e plasma rico em plaquetas (PRP) na tubulização do nervo fibular comum altera a morfologia e fisiologia deste nervo e de músculos inervados por ele. Os animais foram divididos em seis grupos, sendo três controles e três experimentais. O G1 (n=10) representou o controle inicial. Os grupos G2, G3 e G4 (n=20) representaram os Grupos Experimentais e receberam, após ressecção do segmento nervoso, enxerto de veia jugular externa de 20 mm tubulizando os dois cotos do nervo, sendo que G2 não recebeu preenchimento, G3 foi preenchido com PRP, G4 foi preenchido com PRP e células tronco, G5 (n=10) representou o controle final e o G6 (n=20) representou o controle de desnervação. Foram obtidas células-tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) do mesmo animal, com caracterização fenotípica, utilizando CD90 e CD44 identificando a expressão média de 86,5%. As CTM-TA foram expandidas em cultura e aplicadas na concentração de 5x106 por animal. O índice funcional foi avaliado pela marcha, testes eletrofisiológicos de latência e amplitude e ainda foi realizada a análise morfométrica das fibras nervosas, observando o diâmetro mínimo da fibra, diâmetro mínimo do axônio, área das fibras, área do axônio, área ... / Abstract: Peripheral nerves injuries represent an enormous clinical challenge in medicine. Numerous techniques aim for regeneration of peripheral nerves. Nowadays, there are different protocols concerning to its functional retrieval and the results of current researches do not always show solutions to promote a regeneration of motor and sensory via. With the advent of tissue engineering, from the stem cells differentiation, arise a new therapeutic alternative in nerve regeneration. The aim of this study was to analyze the nerve regeneration by tubulization technique using autologous graft, as well as to verify whether the combination of mesenchymal stem cells from fat tissue (CTM-TA) and platelet-rich plasma (PRP) in tubulization of Commom Peroneal Nerve modify the morphology and physiology of this nerve nor muscles that it innervates. Animals were divided into six groups, consisting in three control and three experimental groups. G1 group (n=10) represented the Inicial Control Group. G2, G3 and G4 group (n=20) corresponded to the experimental groups and also receive, after resection of the nerve, an external jugular vein graft of 20 mm, thereby performing a tubulization of the two nerve stumps, where G2 was not filled; G3 was filled with PRP; G4 was filled with PRP and stem cells; G5 (n = 10) represented the Final Control Group and G6 (n = 20) symbolized the Control Denervation Group. It was obtained mesenchymal stem cells from fat tissue (MSC-FT) from the same animal, with phenotypic characterization using CD90 and CD44, thus identifying the average expression of 86.5%. MSC-FT were expanded in culture and applied at a concentration of 5x106 per animal. The functional index was evaluated by walking tracks analysis, electrophysiological latency test and amplitude, besides the morphometric analysis of nerve fibers (observing the minimum diameter of the fiber), the minimum diameter of the axon, fiber area, axon area, myelin area and myelin sheath ... / Doutor