Orientador: Raphael Lucio Andreatti Filho / Banca: Edir Nepomuceno da Silva / Banca: Paulo Lourenço da Silva / Resumo: O presente trabalho teve por objetivos detectar genes (abp 118 alpha e Sal B) codificadores de bacteriocinas das cepas de Lactobacillus salivarius e avaliar a capacidade protetora de prebiótico e Lactobacillus spp. como probiótico em carcaças e órgãos de frangos de corte desafiados com Salmonella enterica sorovar Enteritidis (SE), observando-se também alterações na morfologia da mucosa intestinal. Os produtos da reação em cadeia da polimerase (PCR) de 25 cepas de Lactobacillus salivarius isoladas do inglúvio e cecos de matrizes pesadas de linhagem comercial não apresentaram bandas em gel de agarose correspondente à amplificação do segmento genômico codificador dos produtos de bacteriocinas. Para capacidade de proteção, 150 pintos de corte foram divididos em cinco grupos de 30 aves para os diferentes tratamentos (T1 = controle negativo, T2 = controle positivo, T3 = pool de Lactobacillus, T4 = pool de Lactobacillus + prebiótico e T5 = prebiótico). Nos períodos de 1, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias de vida, as aves dos grupos 3 e 4 foram tratadas via oral com pool de Lactobacillus spp. Os tratamentos com prebióticos (T4 e T5) foram realizados via ração desde o primeiro dia de vida até 42 dias. Dezoito horas antes do abate as aves foram desafiadas com SE (T2, T3, T4 e T5). Os cultivos microbiológicos das carcaças e fígados apresentaram crescimento bacteriano de SE para todos os tratamentos T2, T3, T4 e T5, exceto o T1, o qual também não apresentou contagem bacteriana para os inglúvios e cecos. Os tratamentos T2, T3, T4 e T5, apresentaram contagem de SE nos inglúvios, embora o T5 tenha apresentado significativamente (P<0,05) maior quantidade bacteriana quando comparado com os demais tratamentos. Nos cecos, os tratamentos T2 e T5, apresentaram significativamente (P<0,05) maior quantidade bacteriana. quando comparado com os T1, T3 e T4. Não foi observado efeito significativo (P>0,05) sobre profundidade de criptas das... / Abstract: The present work aimed to detect genes (abp 118 alpha and Sal B) encoding bacteriocins of strains of Lactobacillus salivarius and to evaluate the protective capacity of prebiotic and Lactobacillus spp. as probiotic in carcasses and organs of broiler chickens challenged with Salmonella enterica serovar Enteritidis (SE), observing also the morphology of the alterations intestinal mucosa. The products of the reaction in chain of the polymerase (PCR) of 25 strains of Lactobacillus salivarius isolated from the crop and ceca of heavy matrices of commercial lineage did not present bands in agarose gel corresponding to amplification of the encoding genomic segment of bacteriocin producers. For protection capacity, 150 broiler chicks were divided into five groups of 30 birds for the different treatments (T1 = negative control, T2 = positive control, T3 = pool of Lactobacillus, T4 = pool of Lactobacillus + prebiotic and T5 = prebiotic). At the ages of 1, 7, 14, 21, 28, 35 and 42 days, the birds of groups 3 and 4 were treated orally with pool of Lactobacillus spp. The treatments with prebiotics (T4 and T5) were accomplished via ration from the first day of life up to 42 days. Eighteen hours before slaughter the birds were challenged with SE (T2, T3, T4 and T5). The microbiological cultures of carcasses and livers presented bacterial growth of SE for all treatments T2, T3, T4 and T5, except T1, which also did not present a bacterial count for crops or ceca. The treatments T2, T3, T4 and T5, presented SE count in crops, although T5 had shown a significantly (P<0.05) higher bacterial quantity compared to the other treatments. In ceca, the treatments T2 and T5, presented significantly (P<0.05) more bacteria than T1, T3 and T4. No significant effect was observed (P>0.05) on depth of crypts of birds that received treatments T4 and T5, forme of wich displayed lower crypt depth ratio, differing significantly (P<0.05) compared to T1 and T2. / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-17Bitstream added on 2014-06-13T19:39:28Z : No. of bitstreams: 1 soares_vm_me_botfmvz.pdf: 335980 bytes, checksum: 7710ea8d0868af2d34c7f2b28ddc1cb9 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O objetivo do presente estudo foi avaliar o processo de disseminação de Salmonella Enteritidis via diferentes superfícies de corte (madeira, plástico com triclosan, vidro e aço inoxidável), a partir de pele de frango contaminada (5 log UFC/g), para alimentos prontos para o consumo, bem como o efeito de diferentes protocolos de higienização destas superfícies no controle da contaminação. Os seguintes protocolos foram simulados: protocolo 1, nenhuma limpeza foi realizada depois do manuseio da pele contaminada; protocolo 2, as superfícies foram rinsadas em água corrente, protocolo 3 as superfícies foram limpas com detergente e esfregação mecânica; protocolo 4, o protocolo 3 foi aplicado e as superfícies submetidas a sanitização com hipoclorito. A recuperação do patógeno foi possível em todas as superfícies no protocolo 1, com contagens variando de 1,90 a 2,80 log, bem como nos tomates nelas manuseados. Observou-se uma redução no número de células de S. Enteritidis nos protocolos subseqüentes, tanto nas superfícies como nos tomates, chegando a níveis não detectáveis no protocolo 4. As taxas de transferência da pele para superfícies e tomates variaram de 0,09 a 10,1%. Das superfícies avaliadas, a madeira foi a mais difícil de higienizar e o aço inoxidável a mais fácil. O protocolo 4 foi o que proporcionou a maior de redução de contaminação cruzada e proteção à saúde do consumidor / The aim of this research was to evaluate the spreading process of Salmonella Enteritidis on different cutting boards (wood, triclosan incorporated plastic, glass and stainless steel), from contaminated poultry skin (5 log CFU/g) to food ready to eat, as well the effect of different cleaning protocols on these surfaces to contamination control. The following scenarios were simulated: scenario 1, no cleaning was performed after handling the contaminated skin; scenario 2, the surfaces were rinsed in water, scenario 3 the surfaces were cleaned with detergent and mechanical scrubbing; scenario 4, protocol 3 was applied and the surfaces submitted to sanitization with sodium hypochlorite. The recovery of the pathogen was possible in all surfaces in scenario 1, with scores ranging from 1.90 to 2.80 log, as well in the tomatoes handled on them. There was a reduction in the number of S. Enteritidis cells in subsequent scenarios, on the surfaces and in tomatoes, reaching undetectable levels in scenario 4. The transfer rates of skin surfaces and tomatoes ranged from 0.09 to 10.1%. About the surfaces assessed, the wood was the most difficult to sanitize and stainless steel easier. Scenario 4 was the one that provided the largest reduction of cross-contamination and protect consumer health

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A Salmonella sp. é uma das principais causas de doenças transmitidas por alimentos, principalmente de origem animal. Os suínos podem ser portadores assintomáticos de Salmonella sp. e, nessa condição, serem levados ao abate. Desta forma, a entrada de Salmonella sp. na cadeia de produção é uma preocupação para a indústria. Sabendo-se da importância deste microrganismo, pelo seu impacto na indústria e na saúde pública, este trabalho teve como objetivo determinar a prevalêncía de Salmonella sp. em suínos levados ao abate em um frigorífico sob inspeção federal no Rio Grande do Sul, e correlacionar com a contaminação de cortes de pernil. Para tanto, 64 amostras de conteúdo intestinal e 121 amostras de cortes de pernil coletadas em 4 visitas, foram submetidas ao isolamento e identificação de Salmonella sp. As amostras de Salmonella sp. foram avaliadas quanto a resistência a 14 antimicrobianos, através da técnica de difusão em ágar. Salmonella sp. foi isolada de 46,87% das amostras de conteúdo intestinal e de 49,59% dos cortes de pernil. Foi encontrado grande número de sorovares, sendo os mais prevalentes Panama e Bredeney. Das amostras isoladas, 60,8% apresentaram perfil de multiresistência, sendo os maiores índices de resistência a sulfonamida, ácido nalidíxico e tetraciclina. Utilizando o perfil de resistência a antimicrobianos de amostras de um mesmo sorovar forma comparadas quanto a sua similaridade e agrupadas em dendrogramas, observou-se grande diversidade nas linhagens isoladas. Os resultados demonstraram que a entrada de animais no frigorífico excretando Salmonella sp., pode contribuir para a contaminação do produto final. A diversidade de sorovares e linhagens pode representar que são várias as fontes de contaminação, tanto dos animais quanto do produto final. / Salmonella sp. is one of the main causes of food bome disease, being the products of animal origin the most often implicated in outbreaks. Pigs are often asymptomatic carriers of Salmonella sp., and the slaughter of positive animais has been a great concern for the swine industry. Thus, the introduction of Salmonella sp. in the food chain is of importance for the swine industry and for the food safety as well. The aim of this study was to evaluate the prevalence of Salmonella sp. in pigs at slaughter and to correlate with the contamination of pork processed in one slaughterhouse in Rio Grande do Sul. For this purpose, 64 samples of intestinal content and 121 samples of pork cuts, collected in 4 visits, were submitted to Salmonella isolation and identification protocol. Furthermore, the resistance profile of the isolated Salmonella strains were evaluated against 14 antimicrobials, using the agar diffusion test. Salmonella sp. was isolated from 46,87% of intestinal content samples and 49,59% of pork cuts. The isolated Salmonella strains belonged to nine different sorovars, being the sorovar Panama and Bredeney most prevalent. Most strains (60,8%) showed a multiresistance profile. Furthermore, resistance profiles against sulfonamides, nalidixic acid and tetracyclin were the most found. Using the resistance profile, strains belonging to the same sorovar were compared and dendrograms were constructed. In spite of belonging to the same sorovar and being isolated in the same visit to the slaughter plant, Salmonella strains showed a great diversity. These results demonstrated that the slaughter of pigs shedding Salmonella sp. in the feces, can result in the contamination of the final product in this slaughter plant. The diversity of sorovars and strains of Salmonella sp. indicated the multiple sources of contamination for animais and for the product.

Orientador: Edir Nepomuceno da Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-22T23:04:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_JairVicentede_D.pdf: 4139067 bytes, checksum: 3827fa3c2dfeb20f2093e4f0f981e9bc (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Considerando os contaminantes da casca do ovo e o emprego deste em alta escala na indústria de alimentos, o ovo passa a ser uma matéria prima que oferece riscos a saúde do consumidor, e riscos econômicos ao produtor e ao setor industrial. Com o objetivo de aumentar a eficiência na limpeza e sanificação dos ovos, utilizamos, isoladamente, hipoclorito de sódio nas concentrações de 5,8, 50 e 100 mg/L de cloro ativo, um composto de amônio quatemário (cloreto de alquil dimetil benzil amônio) concentrado a 50% nas diluições 1/500 e 1/1000 e um composto de amônio quatemário comercial contendo 20% do ingrediente ativo em suspensão alcalina, em concentrações de acordo com as recomendações do fabricante. Também foi utilizado um ácido acético nas concentrações de 2,0% e 3,0%. Todos os sanificantes foram aplicados por 15 e 30 segundos, na temperatura de 25°C e 40°C, e comparados com o emprego da água sem sanificantes. Realizou se a contagem global de bactérias mesófilas e psicrotróficas aeróbias, bolores, leveduras, coliformes totais e fecais antes da aplicação dos sanificantes (para acompanhamento dos contaminantes oriundos da granja) e após a sanificação compreendendo o período de estocagem de sete e quatorze dias ( para avaliação da sanificação). Em outro experimento usamos uma cepa de Salmonella enteritidis ácido nalidixico resistente a 100µg/ml, aplicando-se o mesmo procedimento com a finalidade de melhor avaliar os sanificantes. Na prática da aplicação em laboratório, encontramos que a microbiota da casca do ovo foi reduzida de 2 a 3 ciclos logarítmicos quando usado os compostos de amônio quatemário (CAQ). O CAQ na concentração de 50% e diluído 1/500, 1/1000 quando empregado sobre a casca do ovo contaminado previamente com uma população de 104 UFC/ml de S. enteritidis acido nalidixico resistente, propiciou uma redução total da bactéria, o mesmo ocorrendo para o hipoclorito na concentração de 100 mg/L. Para os demais produtos não houve redução da Salmonella enteritidis. Este procedimento demonstrou que a sanificação ajuda na conservação dos ovos e aumenta a sua vida de prateleira. Por isso é importante a monitoração da água empregada na lavagem da casca dos ovos, ressaltando dessa forma a importância do uso de sanificantes na prática rotineira das granjas. Uma contribuição para a legislação brasileira quanto a lavagem e emprego de sanificantes na higienização da casca dos ovos comerciais pode ser alcançada com a elaboração de um roteiro prático e especificando as condições de uso dos sanificantes / Abstract: Considering the high level of contamination on the egg shell and its high level of use on an industrial scale, eggs have become an important health risk to the consumer and a source of economic loss to the producer and the industrial sector. The objective of this work was to increase the efficiency of cleaning and sanitation using chlorinated compounds (sodium hypochlorite) in concentrations of 5.8, 50 and 100 mg/L active chlorine, a 50% quatemary ammonium compound (alkyldimethylbenzyl ammonium chloride) in dilutions of 1/500 and 1/1000, a commercial quatemary ammonium compound containing 20% of the active ingredient in alkaline solution at concentrations recommended by the manufactures and an organic acid (acetic acid) in concentrations of 2% and 3%. All the sanitizing agents were tested using 2 variables: time (15 and 30 seconds) and temperature (25°C and 40°C), and were compared with the use of water with no sanitizing agent. In this experiment total counts of mesophilic and psycrophilic aerobic bacteria, molds, yeasts, coliforms and fecal colifoms, were carried out both before applications (to follow contamination from the hatchery laying house) and after 7 and 14 days of storage in order to evaluate the sanitation process. In another experiment the same treatment was applied to a nalidixic acid resistant (100 µg/m1) strain of Salmonella enteritidis in order to better analyse the sanitizing agents. In the laboratory a decrease in egg shell microbial flora of 2-3 logarithmic cycles was observed when quatemary ammonium compounds (QAC) were used. The use of 500/0 QAC diluted by factors of 1/500 and 1/1000 completely eliminated a 104 CFU/ml population of nalidixic acid resistent Salmonella enteritides, this also ocurring with the use of 100 mg/L sodium hipochlorite but not with the other sanitizing agents. This method showed the influence of sanitation in the shelf life of eggs and the importance of analysing the waters used to wash the eggs, emphasizing the routine use of sanitizing agents in laying houses. A contribution to the brazilian legislation related to the washing and use of sanitizing agents in the cleaning of commercial eggs could be made by producing a routine for this process and the necessary concentration of the sanitizing agents / Doutorado / Doutor em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:27:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cordeiro_TamiresFernandaVilasBoas_M.pdf: 3029203 bytes, checksum: 69ac5762ed6eaafac425a284455352cf (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Salmonella enterica é um dos patógenos de origem alimentar mais prevalente. É uma bactéria gram-negativa, pertencente à família Enterobacteriaceae, intracelular facultativa, não formadora de esporo, anaeróbia facultativa, capaz de infectar animais incluindo o homem. Geralmente é adquirida por meio de alimentos contaminados com tal micro-organismo e pode causar em humanos gastroenterite e bacteremia. O presente trabalho propõe a construção de linhagens mutantes de S. enterica Typhimurium para genes codificadores de proteínas associadas ao nucleóide (NAPs ¿ Nucleoid-Associated Proteins). Tais proteínas auxiliam no enovelamento do DNA, permitindo que o cromossomo bacteriano seja compactado, além disso também influenciam na regulação transcricional de genes, em especial daqueles que respondem a mudanças ambientais. As NAPs são numerosas e o estudo desse grupo é bastante importante, pois vários esclarecimentos ainda precisam ser feitos a respeito de grande parte dessas proteínas. Dados recentes do nosso grupo de pesquisa têm demonstrado que mutantes nulos de S. enterica Typhimurium para genes codificadores de NAPs são atenuados quanto à virulência e capazes de induzir proteção no modelo murino de infecção. Esses resultados demonstram o importante papel de tais proteínas na virulência bacteriana. Assim, o presente estudo tem como objetivo a construção de mutantes nulos para dois genes codificadores de NAPs (stpA e ybaB) em S. enterica Typhimurium e a avaliação do fenótipo desses mutantes. Não há dados na literatura sobre o papel de tais NAPs com relação à virulência bacteriana. No caso de YbaB, não existem dados na literatura sobre o papel desta NAP em enterobactérias. Foi utilizado o sistema de recombinação ? Red para obtenção dos mutantes. Para observação do fenótipo de tais linhagens, foram feitos experimentos in vitro e in vivo. Os resultados observados nos experimentos in vitro mostram fenótipos interessantes das linhagens mutantes em comparação com as respectivas linhagens selvagens. No caso da mutação ?stpA, foi observada maior sobrevivência de células com essa deleção a certas situações de estresse em comparação com a linhagem selvagem. Já para a mutação ?ybaB, nossos ensaios de motilidade sugerem que a deleção desse gene teve efeito sobre a motilidade das células mutantes. Quanto à virulência dos mutantes construídos, tais mutações não afetaram a patogenicidade de S. enterica de modo considerável. Assim, as linhagens mutantes obtidas no presente trabalho não apresentam potencial de serem aplicadas como vacinas, mas lançam perspectivas para estudos futuros a respeito do papel biológico de YbaB em S. enterica / Abstract: Salmonella enterica is one of the most prevalent foodborne pathogens. It is a gram- negative bacterium, belonging to the Enterobacteriaceae family, intracellular facultative, non-spore forming, anaerobic facultative, capable of infecting animals, including man. It¿s usually acquired through foods contaminated with such microorganism and can cause gastroenteritis and bacteremia in humans. This study proposes the construction of mutant strains of S. enterica Typhimurium for genes encoding nucleoid-associated proteins (NAPs). These proteins help on folding of DNA, allowing the bacterial chromosome to be compressed, also influencing the transcriptional regulation of genes, especially those that respond to environmental changes. The NAPs are numerous and the study of this group is very important, because several explanations still have to be made regarding most of these proteins. Recent data from our research group has shown that null mutants of S. enterica Typhimurium for genes encoding NAPs are attenuated for virulence and capable of inducing protection in a murine model of infection. These results demonstrate the important role of these proteins in bacterial virulence. Thus, the present study aims at the construction of null mutants for two genes encoding NAPs (stpA and ybaB) in S. enterica Typhimurium and at the evaluation of the phenotype of these mutants. There are no data in the literature about the role of such NAPs regarding bacterial virulence. For the YbaB, there are no data in the literature about the role of this NAP in enterobacteria. The ? Red recombination system was used to obtain the mutants. For observation of the phenotype of such strains, in vitro and in vivo experiments were performed. The results obtained in in vitro experiments showed interesting phenotypes of mutant strains compared to their wild-type strains. In the case of ?stpA mutation, increased cell survival was observed on certain stress situations compared to the wild-type strain. For the ?ybaB mutation, our studies suggest that deletion of this gene had effect on motility of mutant cells. For virulence of the constructed mutants, these mutations did not affect the pathogenicity of S. enterica considerably. Thus, the mutant strains obtained in this study have no potential to be applied as vaccines, but this work provides prospects for future studies on the biological role of YbaB in S. enterica / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T04:43:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Damiani_IgorAlexandreCampos_M.pdf: 2676549 bytes, checksum: 95c7715f3b322149e80749501a5500a2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Salmonella enterica Typhimurium é uma bactéria anaeróbica facultativa que apresenta tropismo por áreas tumorais. Esta interessante propriedade abre novas perspectivas em relação à pesquisa contra o câncer, pois há muito tempo buscam-se veículos seletivos para a eliminação de neoplasias. A inibição do crescimento tumoral e até mesmo seu total retrocesso foram observados em modelos murinos de câncer tratados com linhagens atenuadas de S. enterica. Além disso, seu potencial como veículo de moléculas antitumorais exógenas (vacina de DNA, RNAi, citocinas e enzimas, por exemplo) também foi descrito. No entanto, as linhagens testadas em humanos até o presente não induziram os mesmos efeitos observados nos modelos animais. Isto indica que estudos adicionais são necessários para otimização desta terapia, incluindo o teste de novas linhagens mutantes atenuadas de S. enterica....Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Salmonella enterica Typhimurium, a facultative anaerobic bacterium, presents tropism for tumor areas. This interesting property creates new perspectives in cancer research, in which great efforts have been done to seek a drug carrier that could selectively target and destroy malignant cells. Inhibition of tumor growth and even its total elimination were observed in murine cancer models infected by attenuated strains of S. enterica. Besides, its potential as a carrier of exogenous antitumor molecules (DNA vaccine, iRNA, cytokines and enzymes, for example) is also described. Nevertheless, when these strains were tested in humans, they did not induce the same effects observed in murine models. Thus, additional studies are needed to optimize this therapy, including the test of novel S. enterica attenuated strains...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

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Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología / Memoria para optar al Título de Bioquímico / El género Salmonella agrupa a más de 2500 serovares, muchos de los cuales son patógenos humanos y animales. El serovar Dublin afecta principalmente al ganado bovino pudiendo llegar a infectar a seres humanos por el consumo de alimentos contaminados. Salmonella presenta diversos mecanismos que le permiten ingresar y colonizar sistémicamente a sus hospederos. Algunos de estos mecanismos se relacionan con la capacidad de invadir el epitelio intestinal y sobrevivir al interior de las células del sistema inmune del hospedero, principalmente macrófagos. En ambos procesos los sistemas de secreción de proteínas juegan un papel fundamental. El Sistema de Secreción Tipo VI (T6SS) es el sistema de secreción más recientemente descrito en bacterias Gram negativo. Este sistema se encuentra codificado en el genoma de cerca del 25% de las bacterias secuenciadas y su importancia en las relaciones interbacterianas y en la relación bacteria-hospedero lo han convertido en un blanco de estudio de gran interés. Previamente, hemos identificado la presencia de 5 T6SS filogenéticamente distintos y distribuidos diferencialmente en representantes del género Salmonella. S. Dublin posee dos T6SS codificados en las islas de patogenicidad SPI-6 y SPI-19. El objetivo de este proyecto fue determinar si los T6SS codificados en SPI-6 y SPI-19 se expresan al interior de macrófagos murinos y si cumplen un papel en los procesos de invasión y supervivencia intracelular de S. Dublin en estas células. Para esto, se evaluó la expresión intracelular y translocación de un componente fundamental del sistema (VgrG) y se compararon mutantes de los T6SS de SPI-6 y SPI-19 respecto a la cepa silvestre en su capacidad de invadir y sobrevivir en macrófagos murinos en cultivo in vitro. Para evaluar la expresión del gen vgrG y de la proteína VgrG codificada en cada uno de los T6SS presentes en el genoma de S. Dublin al interior de macrófagos, se construyeron en el cromosoma de la bacteria fusiones transcripcionales y traduccionales a la proteína fluorescente verde y se infectaron macrófagos RAW 264.7 con las cepas que contenían estas fusiones. Mediante microscopía de epifluorescencia se observó la expresión de las fusiones transcripcionales y traduccionales del componente VgrG de ambos T6SS desde tiempos tempranos de infección. Para determinar la translocación de VgrG al citoplasma de macrófagos infectados in vitro, se utilizaron fusiones traduccionales de VgrGSPI-6 y VgrGSPI-19 al reportero TEM-1 construidas en el plasmidio pFlagTEM. La translocación de cada proteína de fusión se determinó mediante un ensayo de fluorescencia acoplado a FRET. Para ello, se infectaron macrófagos RAW 264.7 con las cepas que contenían estas fusiones y posteriormente se analizaron los macrófagos infectados mediante microscopía de epifluorescencia. Se observó la translocación de VgrGSPI-19 a tiempos tempranos de infección y la translocación de VgrGSPI-6 a tiempos tardíos de infección. Sin embargo, la baja frecuencia de los eventos de translocación observados hace necesario realizar la comprobación del fenómeno mediante metodologías más sensibles. Para determinar si los T6SS codificados en el genoma de S. Dublin participan en los procesos de internalización y supervivencia de la bacteria al interior de macrófagos murinos, se realizaron ensayos de protección a gentamicina. En ellos se comparó la capacidad de ingresar y sobrevivir al interior de macrófagos RAW 264.7 de la cepa silvestre y cepas mutantes de los T6SS o del componente ClpV. Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que ninguno de los T6SS contribuye a la invasión y supervivencia intracelular de S. Dublin en macrófagos murinos. En conclusión, los T6SS codificados en las islas de patogenicidad SPI-6 y SPI-19 de S. Dublin se expresan al interior de macrófagos murinos, pero no participan en la capacidad de la bacteria para invadir y sobrevivir al interior de éstos. / The Salmonella genus includes over 2500 serovars, many of which are human and animal pathogens. Although the serovar Dublin affects mainly livestock, it constitutes a threat to humans who consume contaminated foods. Salmonella has several mechanisms to colonize its hosts systemically. These mechanisms allow it to invade the intestinal epithelium and survive within immune cells, mainly macrophages. Of note, protein secretion systems play a central role in these processes. The Type VI Secretion System (T6SS) is the most recently described protein secretion system in Gram-negative bacteria. This secretion system is present in about 25% of all bacterial genomes and its putative role in inter-bacteria and bacteria-host relationships makes it an important target for scientific research. Previously we have identified the presence of 5 phylogenetically diverse T6SS distributed differentially in the Salmonella genus. S. Dublin carries two of these systems codified in the pathogenicity islands SPI-6 and SPI-19. The aim of this thesis was to determine if the T6SSs codified in SPI-6 and SPI-19 are expressed in and translocated to the cytosol of murine macrophages, and if they play a role in the internalization and survival of S. Dublin inside these cells. To achieve this, intracellular expression and translocation of a core component of T6SSs (VgrG) was analyzed and T6SS mutants were compared with the parental strain in their ability to invade and survive within murine macrophages in vitro. To asses the expression of the vgrG gene and VgrG protein codified in each S. Dublin T6SS within murine macrophages, transcriptional and translational fusions to the green fluorescent protein were constructed and macrophages RAW 264.7 were infected using the strains bearing these fusions. Using epifluorescence microscopy, expression was observed for the transcriptional and translational fusions of the VgrG component of both T6SSs. To determine the translocation of VgrG to the cytosol of infected macrophages in vitro, translational fusions of VgrGSPI-6 and VgrGSPI-19 to the TEM-1 reporter were constructed in plasmid pFlagTEM. Translocation of each protein was determined using a FRET-coupled fluorescence assay. To achieve this, RAW 264.7 macrophages were infected using strains bearing these fusions and subsequent analysis of the infected macrophages was carried out by epifluorescence microscopy. VgrGSPI-19 translocation was observed shortly after infection and VgrGSPI-6 translocation was observed several hours after infection. Noteworthy, due to the low frequency of the translocation events observed it is necessary to confirm this observation by means of more sensitive methods. To determine if the T6SSs codified in the S. Dublin genome play a role in the internalization and survival processes of the bacteria within murine macrophages, gentamicin protection assays where conducted. In these experiments, the ability to enter and survive in RAW 264.7 macrophages in vitro was compared between T6SS and ClpV mutant strains and the parental strain. The results of this work show that none of the T6SSs contribute to the ability of S. Dublin to invade and survive in murine macrophages. In conclusion, the T6SS encoded in pathogenicity islands SPI-6 and SPI-19 of S. Dublin are expressed in murine macrophages, but these do not play a role in the invasion or intracellular survival of the bacteria in these cells. / Fondecyt

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El pingüino de Magallanes (Spheniscus magellanicus) es el más abundante del género Spheniscus, vive en Argentina, Chile y las Islas Falkland y es considerado centinela de la vida marina. Salmonella enterica es importante en aves silvestres, ya que se ha descrito la transmisión directa de la bacteria desde éstas a otros animales incluyendo el ser humano. El rol de la actividad humana en la presencia de Salmonella en pingüinos no está clara. Existen pocos estudios sobre Salmonella en pingüinos, siendo los serovares Typhimurium y Enteritidis patógenos para ellos, desconociéndose la presencia de cepas resistentes a los antibióticos en estas aves. El objetivo de este estudio fue determinar la presencia de cepas de S. enterica con resistencia a antimicrobianos en heces de S. magellanicus, de la región de Magallanes y la Antártica Chilena. A partir de 2114 muestras se aislaron 8 cepas pertenecientes a los serovares Agona y Enteritidis, obteniendo una tasa de aislamiento de 0,38%. Aunque todas las cepas resultaron ser sensibles a Cefradina, Cefadroxilo, Enrofloxacino, Amoxicilina + Ácido Clavulánico, Gentamicina y Sulfametoxazol + Trimetoprim, se detectó resistencia a los antibióticos Tetraciclina, Ampicilina, Ceftiofur y Cefotaxima. Estos resultados confirman la presencia de S. enterica en Pingüinos Magallánicos de la Región de Magallanes y la Antártica Chilena, y sugieren que existe un efecto antropogénico por el uso de antibióticos tanto en humanos como en animales domésticos, debido al aumento de la actividad turística y asentamientos humanos (actividad minera y agropecuaria en Seno Otway, y transporte marítimo en el estrecho de Magallanes), incrementando el volumen de desechos en época turística / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1110255