Durante o desenvolvimento deste projeto adotou-se como estratégia o sequenciamento de ESTs, com a finalidade de encontrar mensagens relacionadas com desenvolvimento, metabolismo e principalmente amplificação/politenização em glândulas salivares de Rhynchosciara americana, um díptero (Sciarídeo) que apresenta cromossomos politênicos e amplificação gênica rigidamente regulada ao longo do desenvolvimento larval, tanto neste tecido quanto em outros. Um total de 8193 ESTs foi gerado, estas foram anotadas e categorizadas segundo os termos do Gene Ontology Consortium, proporcionando uma visão geral do status metabólico, como em um Northern eletrônico, de um ponto importante no desenvolvimento desta espécie, quando surgem amplificações gênicas específicas e a glândula salivar necessita secretar as proteínas do casulo. Outros frutos deste seqüenciamento foram a determinação de 91 polimorfismos e a criação de uma tabela de códon usage. Diversos ESTs foram identificados com potencial envolvimento com os endociclos observados neste tecido, destes, RaDup e RaMCM5 foram selecionados para estudo. Suas regiões genômicas foram isoladas e suas localizações cromossômicas foram identificadas, em relação a RaDup, toda a porção codificante de seu mensageiro e 12kb de DNA genômico contendo seu gene foram seqüenciados, revelando sua estrutura gênica. Anticorpos foram produzidos para detectar esta proteína, gerando evidências de sua participação tanto na replicação mitótica como nos endociclos presentes nas glândulas salivares. A localização cromossômica de RaDup é um dado muito interessante, pois pela primeira vez um pufe amplificado é relacionado com um gene regulatório. / In this work EST sequencing was used as strategy to find messages related to development, metabolism and polyteny/amplification in salivary glands of Rhynchosciara americana, a dipteran (Sciaridae) that shows in this tissue giant polytene chromosomes and gene amplification tightly regulated throughout development of the larvae. A total of 8193 EST sequences were generated, annotated and categorized using Gene Ontology Consortium terms, providing a general view of the metabolic status, like an electronic Northern, of an important point in development of the larvae, that shows where specific genes are amplified and the salivary gland needs to secrete the proteins to form the cocoon. Other data include determination of 91 SNPs and a statistic of codon usage. Several ESTs were identified with potential connection to endocicles, from these RaDup and RaMCM5 were selected for further studies. Both chromosomal loci were identified and genomic regions isolated, for RaDup the coding region of its mRNA and 12kb of genomic region were completely sequenced, revealing its gene structure, and antibodies were raised against this protein, making evident data about its involvement in replication in mitotic cells and in endocicles in salivary glands. About the chromosomal locus of RaDup, it becomes very interesting, because for the first time one amplified puff can be related to a regulatory gene.

Nosso laboratório investiga os mecanismos moleculares que promovem o estabelecimento de padrões de expressão gênica regulados no desenvolvimento em eucariotos superiores. Como modelo, utilizamos o gene de pufe de DNA BhC4-1, que é amplificado e expresso de modo regulado na glândula salivar e na glândula protorácica no final do quarto estadio larval de B. hygida. Estudos funcionais em D. melanogaster resultaram na identificação de módulos cis-reguladores (MCRs) na região promotora do gene BhC4-1. O MCR de glândula anelar de 67 bp (-253/-187), promove a expressão de BhC4-1-lacZ na glândula anelar a partir do final do desenvolvimento embrionário. O MCR de glândula salivar de 129 bp (-186/-58), dirige a expressão do transgene nas glândulas salivares de prépupas. A glândula anelar é o principal órgão endócrino larval e em D. melanogaster é o resultado da fusão das glândulas protorácicas (responsáveis pela síntese de hormônios esteroides), corpus allatum (síntese de hormônio juvenil) e corpus cardiacum (glândula neuroendócrina). Neste trabalho foram obtidas 12 linhagens independentes transformadas com uma construção que contém o fragmento (-253/+40) do promotor do gene de pufe de DNA BhC4-1 clonado à montante do gene repórter GFP. O genótipo destas linhagens foi validado utilizando-se Southern blots. Inicialmente as 12 linhagens obtidas foram analisadas quanto ao padrão de expressão de GFP em larvas de terceiro estadio e em prépupas 2 horas. Em conjunto, esta análise revelou que o padrão de expressão de GFP é bastante variável nestas linhagens. A análise do padrão de expressão da proteína repórter foi estendida em duas linhagens representativas da série (- 253/+40)/GFP. Nestas linhagens a expressão de GFP é inicialmente detectada na glândula salivar durante o estágio de prépupa e na glândula anelar a partir do terceiro estadio larval. Diferentemente do anteriormente observado em linhagens (-253/+40)/lacZ, nestas linhagens não detectamos a expressão de GFP em tempos do desenvolvimento anteriores ao terceiro estadio larval. Experimentos de interação gênica revelaram que na ausência do fator de transcrição br, a expressão de GFP é mantida na glândula anelar e abolida na glândula salivar de larvas de terceiro estadio. Os resultados dos experimentos de interação gênica corroboram dados anteriores que indicavam que o conjunto de fatores de transcrição que regulam a expressão de BhC4-1-lacZ na glândula anelar é distinto daquele que promove a expressão do gene na glândula salivar. As linhagens obtidas neste trabalho constituem uma ferramenta a ser utilizada na caracterização de fatores de transcrição tecido-específicos que regulam o gene BhC4-1 na glândula anelar e/ou na glândula salivar a partir do final do desenvolvimento larval. / Our laboratory investigates the molecular mechanisms that promote the establishment of developmentally regulated gene expression patterns in metazoans. As a model, we employ the BhC4-1 DNA puff gene, which is amplified and expressed in a regulated manner in the salivary gland and in the prothoracic gland at the end of the fourth larval instar in B. hygida. Functional studies in D. melanogaster resulted in the identification of cis-regulatory modules (CRMs) in the BhC4-1 promoter region. The 67 bp (-253/-187) ring gland CRM drives BhC4-1-lacZ expression in the ring gland from late embryonic development. The 129 bp (-186/-58) CRM salivary gland drives transgene expression in the prepupal salivary glands. The ring gland is the major endocrine organ, and comprises the prothoracic glands (synthesis of ecdysteroid hormones), corpus allatum (synthesis of juvenile hormone) and corpus cardiacum (neuroendocrine gland). In this work, 12 independent lines transformed with a construct containing the BhC4-1 promoter fragment (- 253/+40) cloned upstream of the reporter gene GFP were obtained. The genotype of each line was validated using Southern blots. Initially, the 12 obtained lines were analyzed to investigate the pattern of GFP expression in the third instar larvae and in the 2 hours prepupae. This initial screening revealed that the pattern of GFP expression is highly variable in these lines. The developmental pattern of GFP expression was extended in two representative (- 253/+40)/GFP lines. In these lines, GFP expression is initially detected in the larval and prepupal salivary glands and in ring gland third instar. Differently from previously observed in (-253/+40)/lacZ lines, in these lines we did not detect GFP expression at developmental times prior to the third larval instar. Gene interaction experiments revealed that in the absence of the br transcription factor, GFP expression is maintained in the ring gland and abolished in the salivary gland of third instar larvae. The results of gene interaction experiments corroborate previous data indicating the set of transcription factors that regulate BhC4-1-lacZ expression in the ring gland is distinct from that which promotes gene expression in salivary glands. The lines obtained in this work constitute a tool to characterize the tissue-specific transcription factors that regulate BhC4-1 gene in the ring gland and/or in the salivary gland from the end of the larval development.

Nosso laboratório investiga os mecanismos moleculares que promovem o estabelecimento de padrões de expressão gênica regulados no desenvolvimento em eucariotos superiores. Como modelo, utilizamos o gene de pufe de DNA BhC4-1, que é amplificado e expresso de modo regulado na glândula salivar e na glândula protorácica no final do quarto estadio larval de B. hygida. Estudos funcionais em D. melanogaster resultaram na identificação de módulos cis-reguladores (MCRs) na região promotora do gene BhC4-1. O MCR de glândula anelar de 67 bp (-253/-187), promove a expressão de BhC4-1-lacZ na glândula anelar a partir do final do desenvolvimento embrionário. O MCR de glândula salivar de 129 bp (-186/-58), dirige a expressão do transgene nas glândulas salivares de prépupas. A glândula anelar é o principal órgão endócrino larval e em D. melanogaster é o resultado da fusão das glândulas protorácicas (responsáveis pela síntese de hormônios esteroides), corpus allatum (síntese de hormônio juvenil) e corpus cardiacum (glândula neuroendócrina). Neste trabalho foram obtidas 12 linhagens independentes transformadas com uma construção que contém o fragmento (-253/+40) do promotor do gene de pufe de DNA BhC4-1 clonado à montante do gene repórter GFP. O genótipo destas linhagens foi validado utilizando-se Southern blots. Inicialmente as 12 linhagens obtidas foram analisadas quanto ao padrão de expressão de GFP em larvas de terceiro estadio e em prépupas 2 horas. Em conjunto, esta análise revelou que o padrão de expressão de GFP é bastante variável nestas linhagens. A análise do padrão de expressão da proteína repórter foi estendida em duas linhagens representativas da série (- 253/+40)/GFP. Nestas linhagens a expressão de GFP é inicialmente detectada na glândula salivar durante o estágio de prépupa e na glândula anelar a partir do terceiro estadio larval. Diferentemente do anteriormente observado em linhagens (-253/+40)/lacZ, nestas linhagens não detectamos a expressão de GFP em tempos do desenvolvimento anteriores ao terceiro estadio larval. Experimentos de interação gênica revelaram que na ausência do fator de transcrição br, a expressão de GFP é mantida na glândula anelar e abolida na glândula salivar de larvas de terceiro estadio. Os resultados dos experimentos de interação gênica corroboram dados anteriores que indicavam que o conjunto de fatores de transcrição que regulam a expressão de BhC4-1-lacZ na glândula anelar é distinto daquele que promove a expressão do gene na glândula salivar. As linhagens obtidas neste trabalho constituem uma ferramenta a ser utilizada na caracterização de fatores de transcrição tecido-específicos que regulam o gene BhC4-1 na glândula anelar e/ou na glândula salivar a partir do final do desenvolvimento larval. / Our laboratory investigates the molecular mechanisms that promote the establishment of developmentally regulated gene expression patterns in metazoans. As a model, we employ the BhC4-1 DNA puff gene, which is amplified and expressed in a regulated manner in the salivary gland and in the prothoracic gland at the end of the fourth larval instar in B. hygida. Functional studies in D. melanogaster resulted in the identification of cis-regulatory modules (CRMs) in the BhC4-1 promoter region. The 67 bp (-253/-187) ring gland CRM drives BhC4-1-lacZ expression in the ring gland from late embryonic development. The 129 bp (-186/-58) CRM salivary gland drives transgene expression in the prepupal salivary glands. The ring gland is the major endocrine organ, and comprises the prothoracic glands (synthesis of ecdysteroid hormones), corpus allatum (synthesis of juvenile hormone) and corpus cardiacum (neuroendocrine gland). In this work, 12 independent lines transformed with a construct containing the BhC4-1 promoter fragment (- 253/+40) cloned upstream of the reporter gene GFP were obtained. The genotype of each line was validated using Southern blots. Initially, the 12 obtained lines were analyzed to investigate the pattern of GFP expression in the third instar larvae and in the 2 hours prepupae. This initial screening revealed that the pattern of GFP expression is highly variable in these lines. The developmental pattern of GFP expression was extended in two representative (- 253/+40)/GFP lines. In these lines, GFP expression is initially detected in the larval and prepupal salivary glands and in ring gland third instar. Differently from previously observed in (-253/+40)/lacZ lines, in these lines we did not detect GFP expression at developmental times prior to the third larval instar. Gene interaction experiments revealed that in the absence of the br transcription factor, GFP expression is maintained in the ring gland and abolished in the salivary gland of third instar larvae. The results of gene interaction experiments corroborate previous data indicating the set of transcription factors that regulate BhC4-1-lacZ expression in the ring gland is distinct from that which promotes gene expression in salivary glands. The lines obtained in this work constitute a tool to characterize the tissue-specific transcription factors that regulate BhC4-1 gene in the ring gland and/or in the salivary gland from the end of the larval development.

Durante o desenvolvimento deste projeto adotou-se como estratégia o sequenciamento de ESTs, com a finalidade de encontrar mensagens relacionadas com desenvolvimento, metabolismo e principalmente amplificação/politenização em glândulas salivares de Rhynchosciara americana, um díptero (Sciarídeo) que apresenta cromossomos politênicos e amplificação gênica rigidamente regulada ao longo do desenvolvimento larval, tanto neste tecido quanto em outros. Um total de 8193 ESTs foi gerado, estas foram anotadas e categorizadas segundo os termos do Gene Ontology Consortium, proporcionando uma visão geral do status metabólico, como em um Northern eletrônico, de um ponto importante no desenvolvimento desta espécie, quando surgem amplificações gênicas específicas e a glândula salivar necessita secretar as proteínas do casulo. Outros frutos deste seqüenciamento foram a determinação de 91 polimorfismos e a criação de uma tabela de códon usage. Diversos ESTs foram identificados com potencial envolvimento com os endociclos observados neste tecido, destes, RaDup e RaMCM5 foram selecionados para estudo. Suas regiões genômicas foram isoladas e suas localizações cromossômicas foram identificadas, em relação a RaDup, toda a porção codificante de seu mensageiro e 12kb de DNA genômico contendo seu gene foram seqüenciados, revelando sua estrutura gênica. Anticorpos foram produzidos para detectar esta proteína, gerando evidências de sua participação tanto na replicação mitótica como nos endociclos presentes nas glândulas salivares. A localização cromossômica de RaDup é um dado muito interessante, pois pela primeira vez um pufe amplificado é relacionado com um gene regulatório. / In this work EST sequencing was used as strategy to find messages related to development, metabolism and polyteny/amplification in salivary glands of Rhynchosciara americana, a dipteran (Sciaridae) that shows in this tissue giant polytene chromosomes and gene amplification tightly regulated throughout development of the larvae. A total of 8193 EST sequences were generated, annotated and categorized using Gene Ontology Consortium terms, providing a general view of the metabolic status, like an electronic Northern, of an important point in development of the larvae, that shows where specific genes are amplified and the salivary gland needs to secrete the proteins to form the cocoon. Other data include determination of 91 SNPs and a statistic of codon usage. Several ESTs were identified with potential connection to endocicles, from these RaDup and RaMCM5 were selected for further studies. Both chromosomal loci were identified and genomic regions isolated, for RaDup the coding region of its mRNA and 12kb of genomic region were completely sequenced, revealing its gene structure, and antibodies were raised against this protein, making evident data about its involvement in replication in mitotic cells and in endocicles in salivary glands. About the chromosomal locus of RaDup, it becomes very interesting, because for the first time one amplified puff can be related to a regulatory gene.