Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Patología Animal. / Se realizó un desafío experimental con el objeto de dilucidar si existe variación en la susceptibilidad/resistencia frente a piscirickettsiosis entre familias de la especie salmón del Atlántico (Salmo salar). Para este fin, se emplearon 4.955 salmones del Atlántico, de edad aproximada 10 meses, en estadio de “pre-smolt” pertenecientes a 29 familias, cada una compuesta por propios hermanos. El número de peces inoculados por familia varió desde un mínimo de 80 hasta un máximo de 87 ejemplares. Los animales fueron infectados con Piscirickettsia salmonis mediante inyección intraperitoneal (0,2 x 103,8 DICT50/pez). A su vez, otros 86 individuos de cada familia fueron utilizados como control, siendo inyectados por la misma vía y en volumen equivalente, con solución “buffer” fosfato salino (PBS) pH 7,2 estéril. Los peces inoculados se mantuvieron cohabitando con los controles en dos estanques de 2,5 m3 de modo de tener una réplica experimental. El ensayo tuvo una duración de 52 días post-inoculación. Durante este período, se efectuaron registros diarios de mortalidad. Mediante el método estadístico de Kaplan-Meier, se obtuvieron los valores de supervivencia de cada familia y posteriormente estos datos fueron comparados usando la prueba de Log-rank. Hubo mortalidades atribuibles a la enfermedad en todas las familias inoculadas con la bacteria y los porcentajes finales de mortalidad acumulada, ordenados por familia, variaron entre 10,5% y 70%. Las probabilidades de supervivencia fueron significativamente diferentes entre las distintas familias (p ≤ 0,05). Los resultados muestran que hay variaciones en la susceptibilidad/resistencia a piscirickettsiosis entre familias de salmón del Atlántico y que estos rasgos dependen, al menos en parte, de las características genotípicas de estos peces / In this work, susceptibility to piscirickettsiosis among some Atlantic salmon (Salmo salar) families was compared by challenging them with Piscirickettsia salmonis. Juvenile fish belonging to 29 different full sibling families were used. Per family, a minimum of 80 and a maximum of 87 fish were infected by intraperitoneal injection with a P. salmonis suspension (0.2 x 103.8 TCID50/fish) and 86 individuals were sham-inoculated with sterile PBS. Fish were held in two identical tanks supplied with fresh water. They were pit-tagged and allotted in such a way that every family had half of its inoculated (n~43) and half of its sham- inoculated fish (n=43) cohabiting in each tank. Trial lasted 52 days after the inoculation time. Final cumulative mortalities ranged from 10.5 to 70%. Kaplan-Meier analysis and Log-rank comparison tests showed that survival likeliness was different among all the families (p≤ 0.05). Same comparison between specific pairs of families exhibited survival differences in a high number of them too. Results show that there are significant variations in the degree of susceptibility/resistance to P. salmonis among families of Atlantic salmon and strongly suggest that this outcome is in its turn associated with differences in fish genotypes / Financiamiento: Proyectos Innova N° 05CT6PPT-10 y Fondecyt N° 1080692.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Hasta la fecha, se han realizado múltiples estudios sobre la transmisión vertical de Piscirickettsia salmonis. Al respecto, se ha demostrado que la bacteria puede infectar ovas durante el proceso de fertilización y que es capaz de adherirse a la superficie coriónica mediante unas estructuras denominadas complejo de adhesión piscirickettsial o CAP. Estos estudios sólo han sido realizados en ovas de la especie trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) utilizando la cepa de referencia LF-89. En la presente memoria, se buscó comparar la infección de dos cepas de esta bacteria (LF-89 y SLGO-95) sobre ovas de salmón del Atlántico (Salmo salar) y trucha arco iris. Los experimentos consistieron en el desafío de ovas de las dos especies salmonídeas, con dos suspensiones bacterianas de P. salmonis (cepas LF-89 y SLGO-95) durante distintos tiempos (1, 3, 5, 10, 30 y 60 min) para obtener una cinética de infección. Las muestras de estas ovas fueron sometidas a una técnica “dot-blot” para la detección de P. salmonis, y los resultados fueron analizados densitométricamente mediante un “software” computacional. Además, mediante una técnica de microscopía electrónica de barrido (MEB) se observó la superficie coriónica de ovas de salmón de Atlántico y trucha arco iris con el fin de detectar si la bacteria se unía mediante el CAP. Mediante la técnica de “dot-blot” se estableció que las ovas de salmón del Atlántico son sensibles a la infección con cualquiera de las dos cepas de P. salmonis usadas (SLGO-95 y LF-89), mientras que las ovas de trucha arco iris sólo presentaron positividad a la infección con la cepa SLGO-95. En el caso de la especie salmón del Atlántico se detectó positividad al “dot-blot” en muestras provenientes de ovas desafiadas durante dos tiempos (10 y 60 min) con la cepa SLGO-95 y tres tiempos (5, 10 y 60 min) con la cepa LF-89. Para ovas de trucha arco iris desafiadas con la cepa SLGO-95 se detectó positividad a la infección en cuatro tiempos de desafío (1, 3, 10 y 60 min) bacteria-ova. Mediante el uso de MEB se observó la presencia de CAP sobre la superficie de ovas de salmón del Atlántico y trucha arco iris desafiadas 5 min a ambas cepas de P. salmonis. Los resultados de “dot-blot” y MEB permiten concluir que ambas cepas se unen e infectan a las ovas de salmón del Atlántico, lo cual es el primer indicio de una posible infección vertical en dicha especie. Por otra parte, el método “dot-blot” no permitió comparar la cinética de infección entre ovas y cepas de bacterias, por lo que sólo se pudo utilizar como una técnica cualitativa para la detección de P. salmonis.

Memoria para optar al título de Bioquímico / La industria acuícola de salmónidos, como la del salmón del Atlántico o de la trucha arcoíris, constituye una de las principales actividades económicas de Chile. Sin embargo, en su puesta en marcha enfrenta desafíos técnicos y ambientales, incluyendo la aparición de enfermedades que se transmiten rápidamente dentro de las poblaciones de cultivo. La segunda causa de pérdidas por patología infecciosa es la Necrosis Pancreática Infecciosa, causada por el virus IPNv. Se ha descrito que la citoquina IFN-I induce una potente actividad antiviral contra IPNv. Para este trabajo de investigación, se propuso clonar IFN-I de la especie Salmo salar en Bacillus megaterium, una bacteria inocua capaz de producir grandes cantidades de proteína y que ha sido utilizada exitosamente en la industria biotecnológica. Para lo anterior, se diseñó un método de clonación clásico y se logró exitosamente la transformación de Escherichia coli con el vector de B. megaterium pSSBm110 con el gen de IFN-I como inserto (pSSBm110:IFN-I). Se probaron luego dos métodos de transformación para B. megaterium, uno de electroporación que no dio resultados cuantificables y otro de creación de protoplastos libres de pared capaces de absorber ADN exógeno. Sin embargo, a pesar de lograr la transformación y la clonación exitosa del vector pSSBm110:IFN-I en B. megaterium, no se logró la detección de la expresión de IFN-I recombinante, por lo cual serán necesarios nuevos intentos para lograr su uso como sistema de expresión para esta citoquina / The salmonid aquaculture industry, such as the Atlantic salmon or the rainbow trout aquaculture, is one of the Chile’s main economic activities. However, this industry faces technical and environmental challenges, including the emergence of diseases which spread quickly through the fish populations. The infectious pancreatic necrosis, which is caused by the IPNv virus, is the second cause of fish losses related to an infectious disease. It has been described that the cytokine IFN-I induces a powerful antiviral response against IPNv. In this research, we proposed the cloning of IFN-I from Salmo salar in the harmless bacterium Bacillus megaterium, a species of high-yielding protein production, successfully used in the biotechnology industry. For this, a classic cloning method was used, obtaining transformed Escherichia coli cells with the B. megaterium pSSBm110 vector, and the IFN-I insert (pSSBm110:IFN-I). Then, two B. megaterium transformation methods were tested. The first one, an electroporation method, which did not offer quantifiable results. The second one, a method based on protoplast cells generation where foreign DNA was absorbed. Even though the transformation and cloning in B. megaterium were both successful, and verified through sequencing, the expression of the recombinant peptide was not detectable. Thus, new attempts will be necessary to use this expression system for this cytokine / FIA PYT-2012-0056

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo / El afrecho de soya (Glycine max) es una alternativa de reemplazo parcial a la proteína animal producto de la disminución y altos costos de la harina de pescado utilizada como principal materia prima en la elaboración de dietas para salmónidos. En este sentido, el afrecho de soya reúne importantes características nutricionales tales como un elevado contenido de proteínas (48%) y un perfil de aminoácidos adecuado, sin embargo y debido a la presencia de factores anti nutricionales (FAN) sus niveles de inclusión se limitan a 25%, estos componentes están asociados a efectos de disminución de parámetros productivos y de digestibilidad de nutrientes. Dentro de los FAN de mayor concentración se encuentran los carbohidratos indigestibles termo estables, con niveles de 35-45% de la materia seca, dentro de los cuales un 20% corresponden a α-galactósidos (rafinosa y estaquiosa) y polisacáridos no derivados del almidón (celulosa, hemicelulosa y pectinas). En el presente estudio se utilizó un proceso de fermentación en estado sólido utilizando bacterias Streptomyces sp, Cohenella termotolerans y Cellulomicrobium sp., disminuyendo la concentración de α-galactósidos y NSP del afrecho de soya. Con la finalidad de evaluar el efecto de la inclusión de 30% de ingrediente vegetal en dietas para salmón del Atlántico, se realizó un estudio de crecimiento y de digestibilidad de nutrientes.

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo / El afrecho de soya (AS) ha sido utilizado como sustituto de la harina de pescado (HP) debido a su bajo precio, disponibilidad y propiedades nutricionales, pero su nivel de inclusión ha estado limitado debido a la presencia de factores anti-nutricionales. Varias alternativas han sido planteadas para reducir los niveles de estos compuestos (Polisacáridos no derivados del almidón (NSP), alfa-Galactosidos (GOS), saponinas, lectinas, etc.) una de ellas es el pre-tratamiento de la soya mediante Fermentación en Estado Sólido (SSF), sin embargo hay poca información disponible sobre los efectos del afrecho de soya fermentada (ASF) en alimentos para salmónidos, aun mas hay pocos estudios que hagan referencia al efecto que causan las fuentes proteicas vegetales en el intestino proximal.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias / Los piojos de mar (Caligus rogercresseyi) son los ectoparásitos que causan las mayores pérdidas productivas en la industria de la acuicultura, especialmente en Chile. El salmón del Atlántico (Salmo salar) y la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) son las especies de salmónidos más susceptibles a su infestación, una situación que ha promovido la búsqueda de estrategias para resolver el problema. Este estudio tiene como objetivo determinar genes candidatos en el salmón del Atlántico y la trucha arcoíris que pueden participar en el mecanismo de resistencia contra el piojo de mar, y determinar la ortología entre los genes obtenidos en ambas especies. Para esto, 2.626 individuos de salmón del Atlántico y 2.643 de trucha arcoíris de poblaciones comerciales fueron desafiados con piojos de mar y se les realizó un genotipado con un panel de SNP 50k. Se obtuvieron heredabilidades moderadas a bajas con valores de 0,19 para S. salar y 0,08 para O. mykiss para el logaritmo de la densidad del caligus (como medida de resistencia del huésped). Mediante un estudio de asociación genómica identificamos una serie de genes presentes las regiones genómicas asociadas al carácter en ambas especies, tales como Serine/ threonine kinase y Tripartite motif-containing protein 16-like. El análisis de ortología nos permitió identificar dust8 y dust10 como genes que participan en la respuesta inmune activando los leucocitos, favoreciendo la migración, como también al receptor de ácido lisofosfatidico junto a un receptor acoplado a proteína G los cuales pertenecen a regiones sinténicas asociadas al carácter en ambas especies. Este es un primer enfoque para comprender los genes involucrados en la resistencia contra el piojo de mar utilizando genómica comparativa en salmónidos. Sin embargo, se necesitan investigaciones adicionales en ambas especies para validar los genes identificados como candidatos / Sea lice (Caligus rogercresseyi) are the ectoparasites that cause the greatest productive losses in the aquaculture industry, especially in Chile. Atlantic salmon (Salmo salar) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) are the salmonid species most susceptible to their infestation, a situation that has promoted the search for strategies to solve the problem. This study aims to determine candidate genes in Atlantic salmon and rainbow trout that can participate in the mechanism of resistance against sea lice, and determine the orthology between the genes obtained in both species. For this, 2,626 individuals of Atlantic salmon and 2,643 of rainbow trout from commercial populations were challenged with sea lice and genotyped with a SNP 50k panel. Moderate to low heritabilities were obtained with values of 0.19 for S. salar and 0.08 for O. mykiss for the logarithm of sea lice density (as a measure of host resistance). By means of a study of genomic association we identified a series of genes present the genomic regions associated with the character in both species, such as Serine / threonine kinase and Tripartite motif-containing protein 16-like. The orthology analysis allowed us to identify dust8 and dust10 as genes that participate in the immune response activating the leukocytes, favoring migration, as well as the lysophosphatidic acid receptor together with a G protein-coupled receptor which belong to syntenic regions associated with the character in both species. This is a first approach to understand the genes involved in resistance against sea lice using comparative genomics in salmonids. However, additional research is needed in both species to validate the genes identified as candidates / Research Council UK- CONICYT, Research Partnership Call. (MR/N026144/1)