Les ECFC (endothelial colony forming cells) sont considérées comme des cellules endothéliales dérivées des progéniteurs endothéliaux circulants in vitro. Les capacités angiogéniques de ces cellules leur confère un intérêt thérapeutique pour traiter les lésions ischémiques résultant des pathologies cardio-vasculaires. Les ECFC isolées à partir de sang périphérique adulte (ECFC-SPA) sont moins fonctionnelles et perdent leur capacité à former des vaisseaux sanguins persistants contrairement aux ECFC de sang de cordon ombilical (ECFC-SC). Une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans cette dysfonction est requise pour comprendre et prévenir l’altération des ECFC-SPA au cours du vieillissement en vue d’une stratégie autologue. De même, l’utilisation des ECFC-SC en thérapie cellulaire hétérologue est conditionnée par une caractérisation fonctionnelle plus poussée de cette source de cellules angiogéniques.Ce travail de thèse a permis d’établir un profil précis du rendement en ECFC du SPA et du SC. Aucune corrélation avec l’âge du donneur n’a été mise en évidence. Les ECFC-SC sont particulièrement hétérogènes, générant de 0 à plus de 100 colonies. Les échantillons générant moins de 10 colonies présentent une altération fonctionnelle similaire aux ECFC-SPA, associée à une perte de leur caractère immature. Les ECFC-SC les plus clonogéniques sont également les plus angiogéniques. La clonogénicité primaire des ECFC apparait donc comme le marqueur le plus précoce accessible au cours de leur culture permettant de prédire leur future fonctionnalité. Ce pourrait être un critère pertinent pour hiérarchiser et sélectionner les ECFC-SC les plus efficaces en thérapie cellulaire. / ECFCs (endothelial colony forming cells) are derived from endothelial progenitor cells in vitro. Angiogenic capacity of these cells confers a therapeutic benefit for treating ischemic injuries resulting from cardiovascular pathologies. ECFC isolated from peripheral blood adult (AB-ECFC) are less functional and lose their ability to form long lasting blood vessels in contrast to umbilical cord blood ECFC (CB-ECFC). A better understanding of mechanisms involved in this dysfunction is required to understand and prevent alteration of AB-ECFC during aging for autologous strategy. Similarly, the use of CB-ECFC in heterologous cell therapy is conditioned by further functional characterization of this source of angiogenic cells.This thesis has established a specific profile of ECFC yield from adult and cord blood. No correlation with donor age has been demonstrated. The CB-ECFC are particularly heterogeneous, generating from 0 to more than 100 colonies. Samples generating less than 10 colonies have a similar dysfunction than AB-ECFC, associated with loss of their immature features. The most clonogenic CB-ECFC are also the most angiogenic. The initial clonogenicity of ECFC therefore appears to be the earliest marker available during their culture to predict their future functionality. It could be a relevant criterion for classifying and selecting the most effective CB-ECFC cell therapy.

Dans l’optique de produire de maîtriser les conditions d’expansion ex vivo de greffons hématopoïétiques produits à partir de sang périphérique en homéostasie, l’objectif de ce projet a été de caractériser fonctionnellement, métaboliquement et transcriptomiquement les cellules souches hématopoïétiques (CSH). Compte tenu de l’impossibilité technique de sélectionner spécifiquement les CSH humaines, nous avons utilisé un modèle cellulaire enrichi en CSH, le modèle Side Population(SP). Dans un premier temps, nos travaux ont confirmé que les CSH du sang périphérique étaient majoritairement dans la population SP et qu’elles possédaient des caractéristiques fonctionnelles proches des CSH des autres compartiments hématopoïétiques. Nous avons également démontré l’implication des basses concentrations d’O2 sur le maintien des CSH du sang périphérique. Dans un second temps, nos résultats ont prouvé que les CSH du sang périphérique utilisaient à la fois la glycolyse et la phosphorylation oxydative pour produire l’énergie nécessaire à leur maintien. Enfin, ce projet a permis d’apporter des résultats préliminaires concernant les régulations transcriptomiques des CSH du sang périphérique. Ces données montrent donc que le sang périphérique en homéostasie pourrait constituer une source potentielle de cellules pour la production de greffons hématopoïétiques tout en apportant les premiers éléments de compréhension de la physiologie de ces cellules, afin, dans un plus long terme de maîtriser leur maintien ou leur différenciation ex vivo. / To evaluate the possibility to control ex vivo expansion conditions, a key point to produce hematopoietic graft from steady state peripheral blood (SSPB), the objective of this project to characterize the functional properties, the metabolism and the transcriptomic regulations of hematopoietic stem cell (HSC) from SSPB. Due to the lack of strong HSC’s marker in human, we choose to use the Side Population (SP) model, previously described as enriched in HSC in other hematopoietic compartments. In a first part of our work, we showed that HSC from SSPB are mainly inside the SP population. Indeed, SP cells from SSPB exhibit functional properties very closed from HSC. In addition, we found they strongly affected by low O2 concentrations, as HSC from bone marrow. In a second part, our results showed that HSC from SSPB use as much glycolysis as oxidative phosphorylation to produce energy they need to maintain their properties. All together, these data give some interesting information about HSC regulation and needs. They also suggest that HSC from SSPB could be considering as a potential source of hematopoietic graft for therapy.

L’arthrite juvénile idiopathique (AJI) est un groupe hétérogène de rhumatismes inflammatoires chroniques affectant les enfants de moins de 16 ans. Cette atteinte inflammatoire d’origine inconnue est caractérisée par une arthrite persistant plus de 6 semaines en l’absence de traitements.Afin de mettre en évidence des mécanismes impliqués dans la physiopathologie de l’AJI, une inclusion de patients atteints d’une autre forme d’arthrite juvénile, à savoir l’arthrite septique, a été effectuée. En parallèle, des études comparatives entre le sang périphérique (SP) et le liquide synovial (LS) des patients atteints d’AJI ont été réalisées afin de rechercher des mécanismes spécifiques aux perturbations articulaires. Un intérêt particulier a été porté sur les sous-populations de monocytes et de cellules dendritiques (DCs) ainsi que les profils d’expression des microARNs (miARNs) dans le sang périphérique et le LS des patients. Ces différents marqueurs biologiques ont été choisis car ils jouent un rôle majeur à la fois dans la régulation de l’inflammation et la pathogénèse des maladies inflammatoires.L’analyse de l’expression des miARNs par une approche de séquençage à haut débit suivie d’une validation par RT-qPCR a mis en évidence des miARNs dérégulés de façon spécifique dans l’AJI par rapport à l’AS. De plus, la caractérisation phénotypique des sous-populations de cellyles myéloïdes a montré une accumulation et une activation cellulaire propre à l’AJI. Dans l’ensemble, ce projet m’a permis d’identifier différents acteurs cellulaires et moléculaires pouvant être impliqués dans la physiopathologie de l’AJI. / Juvenile idiopathic arthritis (JIA) is a heterogeneous group of chronic inflammatory rheumatism affecting children under 16 years of age. This inflammatory disorder of unknown origin is characterized by arthritis lasting more than 6 weeks in the absence of treatments.In order to highlight mechanisms involved in the pathophysiology of JIA, an inclusion of patients suffering from septic arthritis, another form of juvenile arthritis, was performed. In parallel, comparative studies between the peripheral blood (PB) and the synovial fluid (SF) of patients with JIA were carried out in order to search for mechanisms specific of joint disturbances.We focused on monocytes and dendritic cells (DCs) subsets as well as the expression patterns of microRNAs (miRNAs) in the PB and SF of patients. These different biological markers are known to play a major role both in the regulation of inflammation and the pathogenesis of inflammatory diseases.Analysis of miRNA expression by a high-throughput sequencing approach followed by RT-qPCR validation revealed specifically deregulated miRNAs in JIA compared to AS. In addition, the phenotypic characterization of myeloid cell subpopulations showed an accumulation and activation profile specific of JIA cells. Overall, this project allowed me to identify different cellular and molecular actors that might be involved in the pathophysiology of JIA.

L’âge et le sexe biologique influencent plusieurs attributs du système immunitaire humain, tels la capacité à monter des réponses efficaces suite à la vaccination ou à une infection et le risque de développer une maladie auto-immune. Les interleukines sont des messagers moléculaires importants dans la coordination des réponses immunes et leur perception par les diverses populations de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) dépend entre autres de la distribution de leurs récepteurs respectifs sur celles-ci. Nous montrons ici par cytométrie en flux réalisée sur des PBMC fraîchement isolées de sang périphérique d’adultes en santé que l’âge et le sexe sont des facteurs agissant sur la répartition des récepteurs aux interleukines 6, 11 et 27 de la famille IL-6. Les comparaisons statistiques réalisées entre quatre groupes constitués de 10 participants par sexe et par groupe d’âge (20 à 30 ans et 40 à 65 ans) indiquent plusieurs variations. Des différences ont été observées pour la présence de ces récepteurs en termes de proportion de cellules et de densité de molécules exprimées par cellule. Par exemple, les pourcentages de cellules immunes des jeunes hommes arborant la chaine IL-6 récepteur alpha étaient plus modestes pour plusieurs populations immunes en comparaison aux autres groupes. Toutefois, les proportions de cellules immunes des femmes plus âgées exprimant la chaine du récepteur IL-11 alpha étaient plus importantes en comparaison aux autres groupes. Le savoir généré par la présente étude ajoute à la connaissance grandissante de la régulation immunitaire chez l’humain par les interleukines en fonction de l’âge et du sexe en fournissant des données extensives y compris pour des cytokines (e.g. IL-11) qui ont été moins étudiées jusqu’à maintenant. Ces constats sont pertinents dans le cadre de l'étude de l'immunobiologie, par exemple en permettant de discuter du rôle de cytokines comme l'IL-6 dans l'état inflammatoire des individus ayant la capacité d'influencer entre autres la trajectoire d'un vieillissement sain. / Age and biological sex shape numerous properties of the human immune system, such as the capacity to generate an efficient response to a vaccine or an infection and the risk of developing an autoimmune disease. Interleukins are molecular messengers of importance in the coordination of immune responses and their perception by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) depends on the distribution of their respective receptors. We show here, using flow cytometry on freshly isolated PBMC from the peripheral blood of healthy adults, that age and sex impact the distribution of the receptors of interleukins 6, 11, and 27 from the IL-6 family. Statistical comparisons executed on four groups consisting of 10 participants per sex and age group (20 to 30 years old and 40 to 65 years old) indicate that these receptors vary in expression in terms of immune cell types and density per cell. For example, the percentages of immune cells in young men displaying the IL-6 receptor alpha chain were more modest for several immune populations compared with the other groups. However, the proportions of immune cells in older women expressing the IL-11 receptor alpha chain were greater compared with the other groups. The knowledge generated in this study will add to the increasing understanding of the immune regulation mediated by interleukins in humans according to age and sex by providing extensive data, especially for cytokines (e.g. IL-11) that have been less studied so far. These findings are of importance in the area of immunobiology, by eliciting discussion about the role of cytokines such as IL-6 in the inflammatory state of an individual, which is susceptible to impact healthy ageing.

La leucémie aigüe lymphoblastique de précurseurs des cellules B (pré-B LAL) est le cancer le plus fréquent chez l’enfant. La transplantation de cellules souches hématopoïétiques (TCSH) est nécessaire dans environ 20 à 30 % des enfants ayant une pré-B LAL. Les rechutes après TCSH sont habituellement réfractaires aux thérapies actuelles, et par conséquent, il est important de développer et d’optimiser de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux cellules « cytokine-induced killer » (CIK). En effet, ces cellules ont été montrées comme hautement cytotoxique contre beaucoup de types de cancers. Cependant, leur activité cytotoxique contre les pré-B LAL n’est pas vraiment efficace. Par conséquent, nous avons étudié la possibilité de combiner l’immunothérapie des cellules CIK avec l’interféron alpha (IFN-α) afin d’optimiser l’activité lytique de ces cellules contre les cellules pré-B LAL. De plus, vu qu’il a été démontré que l’activité cytotoxique des cellules CIK provient de la fraction CD56+, plus particulièrement les cellules CD3+CD56+, nous avons décidé d’utiliser la fraction CD56+ (cellules CD56+) dans l’ensemble de nos expériences. Nous avons observé in vitro que les cellules CD56+ lysent mieux les lignées cellulaires pré-B LAL comparativement aux cellules CIK non purifiées. Aussi, leur activité cytotoxique peut être augmentée par le traitement avec l’IFN-α. Par ailleurs, nous avons démontré l’efficacité des cellules CD56+ traitées par l’IFN-α contre les lignées cellulaires pré- B LAL in vivo, dans le modèle de souris NOD/SCID/gamma c- (NSG). La survie des souris est significativement prolongée lorsqu’elles reçoivent les cellules pré-B LAL avec les cellules CD56+ traitées par l’IFN-α. Nous avons par la suite étudié le mécanisme d’action des cellules CD56+ contre les lignées cellulaires pré-B LAL. Nous avons observé que les cellules CD56+ provenant de sang de cordon sont plus efficaces que les cellules CD56+ provenant de sang I périphérique pour tuer les lignées cellulaires pré-B LAL. Nous avons également montré que les cellules CD56+ utilisent seulement la voie NKG2D ou bien les voies NKG2D et TRAIL selon la lignée cellulaire pré-B LAL cible et selon la provenance de la source des cellules CD56+. Par ailleurs, nous avons remarqué que les cellules CIK sont sensibles à l’apoptose par Fas, et que cette sensibilité influence leur activité cytotoxique contre les cellules tumorales. En conclusion, les cellules CD56+ sont cytotoxiques contre les lignées cellulaires pré-B LAL, et leur effet lytique est augmenté par l’IFN-α aussi bien in vitro qu’in vivo dans le modèle de souris NSG. Ces données précliniques sont encourageantes pour tester cette nouvelle approche d’immunothérapie dans le traitement contre la pré-B LAL. / Precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is the most common form of leukemia in children. Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is required in around 20 to 30% of children with a B-ALL. The relapses occuring post-HSCT are usually insensitive to current therapy. Therefore, it is important to develop and optimize a new therapeutic strategy. In this study, we were interested to study « cytokine-induced killer » (CIK) cells. These cells have been shown to be very cytotoxic against many types of tumor. However, their cytotoxic activity against B-ALL cells is not very efficient. Consequently, we have studied the effect of combining adoptive immunotherapy of CIK cells with the interferon alpha (IFN-α) to increase their lytic activity against B-ALL cells. In addition, in the literature, the cytotoxic activity of CIK cells has been shown to come from the CD56+ fraction (CD56+ CIK), in particular CD3+CD56+ cells. Therefore, we used the CD56+ fraction in all the experiments. We have observed in vitro that CD56+ CIK cells killed more efficiently B-ALL cell lines than did non-purified CIK cells. Also, their cytotoxic activity could be enhanced with IFN-α. Moreover, we have demonstrated the efficacy of IFN-α-treated-CD56+ CIK cells against B-ALL cell lines in vivo in the model of NOD/SCID/gamma c- (NSG) mice by showing that the survival of mice injected with B-ALL cell lines was significantly increased when they were injected with IFN-α-treated-CD56+ CIK cells. Subsequently, we have studied the lytic mechanism of CD56+ CIK cells against B-ALL cell lines. We have observed that CD56+ CIK cells from cord blood were more efficient than CD56+ CIK cells from peripheral blood to kill B-ALL cell lines. CD56+ CIK cells used only the NKG2D pathway or the both NKG2D and TRAIL pathways depending on the B-ALL cell line and the source of CIK cells. In addition, we showed that CIK cells were sensitive to Fas apoptosis. This sensitivity III influenced the cytotoxic activity of CIK cells against tumor cells. In conclusion, CD56+ CIK cells are cytotoxic against B-ALL cell lines, and their effect can be increased with IFN-α in vitro and in vivo. Taken together, our pre-clinical data are very interesting for testing the potential clinical utility of purified CD56+ CIK cells as an immunotherapeutic strategy for B- ALL patients.