Thesis (M.S.)--Auburn University, 2007. / Abstract. Vita. Includes bibliographic references (ℓ. 44-49)

As salmonelas causadoras do Paratifo Aviário, principalmente a Salmonella Enteritidis (SE), têm estado entre as principais causas de toxinfecção alimentar em humanos, causando grandes prejuízos ao setor produtivo. A busca de uma medida única e definitiva para o controle do Paratifo Aviário tem levado a frustração dos esforços empregados, em função das características dos agentes e da infecção provocada. Portanto, ganha força a estratégia de utilizar-se um conjunto de medidas que objetivem a redução gradativa da pressão infectiva em um sistema de produção, levando à melhora crescente do grau de contaminação dos produtos disponibilizados aos consumidores. O objetivo desta tese é fornecer à indústria avícola um conjunto de meios práticos para o controle do Paratifo Aviário e, conseqüentemente, para a produção de alimentos mais seguros ao consumo humano. Para tanto, foram conduzidos quatro estudos, sendo que três estudos foram dedicados ao aumento de resistência das aves à infecção por SE e o quarto estuda a redução do número desta bactéria na ave no período de pré-abate. Em um experimento avaliou-se a imunização das aves com uma bacterina de SE, objetivando o aumento da resistência à infecção por SE em matrizes de frango de corte. Três semanas após o início do desafio, não foram detectadas diferenças entre os grupos testados nos números de SE recuperadas do ceco e no número de cecos e fígados infectados por este agente. Esta conclusão, embora verdadeira para as condições experimentais usadas, necessita de experimentações adicionais em condições de criação tradicional para ser referendada. A Vacinação Maternal e o uso de Probiótico, como medidas para aumentar a resistência inicial de pintos de corte, foram estudados em 3 experimentos. O uso de Probiótico causou uma redução no número de ufc de SE nos cecos de até 1,45 log10. A maior redução, ocorrida no Experimento III, demonstra a importância da antecipação do uso do Probiótico em relação ao início do desafio. Não se verificou nenhum efeito da Vacinação Maternal no número de cecos positivos ou no número de ufc de SE no ceco. Em quatro experimentos foram investigados os efeitos da pulverização da cepa 9R de Salmonella Gallinarum (SG-9R) em pintos de corte de um dia de idade sobre a infecção provocada artificialmente por SE. A aplicação da SG-9R em pintos de um dia apresenta potencial para auxiliar no controle da infecção por SE. Em que pese essa conclusão, estudos adicionais são necessários para verificar a magnitude da efetividade desta medida, bem como determinar a probabilidade de reversão de patogenicidade da SG-9R. Em três experimentos estudou-se a administração de água acidificada no pré abate de frangos de corte. Esta administração nas 24 horas que precedem o carregamento para o abate levou a uma redução de 99% no número de salmonelas no inglúvio dos frangos. Esta medida não é ideal, já que não evita a doença nas aves e, também, não garante a produção de alimentos integralmente livre de Salmonella. Porém, pode tornar-se uma importante ferramenta para redução da contaminação no abate dos lotes de frangos positivos para enfermidade. / Salmonellae that cause paratyphoid infection, mainly the Salmonella Enteritidis (SE), are among the main causes of foodborne diseases in humans, representing great loss for the poultry industry. The search for a unique and decisive control means has been frustrated due to the bacterial characteristics and the resulting infection. So, it becomes important the strategic use of a group of means that gradually reduce the infection pressure over the production system, taken to an increasing improvement of the contamination level of the final products offered to the consumers. The thesis goal is to offer to the poultry industry a group of feasible means to control the paratyphoid infection and, corollary, to produce safer food to human beings. Therefore, four studies were conducted. Three of them were dedicated to the increase of bird resistence to the SE infection and one to the reduction of Salmonella contamination level of the broilers at the pre slaughter period. The increase resistance of broiler breeders due to immunization with a SE bacterin was evaluated through an experiment. Three weeks after the challenge no differences were detected on the number of SE infected livers and ceca among the tested groups. This conclusion, although true under these conditions, needs further experiments under actual production systems to be corroborated. The maternal vaccination and the use of probiotics as means to increase the initial resistance of broiler chickens to SE infection were accessed through three experiments. The probiotics reduced the number of SE colony forming units (CFU) in the ceca up to 1.45 Log10. The greatest reduction occurred at Experiment III, indicating the importance of the administration of the probiotic being prior to the challenge. No effect of maternal vaccination on the number of ceca positive to SE or the number of SE CFU recovered from the ceca. The effect of spraying day old chickens with Salmonella Gallinarum strain 9R (SG- 9R) on SE infection due to artificial challenge was accessed through four experiments. The application of SG-9R to day old chickens has a potential to help in the control of SE infection. In spite of this conclusion, further studies are needed to access the size of the effect, as well to determinate the probability of pathogenicity reversion of SG-9R. Three experiments were done to study the effect of administration of acidified water to the broilers at the pre slaughter period on the presence of SE in the crop. The use of acidified water starting 24 hours before the initial loading of broilers to the slaughter plant caused a reduction of 99% on the number of SE taken from the crop. This is not an ideal approach, since it does not avoid the presence of SE in the broiler and, also, does not warrant the production of food free of Salmonella. Although it can be a important tool to the contamination reduction of broiler flocks positive to Salmonella.

Salmonella enterica sorovar (S.) Enteritidis é uma das principais bactérias envolvidas em surtos de infecção alimentar em humanos decorrentes do consumo de produtos de origem animal. Nas investigações epidemiológicas, a subtipificação fenotípica e genotípica permitem verificar diferenças ou similaridades entre linhagens, as quais podem indicar sua origem, auxiliando os programas de controle e prevenção do patógeno. No presente trabalho, foram analisados os padrões de resistência a antimicrobianos, fagotipificação, macrorestrição de DNA seguida de eletroforese em campo pulsado (PFGE) e polimorfismo de comprimento do fragmento amplificado utilizando uma única enzima de restrição (SEAFLP) de 107 linhagens de S. Enteritidis, sendo 53 isoladas de aves e seus produtos (carcaças, carne, vísceras e ambiente) e uma de origem suína. Foram ainda analisadas 29 linhagens isoladas de alimentos e 14 isoladas de humanos envolvidos em surtos de salmonelose notificados no Rio Grande do Sul, uma amostra de referência (ATCC 13076), além de 9 linhagens isoladas na Europa e África. Na comparação entre amostras isoladas de aves e de surtos de salmonelose, as linhagens de origem avícola foram significativamente mais resistentes a antimicrobianos do que as isoladas de humanos e, embora não tenha sido encontrada relação entre os genótipos de PFGE e os padrões de resistência, a associação de ambas as técnicas possibilitou uma melhor caracterização de S. Enteritidis, podendo ser úteis como marcadores epidemiológicos. Por outro lado, SE-AFLP agrupou a maioria das linhagens de S. Enteritidis num padrão principal. Paralelamente, na comparação de técnicas genotípicas com base em PCR, SE-AFLP apresentou maior capacidade de discriminação, embora inferior à verificada pela fagotipificação e perfil de resistência a antimicrobianos. Assim, foi recomendado que esta técnica deve ser utilizada em associação com outras metodologias na tipificação de S. Enteritidis. Posteriormente, na caracterização do conjunto de linhagens de S. Enteritidis, foram identificados 13 diferentes padrões de resistência a antimicrobianos, além de 12 padrões de PFGE e 3 de SE-AFLP. As técnicas genotípicas demonstraram que existe um genótipo predominante de S. Enteritidis no Rio Grande do Sul, o qual está presente em aves e produtos relacionados, além de alimentos e humanos envolvidos em surtos de salmonelose, sugerindo que estas linhagens possam derivar de uma fonte comum, tendo provável relação clonal. Embora havendo um genótipo predominante de S. Enteritidis, a associação das técnicas propostas possibilitou a melhor caracterização do patógeno. / Salmonella enterica subsp. enterica (S.) serovar Enteritidis is one of the main pathogens involved in food-borne diseases worldwide. Subtyping is crucial to differentiate strains, as well to study its origin and major infection route, which can direct preventive and control measures in epidemiological investigations of food-related salmonellosis. In order to investigate phenotypic and genotypic characterization in S. Enteritidis, the aim of this study was analyze the antimicrobial resistance, phage types, pulsed-field gel elecrophoresis (PFGE) and single-enzyme amplified-fragment length polymorphism (SEAFLP patterns of 107 S. Enteritidis strains isolated from poultry (53 isolates from carcass, meat, viscera and environmental swab) and one from swine. We also analyzed 29 strains from food and 14 from humans involved in salmonellosis outbreaks in Rio Grande do Sul, one reference strain (ATCC 13076) and 9 strains isolated from African and European countries. Resistance rates found in poultry-related strains were significantly higher than that observed in strains isolated from humans. Since identical PFGE profiles were identified in antimicrobial resistant and susceptible strains, it was not possible to find relationship between the PFGE genotypes and the antimicrobial resistance patterns found. However, both approaches were able to improve S. Enteritidis characterization. On the other hand, SE-AFLP clustered most of the S. Enteritidis strains in a major pattern. In a comparison between based-PCR approaches, SE-AFLP showed a higher discriminatory power, although it was lower than that displayed by antimicrobial resistance and phage type patterns. Thus, SE-AFLP might be used associated to other approaches for S. Enteritidis characterization. In contrast, 13 different antimicrobial resistance patterns, 12 PFGE genotypes and 3 SE-AFLP genotypes were identified in the S. Enteritidis strains. Genotypic approaches showed that the strains isolated from poultry, poultry-related products, food and humans involved in salmonelosis outbreaks shared a major pattern. These results suggest that the strains have a close relationship and the association of the different approaches improved S. Enteritidis characterization.

Memoria para optar al Título de Bioquímico / The genus Salmonella belongs to the Enterobacteriaceae family and comprises two species: S. bongori and S. enterica. Both species include more than 2500 serovars. Within S. enterica serovars, the most studied are S. Typhi, S. Typhimurium and S. Enteritidis, the latter being the main causative agent of salmonellosis worldwide. During its infective cycle, Salmonella needs to adapt to variations in different environmental conditions, such as changes in pH, osmolarity and oxygen availability. In addition, these conditions serve as environmental signals that modulate the expression of virulence factors. One of these factors is the lipopolysaccharide (LPS), the main component of the envelope of Gram negative bacteria. The LPS presents three structural domains: the O antigen (AgO), the core region and lipid A, also called endotoxin. The latter anchors the LPS to the outer membrane, and is a known virulence factor responsible for the induction of the immune response. The lipid A domain is capable of undergoing covalent modifications, which modulate its toxicity and helps bacteria to evade antimicrobial agents and the immune system of the host. One of the main environmental cues faced by Salmonella during its infectious cycle is the oxygen availability. During the aerobic-anaerobic transition participates the global regulators ArcA and Fnr. Results from our laboratory show that changes in the polymerization degree of the AgO in response to oxygen availability is modulated by these regulators. This observation led us to examine whether global regulators Fnr and ArcA are involved in the control of probable oxygen-dependent modifications of lipid A in response to oxygen availability. The main goal of this study was to determine the effect of oxygen availability on covalent modifications of lipid A in S. Enteritidis and the participation of transcriptional factors ArcA and Fnr in this process. First, we mounted a method for LPS extraction followed by a hydrolysis step to obtain a highly-purified lipid A that can be used to study the composition of this molecule by MALDI-TOF. Thus, in aerobiosis we observed four major signals corresponding to hexa-acylated and hepta-acylated lipid A molecules and their corresponding hydroxylated species. Under this environmental condition, hydroxylated species were more abundant than non-hydroxylated species. In the case of anaerobic cultures we detected the same four signal, but this relationship is reversed, being more abundant the nonhydroxylated species. To determine the participation of ArcA and Fnr in the modulation of covalent modifications of lipid A, we generated ΔarcA and Δfnr mutant strains and a strain overproducing ArcA (parcA). Our results indicate that both regulators are involved in controlling structural changes of lipid A in response to oxygen availability. Additionally, we observed that these regulators control the incorporation of other covalent modifications into lipid A. LpxO enzyme (encoded by lpxO gene) is responsible of the hydroxylation of lipid A in Salmonella. Therefore, we studied the relative expression (anaerobic/aerobic) of this gene in wild-type S. Enteritidis and their Δfnr and parcA derivatives via qRT-PCR. Our results indicate that the expression of lpxO depends on oxygen availability, an observation that is consistent with changes in the levels of lipid A hydroxylation described herein. Furthermore, ArcA and Fnr participate in the modulation of the expression of this gene. The results of this study reveal a change in the hydroxylation degree of S. Enteritidis lipid A in response to oxygen availability, in which global regulators ArcA and Fnr are involved. These findings contribute to understanding the molecular mechanisms of adaptation to the environment used by Salmonella during infection / Fondecyt

As salmonelas causadoras do Paratifo Aviário, principalmente a Salmonella Enteritidis (SE), têm estado entre as principais causas de toxinfecção alimentar em humanos, causando grandes prejuízos ao setor produtivo. A busca de uma medida única e definitiva para o controle do Paratifo Aviário tem levado a frustração dos esforços empregados, em função das características dos agentes e da infecção provocada. Portanto, ganha força a estratégia de utilizar-se um conjunto de medidas que objetivem a redução gradativa da pressão infectiva em um sistema de produção, levando à melhora crescente do grau de contaminação dos produtos disponibilizados aos consumidores. O objetivo desta tese é fornecer à indústria avícola um conjunto de meios práticos para o controle do Paratifo Aviário e, conseqüentemente, para a produção de alimentos mais seguros ao consumo humano. Para tanto, foram conduzidos quatro estudos, sendo que três estudos foram dedicados ao aumento de resistência das aves à infecção por SE e o quarto estuda a redução do número desta bactéria na ave no período de pré-abate. Em um experimento avaliou-se a imunização das aves com uma bacterina de SE, objetivando o aumento da resistência à infecção por SE em matrizes de frango de corte. Três semanas após o início do desafio, não foram detectadas diferenças entre os grupos testados nos números de SE recuperadas do ceco e no número de cecos e fígados infectados por este agente. Esta conclusão, embora verdadeira para as condições experimentais usadas, necessita de experimentações adicionais em condições de criação tradicional para ser referendada. A Vacinação Maternal e o uso de Probiótico, como medidas para aumentar a resistência inicial de pintos de corte, foram estudados em 3 experimentos. O uso de Probiótico causou uma redução no número de ufc de SE nos cecos de até 1,45 log10. A maior redução, ocorrida no Experimento III, demonstra a importância da antecipação do uso do Probiótico em relação ao início do desafio. Não se verificou nenhum efeito da Vacinação Maternal no número de cecos positivos ou no número de ufc de SE no ceco. Em quatro experimentos foram investigados os efeitos da pulverização da cepa 9R de Salmonella Gallinarum (SG-9R) em pintos de corte de um dia de idade sobre a infecção provocada artificialmente por SE. A aplicação da SG-9R em pintos de um dia apresenta potencial para auxiliar no controle da infecção por SE. Em que pese essa conclusão, estudos adicionais são necessários para verificar a magnitude da efetividade desta medida, bem como determinar a probabilidade de reversão de patogenicidade da SG-9R. Em três experimentos estudou-se a administração de água acidificada no pré abate de frangos de corte. Esta administração nas 24 horas que precedem o carregamento para o abate levou a uma redução de 99% no número de salmonelas no inglúvio dos frangos. Esta medida não é ideal, já que não evita a doença nas aves e, também, não garante a produção de alimentos integralmente livre de Salmonella. Porém, pode tornar-se uma importante ferramenta para redução da contaminação no abate dos lotes de frangos positivos para enfermidade. / Salmonellae that cause paratyphoid infection, mainly the Salmonella Enteritidis (SE), are among the main causes of foodborne diseases in humans, representing great loss for the poultry industry. The search for a unique and decisive control means has been frustrated due to the bacterial characteristics and the resulting infection. So, it becomes important the strategic use of a group of means that gradually reduce the infection pressure over the production system, taken to an increasing improvement of the contamination level of the final products offered to the consumers. The thesis goal is to offer to the poultry industry a group of feasible means to control the paratyphoid infection and, corollary, to produce safer food to human beings. Therefore, four studies were conducted. Three of them were dedicated to the increase of bird resistence to the SE infection and one to the reduction of Salmonella contamination level of the broilers at the pre slaughter period. The increase resistance of broiler breeders due to immunization with a SE bacterin was evaluated through an experiment. Three weeks after the challenge no differences were detected on the number of SE infected livers and ceca among the tested groups. This conclusion, although true under these conditions, needs further experiments under actual production systems to be corroborated. The maternal vaccination and the use of probiotics as means to increase the initial resistance of broiler chickens to SE infection were accessed through three experiments. The probiotics reduced the number of SE colony forming units (CFU) in the ceca up to 1.45 Log10. The greatest reduction occurred at Experiment III, indicating the importance of the administration of the probiotic being prior to the challenge. No effect of maternal vaccination on the number of ceca positive to SE or the number of SE CFU recovered from the ceca. The effect of spraying day old chickens with Salmonella Gallinarum strain 9R (SG- 9R) on SE infection due to artificial challenge was accessed through four experiments. The application of SG-9R to day old chickens has a potential to help in the control of SE infection. In spite of this conclusion, further studies are needed to access the size of the effect, as well to determinate the probability of pathogenicity reversion of SG-9R. Three experiments were done to study the effect of administration of acidified water to the broilers at the pre slaughter period on the presence of SE in the crop. The use of acidified water starting 24 hours before the initial loading of broilers to the slaughter plant caused a reduction of 99% on the number of SE taken from the crop. This is not an ideal approach, since it does not avoid the presence of SE in the broiler and, also, does not warrant the production of food free of Salmonella. Although it can be a important tool to the contamination reduction of broiler flocks positive to Salmonella.

Salmonella enterica sorovar (S.) Enteritidis é uma das principais bactérias envolvidas em surtos de infecção alimentar em humanos decorrentes do consumo de produtos de origem animal. Nas investigações epidemiológicas, a subtipificação fenotípica e genotípica permitem verificar diferenças ou similaridades entre linhagens, as quais podem indicar sua origem, auxiliando os programas de controle e prevenção do patógeno. No presente trabalho, foram analisados os padrões de resistência a antimicrobianos, fagotipificação, macrorestrição de DNA seguida de eletroforese em campo pulsado (PFGE) e polimorfismo de comprimento do fragmento amplificado utilizando uma única enzima de restrição (SEAFLP) de 107 linhagens de S. Enteritidis, sendo 53 isoladas de aves e seus produtos (carcaças, carne, vísceras e ambiente) e uma de origem suína. Foram ainda analisadas 29 linhagens isoladas de alimentos e 14 isoladas de humanos envolvidos em surtos de salmonelose notificados no Rio Grande do Sul, uma amostra de referência (ATCC 13076), além de 9 linhagens isoladas na Europa e África. Na comparação entre amostras isoladas de aves e de surtos de salmonelose, as linhagens de origem avícola foram significativamente mais resistentes a antimicrobianos do que as isoladas de humanos e, embora não tenha sido encontrada relação entre os genótipos de PFGE e os padrões de resistência, a associação de ambas as técnicas possibilitou uma melhor caracterização de S. Enteritidis, podendo ser úteis como marcadores epidemiológicos. Por outro lado, SE-AFLP agrupou a maioria das linhagens de S. Enteritidis num padrão principal. Paralelamente, na comparação de técnicas genotípicas com base em PCR, SE-AFLP apresentou maior capacidade de discriminação, embora inferior à verificada pela fagotipificação e perfil de resistência a antimicrobianos. Assim, foi recomendado que esta técnica deve ser utilizada em associação com outras metodologias na tipificação de S. Enteritidis. Posteriormente, na caracterização do conjunto de linhagens de S. Enteritidis, foram identificados 13 diferentes padrões de resistência a antimicrobianos, além de 12 padrões de PFGE e 3 de SE-AFLP. As técnicas genotípicas demonstraram que existe um genótipo predominante de S. Enteritidis no Rio Grande do Sul, o qual está presente em aves e produtos relacionados, além de alimentos e humanos envolvidos em surtos de salmonelose, sugerindo que estas linhagens possam derivar de uma fonte comum, tendo provável relação clonal. Embora havendo um genótipo predominante de S. Enteritidis, a associação das técnicas propostas possibilitou a melhor caracterização do patógeno. / Salmonella enterica subsp. enterica (S.) serovar Enteritidis is one of the main pathogens involved in food-borne diseases worldwide. Subtyping is crucial to differentiate strains, as well to study its origin and major infection route, which can direct preventive and control measures in epidemiological investigations of food-related salmonellosis. In order to investigate phenotypic and genotypic characterization in S. Enteritidis, the aim of this study was analyze the antimicrobial resistance, phage types, pulsed-field gel elecrophoresis (PFGE) and single-enzyme amplified-fragment length polymorphism (SEAFLP patterns of 107 S. Enteritidis strains isolated from poultry (53 isolates from carcass, meat, viscera and environmental swab) and one from swine. We also analyzed 29 strains from food and 14 from humans involved in salmonellosis outbreaks in Rio Grande do Sul, one reference strain (ATCC 13076) and 9 strains isolated from African and European countries. Resistance rates found in poultry-related strains were significantly higher than that observed in strains isolated from humans. Since identical PFGE profiles were identified in antimicrobial resistant and susceptible strains, it was not possible to find relationship between the PFGE genotypes and the antimicrobial resistance patterns found. However, both approaches were able to improve S. Enteritidis characterization. On the other hand, SE-AFLP clustered most of the S. Enteritidis strains in a major pattern. In a comparison between based-PCR approaches, SE-AFLP showed a higher discriminatory power, although it was lower than that displayed by antimicrobial resistance and phage type patterns. Thus, SE-AFLP might be used associated to other approaches for S. Enteritidis characterization. In contrast, 13 different antimicrobial resistance patterns, 12 PFGE genotypes and 3 SE-AFLP genotypes were identified in the S. Enteritidis strains. Genotypic approaches showed that the strains isolated from poultry, poultry-related products, food and humans involved in salmonelosis outbreaks shared a major pattern. These results suggest that the strains have a close relationship and the association of the different approaches improved S. Enteritidis characterization.

Este trabalho foi conduzido com o objetivo de gerar dados de resistência a agentes antimicrobianos de Salmonella Enteritidis (SE) isoladas de amostras clínicas e do ambiente criatório de aves, nos anos de 1999, 2000 e 2001, de cortes de frango, no ano de 1996, ambos na região Sul, bem como de carcaças de frango, nos anos de 2004 e 2005, na região Nordeste, detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas das cepas que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico e fagotipá-las. Realizou-se também a ribotipagem de 28 cepas de SE isoladas de carcaças resfriadas de frango no ano de 2004, na região Sudeste. Cento e dezesete cepas de SE foram submeitdos foram submetidas a testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos e os resultados indicaram que 84,6% (99/117) das cepas de Salmonella Enteritidis apresentaram resistência a um ou mais agentes antimicrobianos, sendo que o maior percentual está entre as cepas isoladas de carcaças resfriadas de frango, 100% (17/17), seguidas pelas isoladas de cortes de frango, 85,7% (18/21) e das de amostras clínicas e de ambiente criatório de aves, 81% (64/79). Cepas com diferentes níveis de resistência foram encontradas para ampicilina (0,8%), canamicina (1,7%), ciprofloxacina (1,7%), enrofloxacina (10,2%), gentamicina (14,5%), estreptomicina (16,2%), ácido nalidíxico (35,9%), nitrofurantoína (47%) e tetracicilna (59%). Nenhuma das 117 cepas de Salmonella Enteritidis foi resistente ao cloranfenicol, norfloxacina e polimixina B. Dentre as 99 amostras de SE que apresentaram resistência, 66,6% (66), foram resistentes a dois ou mais agentes antimicrobianos. Trinta e três cepas (33,3%), foram resistentes somente a um agente antimicrobiano, 16 a tetraciclina, 12 a nitrofurantoína, três ao ácido nalidíxico, uma a estreptomicina e uma a gentamicina. Para detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas, 42 cepas de SE que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico foram submetidas a reação em cadeia da polimerase e sequenciamento. Das 42 cepas, 30 (71,4%) apresentaram algum tipo de mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas. As alterações gênicas ocorreram nos aminoácidos dos codons Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) ou Asp-87 (62%). As mutações continham alterações de Gly para Asp (n: 1) no codon 81, Asp para Asn (n: 1) no codon 82, Ser para Phe (n: 9) no codon 83 e Asp para Tyr (n: 9) ou Asn (n: 9) no codon 87. Uma amostra apresentou uma inclusão do aminoácido prolina entre os codons 56 e 57. A fagotipificação de 116 cepas de SE apresentou que 68,9% (80/116) pertencem ao fagotipo (FT) 4, 15,5% (18/116) ao FT 4a, 12,2% (14/116) ao FT 1, 0,9% (1/116) ao FT6, 0,9% (1/116) ao FT 6a, 0,9% (1/116) ao FT 7 e 0,9% (1/116) ao FT 7a. Quando leva-se em consideração a origem dos isolados, observamos que nas SE isoladas de amostras clínicas e ambientais criatório de aves, 56,4% pertencem ao FT 4, 21,8% ao FT 4a, 17,9% ao FT 1, 1,3% ao FT 6, 1,3% ao FT 6a e 1,3% ao FT 7a. Nas amostras isoladas de carne cortes de frango, o FT 4 predomina com 95,2% (20/21) e 4,8% (1/21), pertencem ao FT 7. Nos isolados de carcaças resfriadas de frango 94,1% são do FT 4 e 5,9% (1/17) do FT 4a. A caracterização por ribotipagem foi realizada utilizando-se o RiboPrinter® system (DuPont), e apresentou quatro diferentes ribotipos, sendo que o mais comum foi o 25-S-1 (82,1%), seguido pelo 29-S-5 (10,7%) e 28-S-5 e 38-S-3 com 3,5% cada um. Baseados nos dados do presente estudo, conclui-se que: houve uma elevada percentagem de cepas de Salmonella Enteritidis resistente a um ou mais agentes antimicrobianos, indicando que levantamentos contínuos são necessários na indústria avícola e que existe a necessidade de um uso responsável dos agentes antimicrobianos, baseado na compreensão da ecologia da resistência, da transmissão da bactéria resistente e de genes de resistência, da relação entre o uso do antibiótico e aumento da resistência e de um conhecimento de intervenções efetivas; Que assim como em outros trabalhos amostras de S. Enteritidis resistentes ao ácido nalidíxico, isoladas no Brasil, também apresentam mutação no gene gyrA, da região determinante de resistência a quinolonas; Que o FT 4 foi o predominante e que entre as cepas de S. Enteritidis isoladas de aves e de seu ambiente criatório existe uma maior diversidade de fagotipos quando comparada as isoladas de carcaças de frango; E que ao avaliarmos os dados gerados pela ribotipagem observamos um baixo grau de diversidade gênica entre as cepas de Salmonella Enteritidis utilizadas no presente estudo. / This work aimed to evaluate the antimicrobial resistance of Salmonella Enteritidis (SE) isolated from clinical and environmental poultry samples, during the years of 1999, 2000 and 2001, broiler chicken parts, in 1996, both in Southern Brazil, broiler chicken carcasses, during the years 2004 and 2005, in Northeastern Brazil, detect mutations in the gyrA gene from nalidixic acid resistant and identify their phage type. Also, 28 SE strains isolated during the year 2004 in Southeastern Brazil were characterized by ribotyping. The antimicrobial resistance test was performed using the disk diffusion method on Mueller-Hinton Agar. The results indicated that 84.6% (99/117) of SE strains were resistant to at least one of the antimicrobial agents tested. Resistance at different levels was found to ampicillin (0.8%), kanamycin (1.7%), cyprofloxacin (1.7%), enrofloxacin (10.2%), gentamycin (14.5%), streptomycin (16.2%), nalidixic acid (35.9%), nitrofurantoin (47%), and tetracycline (59%). None of the SE strains were resistant to chloramphenicol, norfloxacin and polimyxin B. Among the 99 SE strains showing resistance, 66.6% (66) presented multiple resistance, to two or more antimicrobial agents. Thirty-three strains (33.3%) were resistant to only one of the antimicrobial agents, 16 to tetracycline, 12 to nitrofurantoin, 3 to nalidixic acid, 1 to gentamycin, and 1 to streptomycin. Fourty-two nalidixic acid resistant strains were submited to PCR and sequencing to detect gyrA mutation genes. Thirty SE strains (71.4%) showed at least one mutation in gyrA genes of quinolone resistance determining region (QRDR), in the codons corrosponding to Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) or Asp-87 (62%). These mutants contained a change from Gly to Asp (n: 1) at codon 81, Asp to Asn (n: 1) at codon 82, Ser to Phe (n: 9) at codon 83 and Asp to Tyr (n: 9) or Asn (n: 9) at codon 87. In one sample there was a Pro inclusion between the 56 and 57 codons. The phage typing of 116 SE isolates showed that 68.9% (80/116) belonged to the phage type (PT) 4, 15.5% (18/116) to the PT 4a, 12.2% (14/116) to the PT 1, 0.9% (1/116) to the PT 6, 0.9% (1/116) to the PT 6a, 0.9% (1/116) to the PT 7, and 0.9% (1/116) to the PT 7a. The ribotyping characterization was done using RiboPrinter® system (DuPont), and showed four different ribotypes. The most common ribotype was 25-S-1 (82.1%). The other ribotypes were 29-S-5 (10.7%), 38-S-3 (3.6%) and 28-S-5 (3.6%). In conclusion, the antimicrobial resistance levels presented here suggest a high occurrence of Salmonella Enteritidis strains resistant to at least one antimicrobial agent, indicating the need for continuous surveillance in the poultry industry, and the need for responsible use of antimicrobial agents in food animals, based on a understanding of the ecology of resistance, the transmission of both bacteria and resistance genes, the relationship between antimicrobial agents use and resistance amplification, and the knowledge of effective interventions. S. Enteritidis nalidixic acid resistant strains isolated in Southern and Northeastern Brazil showed mutation in the gyrA gene of QRDR. Phage type 4 was the most common isolated and among S. Enteritidis strains isolated from clinical and environmental poultry samples there were a higher phagetype diversity when compared with broiler chicken carcasses. The S. Enteritidis strains that were ribotyping showed a lower degree of genetic diversity.

Este trabalho foi conduzido com o objetivo de gerar dados de resistência a agentes antimicrobianos de Salmonella Enteritidis (SE) isoladas de amostras clínicas e do ambiente criatório de aves, nos anos de 1999, 2000 e 2001, de cortes de frango, no ano de 1996, ambos na região Sul, bem como de carcaças de frango, nos anos de 2004 e 2005, na região Nordeste, detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas das cepas que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico e fagotipá-las. Realizou-se também a ribotipagem de 28 cepas de SE isoladas de carcaças resfriadas de frango no ano de 2004, na região Sudeste. Cento e dezesete cepas de SE foram submeitdos foram submetidas a testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos e os resultados indicaram que 84,6% (99/117) das cepas de Salmonella Enteritidis apresentaram resistência a um ou mais agentes antimicrobianos, sendo que o maior percentual está entre as cepas isoladas de carcaças resfriadas de frango, 100% (17/17), seguidas pelas isoladas de cortes de frango, 85,7% (18/21) e das de amostras clínicas e de ambiente criatório de aves, 81% (64/79). Cepas com diferentes níveis de resistência foram encontradas para ampicilina (0,8%), canamicina (1,7%), ciprofloxacina (1,7%), enrofloxacina (10,2%), gentamicina (14,5%), estreptomicina (16,2%), ácido nalidíxico (35,9%), nitrofurantoína (47%) e tetracicilna (59%). Nenhuma das 117 cepas de Salmonella Enteritidis foi resistente ao cloranfenicol, norfloxacina e polimixina B. Dentre as 99 amostras de SE que apresentaram resistência, 66,6% (66), foram resistentes a dois ou mais agentes antimicrobianos. Trinta e três cepas (33,3%), foram resistentes somente a um agente antimicrobiano, 16 a tetraciclina, 12 a nitrofurantoína, três ao ácido nalidíxico, uma a estreptomicina e uma a gentamicina. Para detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas, 42 cepas de SE que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico foram submetidas a reação em cadeia da polimerase e sequenciamento. Das 42 cepas, 30 (71,4%) apresentaram algum tipo de mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas. As alterações gênicas ocorreram nos aminoácidos dos codons Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) ou Asp-87 (62%). As mutações continham alterações de Gly para Asp (n: 1) no codon 81, Asp para Asn (n: 1) no codon 82, Ser para Phe (n: 9) no codon 83 e Asp para Tyr (n: 9) ou Asn (n: 9) no codon 87. Uma amostra apresentou uma inclusão do aminoácido prolina entre os codons 56 e 57. A fagotipificação de 116 cepas de SE apresentou que 68,9% (80/116) pertencem ao fagotipo (FT) 4, 15,5% (18/116) ao FT 4a, 12,2% (14/116) ao FT 1, 0,9% (1/116) ao FT6, 0,9% (1/116) ao FT 6a, 0,9% (1/116) ao FT 7 e 0,9% (1/116) ao FT 7a. Quando leva-se em consideração a origem dos isolados, observamos que nas SE isoladas de amostras clínicas e ambientais criatório de aves, 56,4% pertencem ao FT 4, 21,8% ao FT 4a, 17,9% ao FT 1, 1,3% ao FT 6, 1,3% ao FT 6a e 1,3% ao FT 7a. Nas amostras isoladas de carne cortes de frango, o FT 4 predomina com 95,2% (20/21) e 4,8% (1/21), pertencem ao FT 7. Nos isolados de carcaças resfriadas de frango 94,1% são do FT 4 e 5,9% (1/17) do FT 4a. A caracterização por ribotipagem foi realizada utilizando-se o RiboPrinter® system (DuPont), e apresentou quatro diferentes ribotipos, sendo que o mais comum foi o 25-S-1 (82,1%), seguido pelo 29-S-5 (10,7%) e 28-S-5 e 38-S-3 com 3,5% cada um. Baseados nos dados do presente estudo, conclui-se que: houve uma elevada percentagem de cepas de Salmonella Enteritidis resistente a um ou mais agentes antimicrobianos, indicando que levantamentos contínuos são necessários na indústria avícola e que existe a necessidade de um uso responsável dos agentes antimicrobianos, baseado na compreensão da ecologia da resistência, da transmissão da bactéria resistente e de genes de resistência, da relação entre o uso do antibiótico e aumento da resistência e de um conhecimento de intervenções efetivas; Que assim como em outros trabalhos amostras de S. Enteritidis resistentes ao ácido nalidíxico, isoladas no Brasil, também apresentam mutação no gene gyrA, da região determinante de resistência a quinolonas; Que o FT 4 foi o predominante e que entre as cepas de S. Enteritidis isoladas de aves e de seu ambiente criatório existe uma maior diversidade de fagotipos quando comparada as isoladas de carcaças de frango; E que ao avaliarmos os dados gerados pela ribotipagem observamos um baixo grau de diversidade gênica entre as cepas de Salmonella Enteritidis utilizadas no presente estudo. / This work aimed to evaluate the antimicrobial resistance of Salmonella Enteritidis (SE) isolated from clinical and environmental poultry samples, during the years of 1999, 2000 and 2001, broiler chicken parts, in 1996, both in Southern Brazil, broiler chicken carcasses, during the years 2004 and 2005, in Northeastern Brazil, detect mutations in the gyrA gene from nalidixic acid resistant and identify their phage type. Also, 28 SE strains isolated during the year 2004 in Southeastern Brazil were characterized by ribotyping. The antimicrobial resistance test was performed using the disk diffusion method on Mueller-Hinton Agar. The results indicated that 84.6% (99/117) of SE strains were resistant to at least one of the antimicrobial agents tested. Resistance at different levels was found to ampicillin (0.8%), kanamycin (1.7%), cyprofloxacin (1.7%), enrofloxacin (10.2%), gentamycin (14.5%), streptomycin (16.2%), nalidixic acid (35.9%), nitrofurantoin (47%), and tetracycline (59%). None of the SE strains were resistant to chloramphenicol, norfloxacin and polimyxin B. Among the 99 SE strains showing resistance, 66.6% (66) presented multiple resistance, to two or more antimicrobial agents. Thirty-three strains (33.3%) were resistant to only one of the antimicrobial agents, 16 to tetracycline, 12 to nitrofurantoin, 3 to nalidixic acid, 1 to gentamycin, and 1 to streptomycin. Fourty-two nalidixic acid resistant strains were submited to PCR and sequencing to detect gyrA mutation genes. Thirty SE strains (71.4%) showed at least one mutation in gyrA genes of quinolone resistance determining region (QRDR), in the codons corrosponding to Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) or Asp-87 (62%). These mutants contained a change from Gly to Asp (n: 1) at codon 81, Asp to Asn (n: 1) at codon 82, Ser to Phe (n: 9) at codon 83 and Asp to Tyr (n: 9) or Asn (n: 9) at codon 87. In one sample there was a Pro inclusion between the 56 and 57 codons. The phage typing of 116 SE isolates showed that 68.9% (80/116) belonged to the phage type (PT) 4, 15.5% (18/116) to the PT 4a, 12.2% (14/116) to the PT 1, 0.9% (1/116) to the PT 6, 0.9% (1/116) to the PT 6a, 0.9% (1/116) to the PT 7, and 0.9% (1/116) to the PT 7a. The ribotyping characterization was done using RiboPrinter® system (DuPont), and showed four different ribotypes. The most common ribotype was 25-S-1 (82.1%). The other ribotypes were 29-S-5 (10.7%), 38-S-3 (3.6%) and 28-S-5 (3.6%). In conclusion, the antimicrobial resistance levels presented here suggest a high occurrence of Salmonella Enteritidis strains resistant to at least one antimicrobial agent, indicating the need for continuous surveillance in the poultry industry, and the need for responsible use of antimicrobial agents in food animals, based on a understanding of the ecology of resistance, the transmission of both bacteria and resistance genes, the relationship between antimicrobial agents use and resistance amplification, and the knowledge of effective interventions. S. Enteritidis nalidixic acid resistant strains isolated in Southern and Northeastern Brazil showed mutation in the gyrA gene of QRDR. Phage type 4 was the most common isolated and among S. Enteritidis strains isolated from clinical and environmental poultry samples there were a higher phagetype diversity when compared with broiler chicken carcasses. The S. Enteritidis strains that were ribotyping showed a lower degree of genetic diversity.

As salmonelas causadoras do Paratifo Aviário, principalmente a Salmonella Enteritidis (SE), têm estado entre as principais causas de toxinfecção alimentar em humanos, causando grandes prejuízos ao setor produtivo. A busca de uma medida única e definitiva para o controle do Paratifo Aviário tem levado a frustração dos esforços empregados, em função das características dos agentes e da infecção provocada. Portanto, ganha força a estratégia de utilizar-se um conjunto de medidas que objetivem a redução gradativa da pressão infectiva em um sistema de produção, levando à melhora crescente do grau de contaminação dos produtos disponibilizados aos consumidores. O objetivo desta tese é fornecer à indústria avícola um conjunto de meios práticos para o controle do Paratifo Aviário e, conseqüentemente, para a produção de alimentos mais seguros ao consumo humano. Para tanto, foram conduzidos quatro estudos, sendo que três estudos foram dedicados ao aumento de resistência das aves à infecção por SE e o quarto estuda a redução do número desta bactéria na ave no período de pré-abate. Em um experimento avaliou-se a imunização das aves com uma bacterina de SE, objetivando o aumento da resistência à infecção por SE em matrizes de frango de corte. Três semanas após o início do desafio, não foram detectadas diferenças entre os grupos testados nos números de SE recuperadas do ceco e no número de cecos e fígados infectados por este agente. Esta conclusão, embora verdadeira para as condições experimentais usadas, necessita de experimentações adicionais em condições de criação tradicional para ser referendada. A Vacinação Maternal e o uso de Probiótico, como medidas para aumentar a resistência inicial de pintos de corte, foram estudados em 3 experimentos. O uso de Probiótico causou uma redução no número de ufc de SE nos cecos de até 1,45 log10. A maior redução, ocorrida no Experimento III, demonstra a importância da antecipação do uso do Probiótico em relação ao início do desafio. Não se verificou nenhum efeito da Vacinação Maternal no número de cecos positivos ou no número de ufc de SE no ceco. Em quatro experimentos foram investigados os efeitos da pulverização da cepa 9R de Salmonella Gallinarum (SG-9R) em pintos de corte de um dia de idade sobre a infecção provocada artificialmente por SE. A aplicação da SG-9R em pintos de um dia apresenta potencial para auxiliar no controle da infecção por SE. Em que pese essa conclusão, estudos adicionais são necessários para verificar a magnitude da efetividade desta medida, bem como determinar a probabilidade de reversão de patogenicidade da SG-9R. Em três experimentos estudou-se a administração de água acidificada no pré abate de frangos de corte. Esta administração nas 24 horas que precedem o carregamento para o abate levou a uma redução de 99% no número de salmonelas no inglúvio dos frangos. Esta medida não é ideal, já que não evita a doença nas aves e, também, não garante a produção de alimentos integralmente livre de Salmonella. Porém, pode tornar-se uma importante ferramenta para redução da contaminação no abate dos lotes de frangos positivos para enfermidade. / Salmonellae that cause paratyphoid infection, mainly the Salmonella Enteritidis (SE), are among the main causes of foodborne diseases in humans, representing great loss for the poultry industry. The search for a unique and decisive control means has been frustrated due to the bacterial characteristics and the resulting infection. So, it becomes important the strategic use of a group of means that gradually reduce the infection pressure over the production system, taken to an increasing improvement of the contamination level of the final products offered to the consumers. The thesis goal is to offer to the poultry industry a group of feasible means to control the paratyphoid infection and, corollary, to produce safer food to human beings. Therefore, four studies were conducted. Three of them were dedicated to the increase of bird resistence to the SE infection and one to the reduction of Salmonella contamination level of the broilers at the pre slaughter period. The increase resistance of broiler breeders due to immunization with a SE bacterin was evaluated through an experiment. Three weeks after the challenge no differences were detected on the number of SE infected livers and ceca among the tested groups. This conclusion, although true under these conditions, needs further experiments under actual production systems to be corroborated. The maternal vaccination and the use of probiotics as means to increase the initial resistance of broiler chickens to SE infection were accessed through three experiments. The probiotics reduced the number of SE colony forming units (CFU) in the ceca up to 1.45 Log10. The greatest reduction occurred at Experiment III, indicating the importance of the administration of the probiotic being prior to the challenge. No effect of maternal vaccination on the number of ceca positive to SE or the number of SE CFU recovered from the ceca. The effect of spraying day old chickens with Salmonella Gallinarum strain 9R (SG- 9R) on SE infection due to artificial challenge was accessed through four experiments. The application of SG-9R to day old chickens has a potential to help in the control of SE infection. In spite of this conclusion, further studies are needed to access the size of the effect, as well to determinate the probability of pathogenicity reversion of SG-9R. Three experiments were done to study the effect of administration of acidified water to the broilers at the pre slaughter period on the presence of SE in the crop. The use of acidified water starting 24 hours before the initial loading of broilers to the slaughter plant caused a reduction of 99% on the number of SE taken from the crop. This is not an ideal approach, since it does not avoid the presence of SE in the broiler and, also, does not warrant the production of food free of Salmonella. Although it can be a important tool to the contamination reduction of broiler flocks positive to Salmonella.

Salmonella enterica sorovar (S.) Enteritidis é uma das principais bactérias envolvidas em surtos de infecção alimentar em humanos decorrentes do consumo de produtos de origem animal. Nas investigações epidemiológicas, a subtipificação fenotípica e genotípica permitem verificar diferenças ou similaridades entre linhagens, as quais podem indicar sua origem, auxiliando os programas de controle e prevenção do patógeno. No presente trabalho, foram analisados os padrões de resistência a antimicrobianos, fagotipificação, macrorestrição de DNA seguida de eletroforese em campo pulsado (PFGE) e polimorfismo de comprimento do fragmento amplificado utilizando uma única enzima de restrição (SEAFLP) de 107 linhagens de S. Enteritidis, sendo 53 isoladas de aves e seus produtos (carcaças, carne, vísceras e ambiente) e uma de origem suína. Foram ainda analisadas 29 linhagens isoladas de alimentos e 14 isoladas de humanos envolvidos em surtos de salmonelose notificados no Rio Grande do Sul, uma amostra de referência (ATCC 13076), além de 9 linhagens isoladas na Europa e África. Na comparação entre amostras isoladas de aves e de surtos de salmonelose, as linhagens de origem avícola foram significativamente mais resistentes a antimicrobianos do que as isoladas de humanos e, embora não tenha sido encontrada relação entre os genótipos de PFGE e os padrões de resistência, a associação de ambas as técnicas possibilitou uma melhor caracterização de S. Enteritidis, podendo ser úteis como marcadores epidemiológicos. Por outro lado, SE-AFLP agrupou a maioria das linhagens de S. Enteritidis num padrão principal. Paralelamente, na comparação de técnicas genotípicas com base em PCR, SE-AFLP apresentou maior capacidade de discriminação, embora inferior à verificada pela fagotipificação e perfil de resistência a antimicrobianos. Assim, foi recomendado que esta técnica deve ser utilizada em associação com outras metodologias na tipificação de S. Enteritidis. Posteriormente, na caracterização do conjunto de linhagens de S. Enteritidis, foram identificados 13 diferentes padrões de resistência a antimicrobianos, além de 12 padrões de PFGE e 3 de SE-AFLP. As técnicas genotípicas demonstraram que existe um genótipo predominante de S. Enteritidis no Rio Grande do Sul, o qual está presente em aves e produtos relacionados, além de alimentos e humanos envolvidos em surtos de salmonelose, sugerindo que estas linhagens possam derivar de uma fonte comum, tendo provável relação clonal. Embora havendo um genótipo predominante de S. Enteritidis, a associação das técnicas propostas possibilitou a melhor caracterização do patógeno. / Salmonella enterica subsp. enterica (S.) serovar Enteritidis is one of the main pathogens involved in food-borne diseases worldwide. Subtyping is crucial to differentiate strains, as well to study its origin and major infection route, which can direct preventive and control measures in epidemiological investigations of food-related salmonellosis. In order to investigate phenotypic and genotypic characterization in S. Enteritidis, the aim of this study was analyze the antimicrobial resistance, phage types, pulsed-field gel elecrophoresis (PFGE) and single-enzyme amplified-fragment length polymorphism (SEAFLP patterns of 107 S. Enteritidis strains isolated from poultry (53 isolates from carcass, meat, viscera and environmental swab) and one from swine. We also analyzed 29 strains from food and 14 from humans involved in salmonellosis outbreaks in Rio Grande do Sul, one reference strain (ATCC 13076) and 9 strains isolated from African and European countries. Resistance rates found in poultry-related strains were significantly higher than that observed in strains isolated from humans. Since identical PFGE profiles were identified in antimicrobial resistant and susceptible strains, it was not possible to find relationship between the PFGE genotypes and the antimicrobial resistance patterns found. However, both approaches were able to improve S. Enteritidis characterization. On the other hand, SE-AFLP clustered most of the S. Enteritidis strains in a major pattern. In a comparison between based-PCR approaches, SE-AFLP showed a higher discriminatory power, although it was lower than that displayed by antimicrobial resistance and phage type patterns. Thus, SE-AFLP might be used associated to other approaches for S. Enteritidis characterization. In contrast, 13 different antimicrobial resistance patterns, 12 PFGE genotypes and 3 SE-AFLP genotypes were identified in the S. Enteritidis strains. Genotypic approaches showed that the strains isolated from poultry, poultry-related products, food and humans involved in salmonelosis outbreaks shared a major pattern. These results suggest that the strains have a close relationship and the association of the different approaches improved S. Enteritidis characterization.